Summary
Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer til brug ved efterforskning af realtids aktivering af mekanifølsomme Ionkanaler ved hjælp af forskydningsbelastning.
Abstract
Fluid shear stress er velkendt for at spille en stor rolle i endotelfunktion. I de fleste vaskulære senge, forhøjet shear stress fra akutte stigninger i blodgennemstrømningen udløser en signalering kaskade resulterer i vasodilatation derved lindre mekanisk stress på vaskulære væggen. Mønsteret af shear stress er også velkendt for at være en kritisk faktor i udviklingen af åreforkalkning med laminar shear stress er atheroprotective og forstyrret shear stress er Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljeret forståelse af de forskellige mellemliggende celle signalerings veje, er de receptorer, der først oversætter den mekaniske stimulus til kemiske mediatorer, ikke helt forstået. Mekanisk følsomme Ionkanaler er afgørende for reaktionen til at forskyde og regulere forskydnings induceret celle signalering og dermed kontrollere produktionen af vasoaktive mediatorer. Disse kanaler er blandt de tidligste aktiverede signalerings komponenter til forskydning og har været forbundet med forskydnings induceret vasodilatation ved at fremme nitrogenoxid produktion (f. eks. indadtil rektificere K+ [KIR] og forbigående receptor potentiale [TRP] og endotelet hyperpolariserende faktor (f. eks. Kir-og Calcium aktiverede K+ [KCA]-kanaler) og forskydnings induceret vasokonstriktion gennem en ikke-fastlagt mekanisme, der involverer piezo-kanaler. Forståelse af den biofysiske mekanisme, hvormed disse kanaler aktiveres af forskydningskræfter (dvs. direkte eller gennem en primær mechano-receptor) kunne give potentielle nye mål for at løse Patofysiologi forbundet med endoteldysfunktion og atherogenesis. Det er stadig en stor udfordring at registrere flow-induceret aktivering af ion-kanaler i realtid ved hjælp af Elektrofysiologi. De standardmetoder til at eksponere celler til veldefinerede shear stress, såsom kegle og plade rheometer og lukket parallel plade flow kammer tillader ikke real time undersøgelse af ion kanal aktivering. Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer, der giver mulighed for realtids elektrofysiologisk optagelse af mekaniske følsomme Ionkanaler under veldefinerede forskydnings belastninger.
Introduction
Hemodynamic kræfter genereret af blodgennemstrømningen er velkendte at spille store roller i endotelog vaskulære funktion1,2. Det er også velkendt, at flere typer Ionkanaler reagerer akut på ændringer i forskydnings stress3,4,5 , hvilket fører til hypotesen om, at ion-kanaler kan være primære forskydnings sensorer. For nylig viste vi og andre, at mekanisk følsomme ion-kanaler spiller kritiske roller i flere forskydnings følsomme vaskulære funktioner, herunder vasoaktiv respons til forskydnings stress6,7,8 og udviklingsmæssige angiogenese9. Mekanismerne i den shear-stress følsomhed af ion-kanaler, dog, er næsten helt ukendt. Denne mangel på viden vil sandsynligvis skyldes de tekniske vanskeligheder ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede forskydnings stress. I denne artikel, derfor, vi giver en trin for trin detaljeret protokol rutinemæssigt udføres i vores laboratorium for at nå dette mål6,7,10,11.
Det overordnede mål med denne metode er at tillade realtids undersøgelse af ionkanal mekaniaktivering under veldefinerede forskydnings belastninger i det fysiologiske område. Dette opnås ved at ændre en standard parallel plade flow kammer for at tillade en elektrofysiologisk pipette, der skal sænkes ind i kammeret og adgang celler dyrket på bundpladen i realtid eksponering for flow, hvilket giver en unik tilgang til at opnå dette mål6,7,11. I modsætning hertil kan standard parallelle plade strømnings kamre, der er beskrevet i tidligere publikationer, anvendes til analyse af realtidsbilleder af celler, som eksponeres for forskydningskræfter12 eller andre ikke-invasive tilgange13,14 , men ikke til Elektrofysiologi. Tilsvarende, kegle og plade apparat, en anden kraftfuld tilgang til at udsætte celler til at forskyde stress15,16 er heller ikke egnet til elektrofysiologiske optagelser. Således, disse flow-anordninger tillader ikke undersøgelse af shear stress følsomhed af ion-kanaler. Vanskeligheden ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under flow er hovedårsagen til den manglende information om de mekanismer, der er ansvarlige for disse afgørende virkninger.
Med hensyn til de alternative tilgange til at nå det samme mål, er der ingen, der er så nøjagtige eller kontrollerede. Nogle tidligere undersøgelser forsøgte at registrere ion kanal aktivitet under flow ved at udsætte cellerne for en strøm af væske, der kommer fra en anden pipette bragt i nærheden af en celle fra over17,18. Dette er meget ikke-fysiologisk, som de mekaniske kræfter genereret under disse betingelser har lidt til fælles med de fysiologiske profiler af shear stress i blodkarrene. Lignende betænkeligheder gælder for forsøg på at simulere fysiologiske forskydnings stress ved perfusion af åbne kamre. Som diskuteret i detaljer i vores tidligere undersøgelse10, en åben væske-luft interface skaber flere forstyrrelser og recirkulation, som er ikke-fysiologiske. For at imødegå alle disse bekymringer, har vi designet en modificeret parallel plade (MPP) flow kammer, også kaldet "minimalt invasiv flow anordning" i vores tidligere undersøgelser6,7,10,11, lavet fra akryl og flittigt brugt i vores laboratorium. Men på trods af det faktum, at den oprindelige beskrivelse af designet er blevet offentliggjort for næsten 20 år siden, og er den eneste flow anordning, der tillader udførelse elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede shear stress, denne metode er ikke blevet vedtaget af andre laboratorier, og der er kun meget få undersøgelser, der forsøger at optage strømme under flow. Vi mener derfor, at give en detaljeret beskrivelse til brug af MPP flow kammer vil være en stor hjælp til forsker, der er interesseret i mekanifølsomme ion-kanaler og vaskulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af dyr i vores studier er godkendt af University of Illinois i Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. samling af det modificerede parallelle plade flow kammer
Bemærk: Se tabel 1 og figur 1 for MPP flow kammer brik-id'er. Se figur 1 for en skematisk detaljeret orientering af kammer stykker til montage.
- For at overholde det rektangulære dækglas, stykke D, til bunden af stykke C, skal du først gøre silikoneelastomer opløsningen ved grundigt at blande 500 μL silikoneelastomer hærdende middel i 5 mL silikoneelastomer base.
- Påfør et tyndt lag af silikoneelastomer opløsningen rundt om kanterne af det rektangulære rum i stykke C og Placer forsigtigt det rektangulære Cover glas D direkte på elastomer opløsningen, så stykke D fuldstændigt dækker det åbne rektangulære rum i stykke C. Tør forsigtigt den overskydende silikoneelastomer opløsning væk.
- Gentag trin 1,2 for at overholde det rektangulære dækglas, stykke F, til bunden af stykket E og lad silikone-elastomer opløsningen helbrede over natten ved stuetemperatur.
Bemærk: Når den er hærdet, vil det rektangulære dækglas forblive i op til seks måneder, før det skal udskiftes. - Begyndende med den nederste kammer stykke, stykke E, samle MPP flow kammer ved sekventielt placere hvert stykke på toppen af den foregående i følgende rækkefølge: stykke E (bund), stykke C, stykke B, stykke A (top).
- Justerskrue hullerne på hvert stykke i hjørnerne og skru brikkerne stramt sammen for at forhindre lækager i at opstå under administration af strømmen til MPP-gennemstrømnings kammeret.
2. celle klargøring og såning i MPP-flow kammeret
Bemærk: Følg trin 2.1-2.7 for dyrkede endotheliale celler. Følg den metode, som er beskrevet i trin 2.8 − 2.14 til isolering af endotelceller fra mus mesenteriske arterielle arkade og forberedelse af nyisolerede endotelceller.
- I en 6-brønd plade, Placer fire til 5 12 mm Cover glas cirkler/brønd og frøceller mellem 10% og 30% konfluency, således at enkeltceller kan tilgås for elektrofysiologiske optagelser.
- Inkubér celler under standard dyrkningsbetingelser (5% CO2, 37 °c) for ikke mindre end 2 h at tillade celler til at klæbe og ikke mere end 24 h som endotelceller i forfatternes erfaring bliver meget flad og vanskelig at lappe, når seedet ved sub-confluency for mere end 24 H.
- Fjern et cover glas, der indeholder klæbet celler fra en brønd på 6-brønden, skyl hurtigt i fosfat-bufferet saltvand (PBS), og Overfør til en 35 mm Petri skål indeholdende 2 mL elektrofysiologisk bad opløsning (tabel 2) før overførsel til MPP-flowet Kammer.
- Cover glas cirklen overføres til det rektangulære dækglas, stykke D, som er overholdt til stykke C i MPP-gennemstrømnings kammeret, idet det sikres, at en passende opløsning forbliver på dækglasset, så cellerne ikke udsættes for luft. Tilsæt den ønskede badopløsning (~ 250 μL) til cellerne, så dækglas cirklen og-cellerne er helt nedsænket i opløsningen.
- Anbring dækglas cirklen således, at den hviler i den halvdel, der er tættest på vakuum reservoiret, så cellerne vil være i overensstemmelse med spalteåbningerne i stykke B. Sørg for, at glas dækslet klæber til stykke D gennem vedhæftning af løsglas, så anvendelsen af strømmen til kammeret forstyrrer ikke positionen af dækglas cirklen.
- Du skal samle MPP-gennemstrømnings kammeret ved at skrue brikkerne sammen i den rigtige rækkefølge, som beskrevet i trin 1,4 og 1,5 og som vist i figur 1. Overføre kammeret til mikroskopet fase og straks perfuse kammeret med bad løsning sådan, at opløsningen når vakuumbeholderen til aspiration (~ 10 mL).
- Identificer en sund celle for eksperimentet ved at identificere en celle med en mørk kant og indlysende kerne. Undgå celler, der synes at være blebbing eller celler, der er i kontakt med andre celler.
Bemærk: I forfatternes laboratorium anvendes humane aorta endotelceller og primære mus mesenteriske endotelceller i kultur. Men enhver anden form for Veden celle, der er af interesse for specifikke forskningsbehov kan anvendes på samme måde. - Den isolerede arterie arkade vaskes i dissociations opløsning (tabel 2). Arkaden overføres til et 2 mL centrifugeglas, der indeholder 2 mL forvarmet (37 °C) dissociations opløsning (opskrift på dissociations opløsning vist i tabel 2) indeholdende neutral proteasehæmmere (0,5 mg/ml) og elastase (0,5 mg/ml). Inkuber i 1 time ved 37 °C med blid omrystning hver 10 min.
- 1 mL af den neutrale protease/elastase dissociations opløsning fjernes, og 1 mg/mL kollagenase type 1 tilsættes. Kollagenaseopløsningen returneres til opløsningen, der indeholder arterierne for en endelig kollagenase type 1-koncentration på 0,5 mg/mL. Inkuber i 2 − 3 minutter ved 37 °C.
- Ved hjælp af 5-grade pincet, hurtigt flytte arkaden på en 35 mm diameter Petri skål indeholdende en 750 μL dråbe frisk, kølet dissociation opløsning. Yderligere dissocierer vævet ved brug af 2 20 G sprøjte nåle til mekanisk befrielse af endotelceller fra enzymatisk fordøjet arterier.
- Ved hjælp af et 9 "engangs-Pasteur-glas pipet, skal du triturere celle opløsningen 10x, før du overfører cellerne til et nyt 1,5 mL centrifugerør ved hjælp af glas pipet.
- Petri skålen vaskes med yderligere 750 μL dissociations opløsning og overføres til det samme rør. Ved hjælp af glas pipetten, yderligere mekanisk sprede cellerne ved pipettering mindst 10x at skabe en enkelt cellesuspension er omhyggelig med ikke at indføre bobler, der kan beskadige endotelcellens integritet.
- Tilsæt 750 μl af endotel-cellesuspensionen (~ 500 − 1.000 celler) direkte til stykke D i MPP-gennemstrømnings kammeret på den halvdel, som er tættest på reservoir vakuumsiden. Lad endotelcellerne holde sig mellem 45 min og 1 time ved stuetemperatur.
- Du skal samle MPP-gennemstrømnings kammeret ved at skrue brikkerne sammen i den relevante rækkefølge som beskrevet i trin 1,4 og 1,5 og som vist i figur 1. Overføre kammeret til mikroskopet fase og straks perfuse kammeret med bad løsning sådan, at opløsningen når vakuum aspiration (~ 10 mL). Identificer tilgængelige endotelceller ved deres ru og runde fænotype19,20.
Bemærk: En række fordøjelses metoder og enzym-cocktails er blevet brugt til at isolere endotelceller fra forskellige arterielle senge. Se tabel 3 for detaljerede beskrivelser af protokoller, der er blevet brugt af en række efterforskere til at isolere endotelceller til patch clamp Elektrofysiologi af mekanikfølsomme ion kanaler. Disse metoder er sandsynligvis egnet til brug i kombination med MPP flow kammer.
3. styring af Forskydningsbelastning på MPP-gennemstrømnings kammeret til elektrofysiologiske optagelser af forskydnings aktiverede Mekanismfølsomme ion-kanaler
- Set-up en tyngdekraften perfusion system ved at forbinde en 30 mL gradueret sprøjtecylinder til en 3-vejs luer Lock lås udstyret med microbore slange (indvendig diameter: 0,05 tommer, udvendig diameter: 0,09 tommer) egnet til indsættelse i 3 mm diameter indløbs hullet af brik A af MPP Kammer.
- Fastgør den graduerede cylinder til det ydre ansigt af Faraday-buret omkring Elektrofysiologi riggen (figur 2) ved hjælp af dobbeltsidet tape. Før du sætter slangen i MPP-kammeret, skal du pre-fylde sprøjten og slangen med bad opløsning (Se tabel 2 for bad opløsning, der anvendes til undersøgelse af indadtil rektificere K+ kanaler i endotelceller). Indsæt slangen i MPP flow kammer indløbs hullet i stykke A.
- Pre-fylde MPP flow kammer med opløsning sådan, at opløsningen er ved at blive fjernet i vakuumbeholderen. Stop strømmen til kammeret og Genfyld den graduerede cylinder til topmærket. Beregn strømningshastigheder manuelt ved at lade opløsningen flyde gennem kammeret og bruge et stopur til at beregne mL/s ved en given sprøjtecylinder højde.
- Løft eller sænk sprøjten for at ændre strømmen og dermed forskyde i kammeret, og Fortsæt denne proces, indtil det ønskede niveau af forskydnings stress er fundet.
- Beregn forskydningsbelastning i et parallel kammer ved hjælp af følgende ligning21:
τ = 6μQ/h2w
hvor μ = flydende viskositet (g/cm · s), Q = strømningshastighed (mL/s), og parallel plade kammer bredde (w = 2,2 cm) og højde (h = 0,1 cm).
Bemærk: I den nuværende tyngdekrafts perfusions system, ved en sprøjtecylinder højde (målt fra toppen af cylinderen) på 57 cm over mikroskopet fase, er strømningshastigheden 0,3 mL/s. Forskydningen beregnet i kammeret på denne sprøjtecylinder højde og strømningshastighed er 0,7 dyn/cm2. Det skal også bemærkes, at andre perfusions systemer, såsom en peristaltisk pumpe, kan bruges til at styre strømmen til MPP-strømnings kammeret. Men disse anordninger kan tilføje uønsket turbulens og påvirke stabiliteten af Elektrofysiologi målinger under flow, derfor, ved hjælp af tyngdekraften perfusion system beskrevet her anbefales. - Overfør et samlet kammer, der indeholder klækkede celler til mikroskopet fase af Elektrofysiologi riggen og Indsæt slangen fyldt med bad løsning i hullet i stykke A. samtidig fyldes kammeret og vaskes cellerne med 10 mL bad opløsning ved drejning af 3-vejs luer Lock lås sådan, at opløsningen strømmer til kammeret.
- Når den ønskede patch konfiguration er succesfuldt opnået tillade kanal strømninger til at stabilisere sig i et statisk bad ved stuetemperatur. Når strømninger har stabiliseret sig, anvende forskydning i en trin-klog måde tillader stigninger i strømmen til at stabilisere forud for næste skridt stigning i shear stress.
Bemærk: Forfatterne finder den mest succes med den perforerede patch konfiguration, når de studerer mekanisoaktiverede Ionkanaler i endotelceller. For at udføre perforerede fuldcelle patch konfigurationer tilsættes 5 μL af en 60 mg/mL bestand amphotericin B i dimethylsulfoxid (DMSO) til 1 mL 0,2 μm sterilfiltreret pipette opløsning. Efter generering af en Giga-ohm forsegling i den celle tilknyttede konfiguration, perforeret hele celle pletter form inden for 2 − 5 min. - Fjern forskydnings eksponeringen for cellerne ved at standse strømmen til kammeret, så mekanisk følsomme kanal strømme vender tilbage til baseline strømme, som er observeret i det statiske bad.
- Isoler mekanisk følsomme ion-kanal strømme af interesse ved at ændre opløsning Valens (f. eks 60 mm K+ i Bad løsning med 0 ca2 + i pipette opløsning til at studere indadtil rektificere K + kanaler. Tabel 2 viser eksempel på løsnings opskrifter) og/eller farmakologisk hæmning af potentielt kontaminerende strømkilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere fotografier, der viser forskellige visninger af MPP-gennemstrømnings kammeret på mikroskopet (øverste panel) og en skematisk gengivelse af MPP-gennemstrømnings kammeret (nederste panel), er vist i figur 1. Skematisk detaljer dimensionerne af hele enheden og flow kammer. Figur 2 viser et fotografi af tyngdekraften perfusion system til MPP flow kammer i vores laboratorium (øverste panel). Også vist er en skematisk gengivelse af flow system (bundpanel) beregnet til at fremhæve de trin, der isolerer cellerne i strømnings kammeret fra Rush af opløsning fra perfusion system og fra kraften i vakuum fjernelse af opløsning.
Et kendetegn for mekanisk følsomme ion kanaler er en brat tilbagevenden til baseline niveauer ved ophør af mekaniske stimulus3,6,7. Figur 3 viser som et eksempel, at fjerne forskydnings stress stimulus under elektrofysiologiske optagelser af KIR strøm fra en frisk isoleret endotelcelle resulterer i en tilbagevenden til baseline strømme oprindeligt registreret i et statisk bad. Tilbagevenden til det oprindelige nuværende niveau efter standsning af strømmen til MPP-kammeret forekom inden for 10 sekunder af strømnings ophør.
Helcelle (WC) elektrofysiologiske optagelser, især dem taget fra frisk isolerede celler, har ofte indlysende lækage baggrunds strømme, der kan maskere kanal aktivitet. Nogle ion kanaler, såsom dem af den indadtil ensrette K+ Channel familie, har biofysiske egenskaber, der giver mulighed for at fratrække lækage baggrunds strøm for mere præcis analyse. Figur 4 viser som eksempel processen fra rådata (figur 4a) til beregnet og plottet lineær udsivning (figur 4b) til endelig, lækage trukket repræsentativt spor (figur 4c). Se en detaljeret forklaring til beregning og subtraktion af lækage fra den rå perforerede WC-patch optagelse i den medfølgende forklaring til figur 4.
Figur 1: MPP flow kammer og detaljeret skematisk. Fotografier af det samlede MPP-gennemløbs kammer (øverste panel) viser kammeret på mikroskop stadiet fra tre forskellige synspunkter: den side, der ses under eksperimenter (til venstre), fra perfusions indløbet (midten) og fra vakuum udtaget (højre), som er ude af betragtning i fotografiet. Retningen af flow er mærket i hver. Bemærk, at jordledningen nemt kan passe ind i en af de 2 mm slidser, når den bøjes i en vinkel på 90 °. En detaljeret skematisk (nederst) viser nøjagtige dimensioner for replikering af apparatet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tyngdekraften perfusion system. Et mærket fotografi af tyngdekraften perfusion system i vores laboratorium er vist i det øverste panel. Den to-trins MPP flow kammer og tyngdekraften perfusion system er detaljeret i det nederste panel. Adskillelsen af det gennemstrømnings kammer, der indeholder cellerne, og de to øvre og nedre reservoirer fremhæves. Trin 1 tillader løsning at flyde fra den øvre reservoir af stykke B til stykke D i kammeret, hvor cellerne er seedet. Trin 2 tillader løsning at flyde fra stykke D ned til den nedre reservoir, stykke F. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative spor af forskydnings induceret aktuel aktivering af KIR kanaler og tilbagevenden til baseline nuværende niveauer ved fjernelse af flow. En god positiv kontrol for mekanisk aktivering af Ionkanaler er tilbagevenden til baseline nuværende niveauer, der oprindeligt blev observeret i et statisk bad ved ophør af den mekaniske stimulus. Inwardly korrigerende K+ (Kir) kanal strømme aktiveres inden for få sekunder ved shear stress, når tyngdekraften løsning er tilladt at flyde til MPP flow kammer. Efter ophør af strømmen til kammeret, KIR strømme hurtigt tilbage til baseline statiske niveauer observeret før flow. En rampe på-140 mV til + 40 mV blev anvendt på plasteret over 400 MS. badet løsning indeholdt 60 mM K+ og tilbageførslen potentiale var ~-20 mv. De repræsentative spor blev genereret fra en endotel celle frisk isoleret fra mus mesenteriske arterier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel på lækage subtraktion for nøjagtig analyse af mekanisk aktiveret KIR strøm. (A) repræsentativ rå optagelse af KIR strøm fra en primær mus mesenterisk endotel celle med bemærkelsesværdig lineær udadgående lækage strøm (jeglække). En rampe på-140 mV til + 40 mV blev anvendt på plasteret over 400 MS. badet løsning indeholdt 60 mM K+ og tilbageførslen potentiale var ~-20 mv. (B) Jeglække forhindrer analyse af virkelige KIR kanal aktivitet. For at fratrække jeglække, først beregne den lineære hældning ledning af jeglække (Ghældning = (ia-ib)/(Va-vb)). Multiplicer Ghældning ved tilsvarende spændinger af hele rå spor til plot jeglække på de rå data. Linjen skal overlejre den udadgående lineære lækage nøjagtigt. (C) trække det plottet jeglække fra hele sporet, således at den lineære udadstrøm er ~ 0 PA/PF og den virkelige KIR strøm kan analyseres. Bemærk i panel C, at den indad KIR strøm er omtrent halvdelen af den oprindelige rå dataspor i panel A. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Højde (mm) | Bredde (mm) | Længde (mm) | Yderligere oplysninger | ||
| Stykke A | 8 | 80 | 98 | Indeholder et hul med en diameter på 3 mm for indløbs perfusions slanger (Se tabel over materialer) og 53 mm x 60 mm rektangulært rum for adgang til mellemste stykker og celler | |
| Piece B | 1 | 80 | 98 | Indeholder et mellemrum (20 mm diagonalt) under perfusion hul i stykke A og tre 2 mm x 17 mm slidser for adgang til celler | |
| Piece C | 1 | 80 | 98 | Indeholder et 22 mm x 50 mm rum, hvor stykke D overholdes ved hjælp af silikoneelastomer opløsningen (Se tabel over materialer) | |
| Stykke D | 0,16 | 24 | 40 | Rektangulær glas slide bunden af strømnings kammeret | |
| Stykke E | 5 | 80 | 120 | Indeholder et 45 mm x 50 mm mellemrum for at tillade visualisering af celler på stykke D. En 20 mm x 45 mm plads er til stede for reservoiret vakuum udtag, stykke F, skal overholdes | |
| Piece F | 0,16 | 24 | 50 | Rektangulær glas slide bunden af vakuum udløb reservoir | |
| Samlet MPP | 15 | 80 | 120 | Flow kammeret adskilles fra indløbs perfusion og afgangs vakuum med to trin for at undgå afbrydelse af veldefinerede laminar shear | |
| Flow kammer af samlet MPP | 1 | 22 | 42 | Stykke D er glas rutsjebane bunden af strømnings kammeret | |
Tabel 1: dimensioner for MPP (samlet og demonteret) og yderligere oplysninger, som er specifikke for hver del af anordningen.
| Løsning | Opskrift (i mM) | Ph | ||
| Dissociation | 55 NaCl, 80 na-glutamat, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 GLUCOSE, 10 Hepes | 7,3 | ||
| (Celle isolation) | ||||
| Bad (Elektrofysiologi) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 GLUCOSE, 10 Hepes | 7,4 | ||
| Pipette (Elektrofysiologi) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2,5glucose, 10 Hepes | 7,2 | ||
Tabel 2: eksempler på løsninger med opskrifter, der anvendes i forsøgene.
| Endothelial celle isolation protokol | Referencer | |
| Cocktail af neutral proteasehæmmere og elastase (0,5 mg/mL hver; 1 t ved 37 °C) efterfulgt af kollagenase type I (0,5 mg/mL; 2,5 min) | 6, 7 | |
| Blid mekanisk skrabning af en 5-cm2 region beliggende på den indre væg af den nedadgående thorax aorta | 11 | |
| Na | 17 | |
| Na | 3 | |
| Collagenase type IA (1 mg/mL) i 14 min ved 37 °C | 8 | |
Tabel 3: metodologi til undersøgelse af mekanisme følsomme Ionkanaler ved hjælp af elektrofysiologiske teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vaskulære system er konstant udsat for aktive hæodynamiske kræfter, som aktiverer mekanisk følsomme ion kanaler3,22 men de fysiologiske roller af disse kanaler i shear stress-induceret mekanisotransduktion er kun begynder at dukke4,6,8. De mekanismer, der er ansvarlige for mekanisk følsomhed af shear stress-aktiverede kanaler forbliver ukendte. Den protokol, som er beskrevet her, beskriver metoden til direkte undersøgelse af mekanifølsomme Ionkanaler, som udsættes for laminar forskydnings stress i realtid.
Det kritiske og afgørende skridt i denne protokol er brugen af en modificeret parallel plade flow kammer, der har smalle åbninger til at tillade en elektrofysiologisk pipette skal sænkes ind i kammeret og få adgang til celler under flow. Det generelle princip for denne anordning er, at hvis åbningerne er smalle nok, kan fysiologisk forskydningsbelastning (op til 15 dyn/cm2) opnås uden løsning overløb på grund af overflade spændings kræfter10. For at udføre disse eksperimenter med succes, er det afgørende: (i) at frøceller i området af bundpladen, der er direkte under åbningerne; II) etablere en Giga-ohm-forsegling forud for påbegyndelsen af flowet eller under meget langsom (< 0,01 dyn/cm2) baggrunds strøm III) opretholde en stabil forsegling, samtidig med at strømmen optrapper. Dimensioner af de fire-Piece akryl apparatur, der anvendes i vores laboratorium, leveres sammen med detaljerede skemaer (figur 1), således at MPP flow kammer og flow system (figur 2) kan replikeres til brug i ethvert laboratorium, der undersøger mekanifølsomme ion-kanaler. Disse dimensioner kan også ændres for at øge området seedet af celler og for at ændre højden af strømnings kanalen, hvilket ville ændre forholdet mellem strømningshastigheden og forskydnings belastningen. Et fald i højden af strømnings kammeret ville resultere i højere forskydningsbelastning for samme strømningshastighed, hvilket kunne være gavnligt for at opnå højere forskydningsspændinger. Kammeret kan også ændres til at omfatte en flow separations barriere, der inducerer en lokal region af recirkulerende forstyrret flow23.
De største fordele ved at bruge MPP-gennemstrømnings kammeret omfatter (1) realtids undersøgelse af forskydnings aktiverede Ionkanaler fra endotelceller i kultur og celler, der er frisk isoleret fra vaskulære væv, (2) eksponering af celler og respons af mekanisk følsom ion kanaler til fysiologisk relevante niveauer af shear stress, og (3) nem montering og demontering med perfusion muligheder for eksperimenter. Med hensyn til andre eksisterende metoder, den eneste anden metode, der gør det muligt at udføre elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede shear stress er såning cellerne inde i en kapillær ende og indsætte optagelsen pipetten i kapillar åbningen, som blev udført i de tidlige undersøgelser3,22. Der er imidlertid flere ulemper i forhold til den beskrevne metode, såsom vanskeligheden ved såning af celler i kapillærer, adgang til et meget lille antal celler, der er tæt nok på den kapillære ende for pipetten at kunne nå dem, og strømnings forstyrrelser ved enden af strømnings kanalen (kapillær i dette tilfælde). Hver af disse ulemper gør det vanskeligt at udføre Elektrofysiologi under flow i celler, der dyrkes i kapillar åbningen og næsten umuligt at lappe eller endda frøceller frisk isoleret fra Vaskulaturen. Det er også umuligt at indføre et skridt til at generere et område med forstyrret flow. Alle andre eksisterende metoder, der enten anvender åbne kamre24,25 eller puffing løsninger direkte på en celle17,18 ikke efterligner det hæodynamiske miljø i blodkarrene.
Den vigtigste begrænsning af denne metode, dog, er en begrænsning for at opnå forskydnings stress på højere niveauer af det fysiologiske område. Specifikt, fysiologiske shear stress niveauer er blevet anslået til at nå op til 70 dyn/cm2 i raske arterier26. I modsætning hertil er det højeste forskydnings niveau, som vi kunne opnå i den aktuelle konfiguration af kammeret, 15 dyn/cm2, hvorefter overflade spændings kræfterne ikke bliver tilstrækkelige til at forhindre, at opløsningen løber ud af åbningerne10. Det er muligt, at faldende højden af flow Kanalen kan give mulighed for at opnå højere shear stress niveauer. Opretholde en stabil Giga-ohm forsegling under høj shear stress er en anden udfordring, men succesraten er rimelig med praksis. Vi fandt, at ved hjælp af perforeret patch teknik (herunder antibiotika amphotericin B i pipette opløsningen som beskrevet ovenfor) giver mere stabile optagelser end standard hele celle konfiguration. Derudover, MPP flow kammer og opløsninger, der anvendes ikke ligefrem replikere forskydning af blodgennemstrømningen i arterierne. Blod er en viskøs, ikke-Newtonian væske, som vi ikke har replikeret i vores in vitro eksperimenter. Derudover er det kammer, der anvendes her, et parallelt kammer, mens forskydnings stress i arterierne er bedst beregnet ved hjælp af formlen til forskydning i en cylinder.
Der er vigtige overvejelser og begrænsninger for at udføre single-Channel optagelser under flow. Denne metode er velegnet til en celle-knyttet konfiguration (pipette fastgjort til membranen af en intakt celle), som giver stabile sæler. Det er dog vigtigt at være opmærksom på, at enkelt kanaler, hvis aktivitet registreres, ikke er direkte udsat for forskydnings stress, fordi de er afskærmet af optagelses pipetten, især i den indvendige konfiguration27. Vi mener, at de fjernede patch konfigurationer ikke er de mest pålidelige, når de anvendes til at teste følsomheden af ion-kanaler til at flyde, fordi den exciserede membran typisk trækkes ind i optagelsen pipetten og dermed ikke er udsat for en veldefineret flow.
Med hensyn til den type celler, der kan anvendes i disse eksperimenter, er vaskulære endotelceller den mest anvendelige celletype til at studere forskydnings stress og de mekanisofølsomme kanaler. Tidligere undersøgelser fokuserede primært på dyrkede endotheliale celler3,28 , der er let tilgængelige. Vi har testet og udvidet brugen af denne metode til endotelceller frisk isoleret fra musen modstand arterier6,7. Andre celletyper bør absolut overvejes. Vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, kan blive udsat for forskydnings stress under sygdomstilstande, hvor endotelet er blevet beskadiget og fjernet29,30. Dette repræsenterer et spændende studieområde, hvor mekaniske følsomme kanaler, der bor i glatte muskler, som ellers ville være upåvirket af forskydnings stress, nu vil bidrage til potentielt patofysiologiske sygdomsmekanismer. Desuden er Trans fection af køretøjets cellelinjer som HEK eller CHO med genet kodning af kanalen af interesse er en glimrende platform for biofysiske analyser af kanaler i kombination med brug af MPP flow kammer.
Det er også vigtigt at bemærke, at mens den oprindelige hensigt til MPP flow kammer var for real time undersøgelse af ion Channel mechanoactivation, anvendelsen af enheden kan strække sig ud over dette mål. Specifikt kan den samme tilgang anvendes til undersøgelser, der bruger elektrode sensorer, såsom en nitrogenoxid (NO) sensor til at bestemme frigivelsen af NO som reaktion på forskydnings stress. Derfor tilvejebringer vi en generel metodologi for dem med interesse i at undersøge mekanisk regulerede biologiske processer i realtid og fremme yderligere ændring af MPP-kammeret for at opfylde specifikke forskningsbehov for dem, der studerer mekanisk følsomme processer på en række områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af national Heart, Lung og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også gerne anerkende den videnskabelige maskine butik ved University of Illinois i Chicago for at generere vores nyeste MPP flow kamre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
