Summary
该协议的目的是描述一个经过修改的平行板流室,用于研究通过剪切应力实时激活美能敏感子孔通道。
Abstract
众所周知,流体剪切应力在内皮功能中起着重要作用。在大多数血管病床上,血流急剧增加引起的剪切应力升高会触发信号级联,导致血管扩张,从而减轻血管壁上的机械应力。众所周知,剪切应力模式也是动脉粥样硬化发展的关键因素,而层状剪切应力是具有英雄保护作用的,而受干扰的剪切应力是亲动脉粥样硬化的。虽然我们对各种中间细胞信号通路有详细的了解,但首先将机械刺激转化为化学中介的受体并不完全了解。干扰性电子通道对剪切的响应至关重要,并调节剪切诱导的细胞信号,从而控制血管活性介质的产生。这些通道是最早激活的剪切信号成分之一,通过促进一氧化氮生产(例如,向内矫正 K+ [Kir] 和瞬态受体电位 [TRP],与剪切引起的血管化相关通道)和内皮超极化因子(例如,基尔和钙激活K +[KCa]通道)和剪切引起的血管收缩,通过一个未确定的机制,涉及压电通道。了解这些通道被剪切力(即直接或通过初级机械受体)激活的生物物理机制,可以为解决与内皮功能障碍相关的病理生理学提供潜在的新靶点和英雄发生。利用电生理学实时记录流动引起的电通道活化仍然是一大挑战。将细胞暴露在定义良好的剪切应力下的标准方法,如锥体和板流变仪和闭合平行板流室,不允许实时研究电子通道激活。该协议的目的是描述一个经过修改的平行板流室,它允许在定义明确的剪切应力下实时电生理记录机械敏感电道。
Introduction
众所周知,血流产生的血动力在内皮和血管功能1、2中起着主要作用。众所周知,几种类型的子通道对剪切应力3、4、5的变化有剧烈反应,导致理论认为,子通道可以是初级剪切应力传感器。最近,我们和其他人表明,对剪切应力的血管敏感通道在若干剪切应力敏感血管功能中起着关键作用,包括对剪切应力6、7、8的血管活性反应,发育性血管生成9。然而,离音通道的剪切应力灵敏度机制几乎完全未知。这种知识差距可能是由于在明确定义的剪切应力下进行电生理记录的技术困难。因此,在本文中,我们提供了一个逐步的详细协议,在我们的实验室中例行执行,以实现这个目标6,7,10,11。
该方法的总体目标是允许在生理范围内明确定义的剪切应力下对电导道机活化进行实时调查。这是通过修改标准平行板流室来实现的,使电生理移液器能够降入腔室,并在实时接触流量时进入底部板上生长的细胞,从而提供了独特的方法来实现这一点进球6,7,11 。相比之下,在以前的出版物中描述的标准平行板流室可用于对暴露于剪切力12或其他非侵入性方法的细胞进行实时成像分析,但不适用于电 生理。同样,锥体和板装置,另一种强大的方法,使细胞暴露在剪切应力15,16也不适合电生理记录。因此,这些流动装置不允许研究光通道的剪切应力敏感性。在流下进行电生理记录的困难是缺乏关于这些关键影响的机制的信息的主要原因。
就实现同一目标的替代方法而言,没有一种方法准确或控制。一些早期的研究试图通过将细胞暴露在来自另一个移液器的液体流中来记录流中的离子电池通道活动,这些液体从17、18号进入细胞附近。这是高度非生理的,因为在这些条件下产生的机械力与血管中剪切应激的生理特征几乎没有共同之处。类似的关注也适用于通过灌注开放腔来模拟生理剪切应力的尝试。正如我们早期研究10中详细讨论的,一个开放的液体-空气界面会产生多重干扰和再循环,这是非生理的。为了解决所有这些问题,我们设计了一个经过改进的平行板(MPP)流动室,在早先的研究中,我们也被称为"微创流量装置",在6、7、10、11中,我们制造了从丙烯酸和广泛使用在我们的实验室。然而,尽管设计的原始描述已经发表近20年,并且是唯一允许在定义明确的剪切应力下进行电生理记录的流装置,但这种方法并没有其他实验室采用,只有极少数研究试图记录流下的电流。因此,我们相信,提供使用MPP流动室的详细描述,将非常有助于研究那些对美能敏感性水道和血管生物学感兴趣的人。
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Protocol
伊利诺伊大学芝加哥动物护理委员会(#16-183)批准了动物在我们的研究中的使用。
1. 改进平行板流室的装配
注:有关 MPP 流室件件的 D,请参阅表 1和图1。请参阅图1,详细说明装配室件的方向。
- 要将矩形盖玻璃 D 粘附到 C 件的底部,首先通过将 500 μL 硅胶弹性体固化剂彻底混合成 5 mL 的硅弹性体底座,使硅胶弹性体溶液。
- 在 C 件的矩形空间边缘周围涂抹一层薄薄的硅弹性体溶液,然后轻轻地将矩形盖玻璃片 D 直接放在弹性体溶液上,使 D 块完全覆盖 C 件的开放式矩形空间。小心地擦去多余的硅胶弹性体溶液。
- 重复步骤 1.2,将矩形盖玻璃 F 粘附在 E 件的底部,并允许硅胶弹性体溶液在室温下在夜间固化。
注:固化后,矩形盖玻璃将保持粘附长达六个月,然后需要更换。 - 从底部造型室件 E 开始,按照以下顺序将每块按顺序放置在前一块顶部,以 E 件(底部)、C 件、B 件、A 件(顶部)顺序组装 MPP 流室。
- 将每个件的螺钉孔对齐到拐角处,将螺钉拧紧在一起,以防止在流向 MPP 流室时发生泄漏。
2. 细胞制备和种子进入MPP流动室
注:按照步骤2.1_2.7进行培养内皮细胞。按照步骤 2.8_2.14 中详细的方法,将内皮细胞从小鼠肠子动脉拱廊中分离出来,并制备新分离的内皮细胞。
- 在 6 孔板中,放置 4 到 5 个 12 mm 盖玻璃圈/孔和种子细胞在 10% 到 30% 的汇合率之间,以便单个细胞可以进行电生理记录。
- 在标准培养条件下(5%CO 2,37 °C)孵育细胞不少于2小时,使细胞粘附,且不超过24小时,因为作者经验中的内皮细胞在分汇播种超过24次时变得非常平坦和难以修补H。
- 从6孔板的孔中取出含有粘附细胞的盖玻璃,在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中快速冲洗,并转移到含有2 mL电生理浴液的35毫米培养皿(表2),然后转移到MPP流量室。
- 将盖玻璃圈转移到矩形盖玻璃 D 片上,该玻璃粘附在 MPP 流动室的 C 件上,确保覆盖玻璃上留有适当的溶液,使电池不会暴露在空气中。将所需的沐浴溶液(±250 μL)添加到细胞中,使盖玻璃圈和细胞完全浸入溶液中。
- 将盖玻璃圈放置在最接近真空储液罐侧的一半,使电池与 B 件的狭缝开口一致。流向造型室不会中断盖玻璃圈的位置。
- 如步骤 1.4 和 1.5 中所述,将件按适当的顺序拧在一起,从而组装 MPP 流室,如图 1所示。将腔室转移到显微镜阶段,并立即向腔室注入沐浴溶液,使溶液到达真空储液罐中,用于吸入(±10 mL)。
- 通过识别具有深色边界和明显细胞核的细胞,确定实验的健康细胞。避免出现可哭的细胞或与其他细胞接触的细胞。
注:在作者的实验室中,使用人类主动脉内皮细胞和培养中的原小鼠内皮细胞。然而,任何其他类型的粘附细胞,是感兴趣的特定研究需要可以以同样的方式使用。 - 在解散溶液中清洗孤立的动脉拱廊(表2)。将街机转移到含有2 mL的预加热(37°C)解离溶液(表2所示的解离溶液配方)的2 mL离心管中,含有中性蛋白酶(0.5 mg/mL)和乳酸酶(0.5毫克/mL)。在37°C下孵育1小时,每10分钟轻轻摇动一次。
- 去除1 mL的中性蛋白酶/镇化酶解脱脱液溶液,并加入1mg/mL胶原酶类型1。将胶原酶溶液返回到含有动脉的溶液中,最终胶原酶类型1浓度为0.5mg/mL。在37°C下孵育2~3分钟。
- 使用 5 级钳子,快速将街机移动到直径为 35 mm 的培养皿上,该盘含有 750 μL 的新鲜冷冻解散溶液。通过使用两个 20 G 注射器针头将内皮细胞从酶消化的动脉中机械地释放,从而进一步分离组织。
- 使用 9 英寸一次性巴斯德玻璃移液器,在使用玻璃移液器将细胞转移到新的 1.5 mL 离心管之前,对细胞溶液进行 10 倍的三聚处理。
- 用另一个 750 μL 解散溶液清洗培养皿,并转移到同一管中。使用玻璃移液器,通过移液至少10倍进一步机械分散细胞,以创建单个细胞悬浮液,小心不要引入可能损害内皮细胞完整性的气泡。
- 将750 μL的内皮细胞悬浮液(+500~1,000个细胞)直接添加到最接近储层真空侧的半部分MPP流动室的D片中。在室温下,允许内皮细胞在45分钟至1小时之间粘附。
- 将件按步骤 1.4 和 1.5 中所述的适当顺序拧在一起,从而组装 MPP 流室,如图 1所示。将腔室转移到显微镜阶段,并立即向腔室注入沐浴溶液,使溶液达到真空吸气(±10 mL)。通过粗糙和圆形表型19、20识别可访问的内皮细胞。
注:各种消化方法和酶鸡尾酒已被用来分离内皮细胞从不同的动脉床。有关各种研究者用于分离内皮细胞以分离美能敏感电道的贴片夹电生理学的协议的详细说明,请参见表3。这些方法可能适合与 MPP 流室结合使用。
3. 控制剪切应力到MPP流室进行剪切激活的机械敏感电道的电生理记录
- 通过将 30 mL 分级注射器筒将一个 30 mL 分级注射器缸连接到装有微孔管的 3 向 luer 锁(内径:0.05 英寸,外径:0.09 英寸),从而建立重力灌注系统,适合插入 MPP 件 A 的 3 mm 直径入口孔室。
- 使用双面胶带将分级圆柱连接到电生理学台周围的法拉第保持架的外表面(图2)。在将管插入 MPP 室之前,先用沐浴溶液预填充注射器和管(参见表2,了解用于研究内皮细胞内矫正 K+通道的沐浴溶液)。将油管插入 A 件的 MPP 流室入口孔中。
- 预填充 MPP 流量室的解决方案,以便在真空储液罐中去除溶液。停止流向造型室,并将分级油缸重新加注到顶部标记。通过允许溶液流经造型室并使用停止观察在给定注射器气缸高度计算 mL/s,手动计算流速。
- 升高或降低注射器以改变流量,从而在腔室中剪切,并继续此过程,直到找到所需的剪切应力水平。
- 使用以下方程21计算平行腔室中的剪切应力:
• = 6°Q/h2w
其中 = = 流体粘度 (g/cmμs)、Q = 流速 (mL/s) 和平行板室宽度 (w = 2.2 厘米) 和高度(h = 0.1 厘米)。
注:在目前的重力灌注系统中,在注射器筒的高度(从气缸顶部测量)57厘米以上的显微镜阶段,流速为0.3 mL/s。在此注射器筒的高度和流速下,在造型室中计算的剪切为 0.7 dyn/cm2。还应注意的是,其他灌注系统,如蠕动泵,可用于控制流向 MPP 流量室的流量。然而,这些设备可能会增加不必要的湍流,影响流下电生理学测量的稳定性,因此,建议使用此处描述的重力灌注系统。 - 将装有粘附细胞的组装室转移到电生理学台的显微镜阶段,将预填充的浴缸插入A片孔中。 同时填充腔室,用10 mL的沐浴溶液清洗细胞。转动 3 路 luer 锁,使溶液流向造型室。
- 成功获得所需的贴片配置后,允许通道电流在室温下稳定在静态槽中。一旦电流稳定,以循序渐进的方式应用剪切,使电流增加在剪切应力下一步增加之前保持稳定。
注:在研究内皮细胞中的微细胞活化性离子电池通道时,作者发现穿孔片配置最为成功。要执行穿孔全细胞贴片配置,在二甲基硫酸盐 (DMSO) 中加入 5 μL 的 60 mg/mL 库存五聚丙基因 B 到 1 mL 的 0.2 μm 无菌过滤移液器溶液。在细胞连接配置中生成千兆欧姆密封后,在 2⁄5 分钟内形成穿孔的全细胞贴片。 - 通过停止流向腔室的剪切接触,使对美能敏感的通道电流返回到静态槽中观察到的基线电流,从而消除对细胞的剪切暴露。
- 通过改变溶液价值(例如,60 mM K=在移液器溶液中使用 0 Ca2+的沐浴溶液)隔离感兴趣的干扰电通道电流,以研究向内校正 K+ 通道。表 2显示了示例溶液配方)和/或对潜在污染电流源的药理抑制。
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Representative Results
图1显示了显微镜台上MPP流室的不同视图(上面板)和MPP流室(底部面板)的示意图表示。原理图详细说明了整个设备和流室的尺寸。图 2显示了我们实验室(上面板)MPP 流动室的重力灌注系统的照片。还显示了流系统(底部面板)的示意图,用于突出显示将流动室中的细胞与灌注系统输送溶液和溶液真空去除力分离的步骤。
机械刺激3、6、7停止后,机械敏感度是一个标志,即突然恢复到基线水平。图 3作为示例显示,从新分离的内皮细胞中去除 Kir 电流电生理记录期间的剪切应力刺激会导致恢复到最初记录在静态槽中的基线电流。停止流向 MPP 室后,在流量停止后 10 秒内返回到基线电流水平。
全细胞(WC)电生理记录,尤其是从新鲜分离的细胞中采集的,通常有明显的泄漏背景电流,可以掩盖通道活动。某些电道,如内向校正 K+通道系的电道,具有生物物理特性,可减去泄漏背景电流,以便进行更准确的分析。图 4作为示例显示了从原始数据 (图 4A) 到计算和绘制线性向外泄漏 (图 4B) 到最终泄漏减去代表性跟踪 (图 4C) 的过程。参见有关计算和从随附的图例中的原始穿孔 WC 修补程序记录中减去泄漏的详细说明。图 4。
图1:MPP流室和详细的原理图。组装的 MPP 流室(上面板)的照片从三种不同角度显示了显微镜舞台上的腔室:实验期间观察的一侧(左)、灌注输入(中间)和真空出口(右),在照片。每个流的方向都标有。请注意,当以 90° 角弯曲时,接地线可以轻松插入 2 mm 的一个点。详细的原理图(底部)显示了设备复制的确切尺寸。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:重力灌注系统。上面板显示了我们实验室中重力灌注系统的标记照片。底部面板详细介绍了两步 MPP 流量室和重力灌注系统。突出显示了包含细胞的流室和两个上下储层的分离。步骤 1 允许溶液从 B 片的上部储液罐流向播种细胞的腔室的 D 片。步骤 2 允许解决方案从 D 件流向下储层,F件。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:剪切引起的Kir通道电流激活的代表性痕迹,并在去除流量后返回到基线电流水平。对电道的机械活化的一个很好的正控制是回到最初在停止机械刺激时在静浴中观察到的基线电流水平。当重力溶液允许流向 MPP 流室时,通过剪切应力在几秒钟内激活内校正 K+ (Kir) 通道电流。停止流向腔室时,Kir 电流会迅速返回到流之前观察到的基线静态水平。在超过400 ms的贴片上应用了-140 mV至+40 mV的斜坡。沐浴溶液含有60 mMK,反转电位为±-20 mV。代表性的痕迹产生于刚从小鼠肠动脉中分离的内皮细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:泄漏减法示例,用于准确分析微化Kir电流。(A) 代表原始记录从主小鼠内皮细胞与显着的线性向外泄漏电流 (I泄漏) 的 Kir 电流的原始记录。在超过400 ms的贴片上应用了-140 mV至+40 mV的斜坡。沐浴溶液含有60 mMK,反转电位为±-20 mV。(B) I泄漏阻止分析真正的基尔通道活动。要减去我泄漏,首先计算 I泄漏的线性斜率 (G斜率= (Ia-Ib) /(Va-V b))。将 G斜率乘以整个原始跟踪的相应电压,以绘制 I泄漏的原始数据。线应完全覆盖向外线性泄漏。(C) 从整个曲线中减去绘制的 I泄漏,以便线性向外电流为 ±0 pA/pF,可以分析实际基尔电流。请注意,在面板 C 中,向内 Kir 电流大约是面板 A 中原始原始数据跟踪的一半。请单击此处查看此图的较大版本。
| 高度(毫米) | 宽度(毫米) | 长度(毫米) | 其他信息 | ||
| A 件 | 8 | 80 | 98 | 包含一个直径为 3 mm 的孔,用于灌注管(参见材料表)和 53 mm x 60 mm 矩形空间,用于进入中间部分和细胞 | |
| B 件 | 1 | 80 | 98 | 包含 A 片灌注孔下方的空间(20 mm 对角线)和三个 2 mm x 17 mm 的切片,用于访问细胞 | |
| C 件 | 1 | 80 | 98 | 包含 22 mm x 50 mm 空间,其中使用硅弹性体溶液粘附 D 片(参见材料表) | |
| D 件 | 0.16 | 24 | 40 | 流室的矩形玻璃滑动底部 | |
| E 件 | 5 | 80 | 120 | 包含 45 mm x 50 mm 空间,允许 D 件上的单元格可视化。储液罐真空出口 F 件有 20 mm x 45 mm 的空间,需要粘附 | |
| F 件 | 0.16 | 24 | 50 | 真空出水罐的矩形玻璃滑动底部 | |
| 组装 MPP | 15 | 80 | 120 | 流室与入口灌注和出口真空通过两个步骤分离,以避免中断定义良好的层压剪 | |
| 组装MPP的流室 | 1 | 22 | 42 | D 件是流室的玻璃滑动底部 | |
表 1:MPP 的尺寸(组装和拆卸)以及特定于设备每个部件的其他信息。
| 解决 方案 | 食谱(以 mM 表示) | Ph | ||
| 分离 | 55 纳Cl, 80 纳谷氨酸, 6 KCl, 2 MgCl2, 0.1 CaCl2,10 葡萄糖, 10 HEPES | 7.3 | ||
| (细胞隔离) | ||||
| 浴缸(电生理学) | 80 纳Cl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 葡萄糖, 10 HEPES | 7.4 | ||
| 移液器(电生理学) | 5 纳Cl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2, 5 葡萄糖, 10 HEPES | 7.2 | ||
表 2:实验中使用的配方的解决方案示例。
| 内皮细胞分离协议 | 引用 | |
| 中性蛋白酶和乳化酶的鸡尾酒(每杯0.5毫克/升,37°C时1小时),然后是I型胶原酶(0.5毫克/mL;2.5分钟) | 6,7 | |
| 位于下胸主塔内壁的 5 cm2区域的温和机械刮擦 | 11 | |
| 那 | 17 | |
| 那 | 3 | |
| 胶原酶类型 IA (1 毫克/mL) 在 37°C 下 14 分钟 | 8 | |
表3:利用电生理技术研究机械敏感电通道的方法。
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Discussion
血管系统不断暴露于活跃的血液动力学力量,激活肌敏性电通道3,22,但这些通道在剪切应力引起的回激转导的生理作用只是开始出现4,6,8。负责剪切应力激活通道的机械敏感性的机制仍然未知。本文详述的协议描述了实时对层状剪切应力暴露的美感敏感子通道进行直接调查的方法。
该协议的关键和关键步骤是使用经过修改的平行板流室,其开口较窄,允许电生理移液器进入腔室并进入流中的细胞。该装置的一般原则是,如果开口足够窄,生理剪切应力(高达15 dyn/cm2)可以实现,没有溶液溢出,由于表面张力10。为了成功地执行这些实验,至关重要的是:(i) 在开口正下方的底板区域播种细胞;(二) 在底板的区域内播种细胞。(ii) 在启动流量之前或在非常慢(<0.01 dyn/cm 2)背景流期间建立千兆欧姆密封;(iii) 在加强流量的同时保持稳定的密封。我们实验室使用的四件式丙烯酸装置的尺寸与详细的原理图(图1)一起提供,使MPP流室和流系统(图2)可以复制,用于任何实验室调查对微敏的子通道。也可以修改这些尺寸以增加由细胞播种的面积,并改变流道的高度,这将改变流速和剪切应力之间的关系。流室高度的降低将导致相同流速的剪切应力增加,这有利于实现更高的剪切应力。腔室也可以修改,以包括流动隔离屏障,诱导局部区域的循环干扰流量23。
使用MPP流动室的主要优点包括:(1)实时研究培养体内皮细胞和刚从血管组织分离的细胞的剪切活化离子电池通道,(2)细胞暴露和美茶敏离子电池的反应通道到生理上相关的剪切应力水平,以及 (3) 易于组装和拆卸与灌注选项的实验。对于其他现有方法,允许在定义明确的剪切应力下进行电生理记录的唯一方法是将细胞播种到毛细管末端,并将记录移液器插入毛细管开口,如在早期研究中做了3,22。然而,与本文描述的方法相比,存在多重缺点,例如难以将细胞播种到毛细血管中,访问非常少量接近毛细管末端的细胞,以便移液器能够到达它们,以及流道末端的流量扰动(本例中为毛细管)。这些缺点中的每一个都使得在毛细管开口培养的细胞中难以在流动下进行电生理学,几乎不可能修补甚至从血管中新分离的种子细胞。也不可能引入一个步骤来生成扰动流量区域。所有其他现有的方法,要么使用开放室24,25或膨胀溶液直接在细胞17,18不模仿血管的血液动力学环境。
然而,这种方法的主要局限性是限制在生理范围的较高水平上实现剪切应力。具体来说,生理剪切应激水平估计在健康动脉26高达70 dyn/cm2。相比之下,在目前腔室配置中,我们可以达到的最高剪切应力水平为15 dyn/cm 2,此后表面张力不足以防止溶液溢出开口10。降低流道的高度可能允许实现更高的剪切应力水平。在高剪切应力下保持稳定的千兆欧姆密封是另一个挑战,但成功率与实践是合情合理的。我们发现,使用穿孔贴片技术(包括上述移液器溶液中的抗生素安培林B)比标准全细胞配置产生更稳定的记录。此外,使用的MPP流动室和溶液不能完全复制动脉中血流的剪切。血液是一种粘性非牛顿流体,我们在体外实验中没有复制过。此外,此处使用的腔室是一个平行室,而动脉中的剪切应力最好使用气缸中剪切的公式进行计算。
在流下执行单通道录制有重要的注意事项和限制。此方法适用于细胞连接配置(连接到完整细胞膜上的移液器),从而产生稳定的密封。但必须注意,记录活动的单个通道不会直接暴露在剪切应力下,因为它们被记录移液器屏蔽,尤其是在从内到外配置27中。我们认为,当用于测试电子通道对流动的灵敏度时,切除的贴片配置并不是最可靠的,因为切除的膜通常被拉入记录移液器,因此不会暴露于定义良好的流量中。
就可用于这些实验的细胞类型而言,血管内皮细胞是研究剪切应激和对肌敏感通道的最适用细胞类型。早期的研究主要集中于培养的内皮细胞3,28,很容易获得。我们已经测试并扩展了这种方法的使用范围,以从小鼠抗性动脉6、7中新鲜分离的内皮细胞。绝对应考虑其他细胞类型。例如,血管平滑肌细胞,在内皮受损和切除29,30的疾病状态期间,可能会暴露在剪切应激。这是一个耐人寻味的研究领域,即位于平滑肌中的肌痛感通道,否则不受剪切应力的影响,现在将促成潜在的病理生理学机制。此外,采用基因编码感兴趣的通道对HEK或CHO等车辆细胞系进行转染,是结合MPP流室对通道进行生物物理分析的极佳平台。
需要注意的是,虽然MPP流室的初衷是实时调查对水龙通道的活化,但该装置的应用可能超出这一目标。具体而言,同样的方法可用于使用电极传感器的研究,例如一氧化氮 (NO) 传感器,以确定在响应剪切应力时释放 NO。因此,我们为有兴趣实时研究机械调节生物过程的人提供广义的方法,并促进对MPP室的进一步修改,以满足研究者的具体研究需求各种领域的对中尼敏感的过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家心肺血液研究所(R01 HL073965,IL)和(T32 HL007829-24,ISF)资助。作者还感谢芝加哥伊利诺伊大学科学机器商店生成了我们最新的MPP流动室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
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