Summary
O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.
Abstract
O stress de cisalhamento fluido é bem conhecido por desempenhar um papel importante na função endotelial. Na maioria das camas vasculares, o estresse de cisalhamento elevado de aumentos agudos no fluxo sanguíneo desencadeia uma cascata de sinalização resultando em vasodilatação, aliviando assim o estresse mecânico na parede vascular. O padrão de estresse de cisalhamento também é bem conhecido por ser um fator crítico no desenvolvimento da aterosclerose com estresse de cisalhamento laminar sendo aterogênico e perturbado o estresse de cisalhamento sendo pró-aterogénico. Quando nós tivermos uma compreensão detalhada das várias vias intermediárias da sinalização da pilha, os receptores que traduzem primeiramente o estímulo mecânico em mediadores químicos não são compreendidos completamente. Os canais de íons mecanosensíveis são fundamentais para a resposta ao cisalhamento e regulam a sinalização celular induzida por cisalhamento, controlando assim a produção de mediadores vasoativos. Esses canais estão entre os primeiros componentes de sinalização ativados para cisalhamento e foram vinculados à vasodilatação induzida por cisalhamento por meio da promoção da produção de óxido nítrico (por exemplo, retificando internamente K+ [Kir] e potencial de receptor transitório [TRP] canais) e fator de hiperpolarização do endotélio (por exemplo, canais Kir e K+ [KCA] ativados por cálcio) e vasoconstrição induzida por cisalhamento por meio de um mecanismo indeterminado que envolve canais piezo. Compreender o mecanismo biofísico pelo qual esses canais são ativados por forças de cisalhamento (ou seja, diretamente ou através de um Mecano-receptor primário) poderia fornecer potenciais novos alvos para resolver a fisiopatologia associada à disfunção endotelial e aterogênese. Ainda é um grande desafio para registrar a ativação induzida por fluxo de canais iônicos em tempo real usando eletrofisiologia. Os métodos padrão para expor as células à tensão de cisalhamento bem definida, como o Reômetro de cone e placa e a câmara de fluxo de placa paralela fechada, não permitem o estudo em tempo real da ativação do canal iônico. O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada que permita a gravação eletrofisiológica em tempo real de canais de íons mecanosensíveis estresse de cisalhamento bem definido.
Introduction
As forças hemodinâmicas geradas pelo fluxo sanguíneo são bem conhecidas por desempenhar papéis importantes na função endotelial e vascular1,2. É sabido igualmente que diversos tipos de canaletas do íon respondem agudamente às mudanças no esforço de tesoura3,4,5 que conduzem à hipótese que os canais de íon podem ser sensores preliminares do esforço de tesoura. Mais recentemente, nós e outros mostramos que os canais iônicos mecanosensíveis desempenham papéis críticos em várias funções vasculares sensíveis ao cisalhamento-stress, incluindo a resposta vasoativa ao estresse de cisalhamento6,7,8 e angiogênese do desenvolvimento9. Os mecanismos da sensibilidade do cisalhamento-stress de canaletas do íon, entretanto, são quase totalmente desconhecidos. Esta lacuna de conhecimento é susceptível de ser devido à dificuldade técnica de realizar gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido. Neste artigo, portanto, fornecemos um protocolo detalhado passo a passo rotineiramente realizado em nosso laboratório para atingir esse objetivo6,7,10,11.
O objetivo geral deste método é permitir a investigação em tempo real da mecanoativação do canal iônico estresse de cisalhamento bem definido na faixa fisiológica. Isto é conseguido modificando uma câmara paralela padrão do fluxo da placa para permitir que uma pipeta eletrofisiológicos seja abaixada na câmara e as pilhas do acesso crescidas na placa inferior durante a exposição do tempo real ao fluxo, fornecendo uma aproximação original para conseguir este objetivo6,7,11. Em contrapartida, as câmaras de fluxo de placas paralelas padrão, descritas em publicações anteriores, podem ser utilizadas para a análise de imagens em tempo real de células expostas a forças de cisalhamento12 ou outras abordagens não invasivas13,14, mas não para Eletrofisiologia. Similarmente, o cone e o instrumento da placa, uma outra aproximação poderosa para expor pilhas ao esforço de cisalhamento15,16 não são igualmente apropriados para gravações electrofisiológicas. Assim, estes dispositivos de fluxo não permitem a investigação da sensibilidade de tensão de cisalhamento de canais iônicos. A dificuldade em realizar gravações eletrofisiológicas fluxo é a principal razão para a escassez de informações sobre os mecanismos responsáveis por esses efeitos cruciais.
Em termos das abordagens alternativas para atingir o mesmo objetivo, não há nenhum que são tão precisos ou controlados. Alguns estudos anteriores tentaram registrar a atividade do canal iônico fluxo, expondo as células a um fluxo de líquido proveniente de outra pipeta trazida para a vizinhança de uma célula de acima de17,18. Isto é altamente não-fisiológico, como as forças mecânicas geradas nestas condições têm pouco em comum com os perfis fisiológicos de tensão de cisalhamento nos vasos sanguíneos. As preocupações similares aplicam-se às tentativas de simular o stress fisiológico da tesoura pela perfusão de câmaras abertas. Como discutido em detalhe em nosso estudo mais adiantado10, uma relação aberta do líquido-ar cria distúrbios e recirculação múltiplos, que são não-physiological. Para endereçar todas estas preocupações, nós projetamos uma câmara paralela modificada do fluxo da placa (MPP), igualmente referida como o "dispositivo minimamente invasor do fluxo" em nossos estudos mais adiantados6,7,10,11, feitos de acrílico e amplamente utilizado em nosso laboratório. No entanto, apesar do fato de que a descrição original do projeto foi publicada há quase 20 anos e é o único dispositivo de fluxo que permite a realização de gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido, esta metodologia não foi adotados por outros laboratórios e há poucos estudos que tentam registrar correntes fluxo. Acreditamos, portanto, que fornecer uma descrição detalhada para o uso da câmara de fluxo MPP será de grande ajuda para pesquisas que estão interessadas em canais iônicos mecanosensíveis e biologia vascular.
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Protocol
O uso de animais em nossos estudos é aprovado pela Universidade de Illinois no Comitê de cuidados de animais de Chicago (#16-183).
1. montagem da câmara de fluxo de placa paralela modificada
Nota: Refira por favor a tabela 1 e a Figura 1 para IDs da parte da câmara de fluxo MPP. Por favor, consulte a Figura 1 para um esquemático detalhando a orientação de peças de câmara para montagem.
- Para aderir ao vidro de cobertura retangular, peça D, à parte inferior da peça C, primeiro faça a solução de elastômero de silicone misturando completamente 500 μL de agente de cura de elastômero de silicone em 5 mL de base de elastômero de silicone.
- Aplique uma camada fina da solução de elastômero de silicone ao redor das bordas do espaço retangular da peça C e Coloque suavemente a peça de vidro de cobertura retangular D diretamente na solução de elastômero, de forma que a peça D cubra completamente o espaço retangular aberto da peça C. Limpe cuidadosamente o excesso de solução de elastômero de silicone.
- Repita o passo 1,2 para aderir ao vidro de cobertura retangular, peça F, à parte inferior da peça e e permita que a solução de elastômero de silicone Cure durante a noite à temperatura ambiente.
Nota: Uma vez curado, o vidro de cobertura retangular permanecerá aderido por até seis meses antes de precisar ser substituído. - Começando com a parte inferior da câmara, peça E, montar a câmara de fluxo MPP, colocando sequencialmente cada peça em cima do anterior na seguinte ordem: peça E (parte inferior), peça C, peça B, peça A (parte superior).
- Alinhe os furos do parafuso de cada parte nos cantos e parafuse firmemente as partes junto para impedir que os escapes ocorram ao administrar o fluxo à câmara de fluxo MPP.
2. preparação de células e semeadura na câmara de fluxo MPP
Nota: Siga os passos 2.1 − 2.7 para as células endoteliais cultivadas. Siga o método detalhado nas etapas 2.8 − 2.14 para isolar pilhas endothelial da arcada arterial mesentérica do rato e da preparação de pilhas endothelial recentemente isoladas.
- Em uma placa de 6 poços, coloque quatro a 5 12 mm cobrem círculos de vidro/poço e células de semente entre 10% e 30% de confluência, de modo que as células individuais possam ser acessadas para gravações eletrofisiológicas.
- Incubar células condições de cultivo padrão (5% CO2, 37 ° c) para não menos de 2 h para permitir que as células aderem e não mais do que 24 h como células endoteliais na experiência dos autores tornam-se muito plana e difícil de remendo quando semeadas em subconfluência para mais de 24 H.
- Retire um vidro de cobertura contendo células aderiram de um poço da placa de 6 poços, enxague rapidamente em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e transfira para um prato de Petri de 35 mm contendo 2 mL de solução de banho electrofisiológico (tabela 2) antes da transferência para o fluxo MPP Câmara.
- Transfira o círculo de vidro da tampa ao vidro retangular da tampa, parte D, que é aderido à parte C da câmara de fluxo de MPP que está sendo certa que a solução adequada permanece no vidro da tampa de modo que as pilhas não fiquem expostas ao ar. Adicione a solução desejada do banho (~ 250 μL) às pilhas de modo que o círculo e as pilhas de vidro da tampa estejam submergidos completamente na solução.
- Posicione o círculo de vidro de cobertura de modo que repouse na metade mais próxima do lado do reservatório de vácuo para que as células estejam de acordo com as aberturas de fenda da peça B. Assegure-se de que o círculo de cobertura de vidro adere à peça D através da adesão de vidro de solução para que a aplicação de o fluxo para a câmara não interrompe a posição do círculo de vidro da tampa.
- Monte a câmara de fluxo MPP parafusando as peças juntas na ordem apropriada, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5 e conforme mostrado na Figura 1. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfuse imediatamente a câmara com a solução do banho tal que a solução alcança o reservatório do vácuo para a aspiração (~ 10 mL).
- Identifique uma célula saudável para o experimento identificando uma célula com uma borda escura e um núcleo óbvio. Evite células que parecem ser blebbing ou células que estão em contato com outras células.
Nota: No laboratório dos autores, as pilhas endothelial aórticas humanas e as pilhas endothelial mesentérica do rato preliminar na cultura são usadas. No entanto, qualquer outro tipo de célula aderente que seja de interesse para necessidades específicas de pesquisa pode ser usado da mesma forma. - Lave a arcada arterial isolada em solução de dissociação (tabela 2). Transfira o arcade para um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 2 mL de solução de dissociação pré-aquecida (37 ° c) (receita para solução de dissociação mostrada na tabela 2) contendo protease neutra (0,5 mg/ml) e elastase (0,5 mg/ml). Incubar por 1 h a 37 ° c com agitação suave a cada 10 min.
- Retire 1 mL da solução neutra de dissociação da protease/elastase e adicione 1 mg/mL de colagenase tipo 1. Devolva a solução de colagenase para a solução que contém as artérias para uma concentração final do tipo 1 de colagenase de 0,5 mg/mL. Incubar por 2 − 3 min a 37 ° c.
- Usando pinças de 5 graus, mova rapidamente o arcade para um prato de Petri de 35 mm de diâmetro contendo uma gota de 750 μL de solução de dissociação fresca e refrigerada. Dissociar ainda mais o tecido usando agulhas de seringa de 2 20 G para liberar mecanicamente as células endoteliais das artérias digeridas enzimaticamente.
- Usando um 9 "Pipet de vidro Pasteur descartável, triturar a solução de célula 10x antes de transferir as células para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL usando o Pipet de vidro.
- Lave o prato de Petri com outro 750 μL de solução de dissociação e transfira para o mesmo tubo. Usando a pipeta de vidro, dispersar mais mecanicamente as pilhas pipetando pelo menos 10x para criar uma única suspensão da pilha que tem cuidado para não introduzir as bolhas que podem danificar a integridade endothelial da pilha.
- Adicionar 750 μL da suspensão da célula endotelial (~ 500 − 1000 células) diretamente à parte D da câmara de fluxo MPP na metade mais próxima do lado do vácuo do reservatório. Permitir que as células endoteliais aderir entre 45 min e 1 h à temperatura ambiente.
- Monte a câmara de fluxo MPP parafusando as peças juntas na ordem apropriada, conforme descrito nas etapas 1,4 e 1,5 e conforme mostrado na Figura 1. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfuse imediatamente a câmara com a solução do banho tal que a solução alcança a aspiração do vácuo (~ 10 mL). Identificar células endoteliais acessíveis pelo seu fenótipo áspero e redondo19,20.
Nota: Uma variedade de métodos de digestão e coquetéis enzimáticos têm sido usados para isolar células endoteliais de diferentes leitos arteriais. Veja a tabela 3 para descrições detalhadas dos protocolos que foram usados por uma variedade de investigadores para isolar pilhas endothelial para a electrofisiologia da braçadeira de remendo de canaletas de íon mechanosensitive. Estes métodos são prováveis apropriados para o uso em combinação com a câmara de fluxo MPP.
3. controlando a tensão de cisalhamento para a câmara de fluxo MPP para gravações eletrofisiológicas de canais de íons Mecanosensíveis de cisalhamento ativados
- Ajuste um sistema da perfusão da gravidade conectando um cilindro graduado da seringa de 30 mL a um fechamento do luer de 3 vias cabido com a tubulação do Microbore (diâmetro interno: 0, 5 polegadas, diâmetro exterior: 0, 9 polegadas) serido para a inserção no furo de entrada do diâmetro de 3 milímetros da parte a do MPP Câmara.
- Prenda o cilindro graduado à face exterior da gaiola de Faraday que circunda o equipamento da electrofisiologia (Figura 2) usando a fita frente e verso. Antes de inserir o tubo na câmara MPP, pré-encha a seringa e a tubagem com solução de banho (ver tabela 2 para solução de banho utilizada para investigar internamente retificando canais K+ em células endoteliais). Insira o tubo no orifício de entrada da câmara de fluxo MPP da peça A.
- Pré-encha a câmara de fluxo MPP com solução de tal forma que a solução está a ser removida no reservatório de vácuo. Parar o fluxo para a câmara e encher o cilindro graduado para a marca superior. Calcule as taxas de fluxo manualmente permitindo que a solução flua através da câmara e usando um batente-relógio para calcular mL/s em uma determinada altura do cilindro da seringa.
- Levante ou abaixe a seringa para alterar o fluxo e, assim, corte na câmara, e continuar este processo até que um nível desejado de tensão de cisalhamento é encontrado.
- Calcule a tensão de cisalhamento em uma câmara paralela usando a seguinte equação21:
τ = 6μQ/h2w
onde μ = viscosidade do fluido (g/cm · s), Q = vazão (mL/s), e largura da câmara da placa paralela (w = 2,2 cm) e altura (h = 0,1 cm).
Nota: No sistema atual da perfusão da gravidade, em uma altura do cilindro da seringa (como medido da parte superior do cilindro) de 57 cm acima da fase do microscópio, a taxa de fluxo é 0,3 mL/s. A tesoura calculada na câmara nesta seringa altura do cilindro e vazão é 0,7 dyn/cm2. Deve-se notar também que outros sistemas de perfusão, como uma bomba peristáltica, podem ser usados para controlar o fluxo para a câmara de fluxo MPP. No entanto, esses dispositivos podem adicionar turbulência indesejada e influenciar a estabilidade das medições de eletrofisiologia fluxo, portanto, o uso do sistema de perfusão por gravidade descrito aqui é recomendado. - Transfira uma câmara montada contendo células aderidas ao estágio do microscópio do equipamento da electrofisiologia e introduza a tubulação pre-enchida com a solução do banho no furo da parte a. Encha simultaneamente a câmara e lave as células com 10 mL de solução de banho girando o bloqueio Luer 3-Way tal que a solução flui para a câmara.
- Uma vez que a configuração desejada do remendo é obtida com sucesso permita que as correntes de canaleta estabilizem em um banho estático na temperatura ambiente. Uma vez que as correntes estabilizaram, aplique a tesoura em uma forma passo-sábia permitindo aumentos na corrente estabilizar antes do aumento seguinte da etapa no esforço de cisalhamento.
Nota: Os autores encontram o mais sucesso com a configuração perfurada do remendo ao estudar canais de íon mechanoactivated em pilhas endothelial. Para executar as configurações perfuradas do remendo da inteiro-pilha, adicione 5 μL de uma anfotericina B do estoque de 60 mg/ml no sulfóxido de dimetil (DMSO) a 1 ml da solução filtrada estéril da pipeta de 0,2 μm. Após ter gerando um selo do giga-ohm na configuração Cell-Attached, os remendos perfurados da inteiro-pilha dão forma dentro de 2 − 5 minutos. - Remova a exposição da tesoura às pilhas parando o fluxo à câmara permitindo correntes mecanosensitive do canal de retornar às correntes da linha de base observadas no banho estático.
- Isole correntes de canal de íons mecanosensíveis de interesse alterando a solução de Valência (por exemplo, 60 mM K+ em solução de banho com 0 CA2 + em solução de pipeta para estudar internamente retificando canais K +. A tabela 2 mostra exemplos de receitas de soluções) e/ou inibição farmacológica de fontes de corrente potencialmente contaminantes.
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Representative Results
Várias fotografias que mostram diferentes pontos de vista da câmara de fluxo MPP no estágio do microscópio (painel superior) e uma representação esquemática da câmara de fluxo MPP (painel inferior) são mostradas na Figura 1. O esquemático detalha as dimensões de todo o dispositivo e a câmara de fluxo. A Figura 2 mostra uma fotografia do sistema de perfusão por gravidade para a câmara de fluxo MPP em nosso laboratório (painel superior). Também é mostrada uma representação esquemática do sistema de fluxo (painel inferior) destinada a destacar as etapas que isolam as células da câmara de fluxo da corrida da solução do sistema de perfusão e da força da remoção de vácuo da solução.
A marca registrada dos canais iônicos mecanosensíveis é um retorno abrupto aos níveis basais após a cessação do estímulo mecânico3,6,7. A Figura 3 mostra como exemplo que a remoção do estímulo da tensão de cisalhamento durante as gravações eletrofisiológicas da corrente de Kir de uma célula endotelial recém-isolada resulta em um retorno às correntes iniciais registradas inicialmente em um banho estático. O retorno aos níveis atuais da linha de base após ter parado o fluxo à câmara MPP ocorreu dentro de dez segundos da cessação do fluxo.
As gravações electrofisiológicas da inteiro-pilha (WC), especial aquelas tomadas das pilhas recentemente isoladas, têm frequentemente as correntes óbvias do fundo do escape que podem mascarar a atividade da canaleta. Algumas canaletas do íon, tais como aquelas da família de retificação interna de K+ Channel, têm as propriedades biofísicas que permitem subtrair a corrente do fundo do escape para uma análise mais exata. A Figura 4 mostra como exemplo o processo de dados brutos (figura 4a) para o vazamento linear externo calculado e plotado (Figura 4B) para o rastreamento representativo subtraído de vazamento (figura4C). Veja uma explanação detalhada para calcular e subtrair o escape da gravação perfurada crua do remendo do WC na legenda de acompanhamento a Figura 4.
Figura 1: câmara de fluxo MPP e esquema detalhado. As fotografias da câmara de fluxo MPP montada (painel superior) mostram a câmara no estágio do microscópio de três vistas diferentes: o lado como visto durante experiências (à esquerda), da entrada da perfusão (meio), e da tomada do vácuo (direita) que é fora da vista em a fotografia. A direção do fluxo é rotulada em cada um. Observe que o fio terra pode facilmente caber em uma das fendas de 2 mm quando dobrado em um ângulo de 90 °. Um esquema detalhado (fundo) mostra as dimensões exatas para a replicação do aparelho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o sistema de perfusão por gravidade. Uma fotografia rotulada do sistema de perfusão por gravidade em nosso laboratório é mostrada no painel superior. A câmara de fluxo MPP de duas etapas e o sistema de perfusão por gravidade são detalhados no painel inferior. Destaca-se a separação da câmara de fluxo contendo células e os dois reservatórios superiores e inferiores. A etapa 1 permite que a solução flua do reservatório superior da peça B para a peça D da câmara onde as células são semeadas. A etapa 2 permite que a solução flua da parte D para baixo ao reservatório mais baixo, parte F. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: traços representativos de ativação de corrente induzida por cisalhamento de canais Kir e retorno aos níveis de corrente basal após a remoção do fluxo. Um bom controle positivo para a mecanoativação dos canais iônicos é o retorno aos níveis de corrente basal inicialmente observados em um banho estático após a cessação do estímulo mecânico. As correntes de canal K+ (KIR) internamente retificadas são ativadas em segundos por tensão de cisalhamento quando a solução de gravidade é permitida para fluir para a câmara de fluxo MPP. Em cima da cessação do fluxo à câmara, as correntes de Kir retornam rapidamente aos níveis de estática da linha de base observados antes do fluxo. Uma rampa de-140 mV para + 40 mV foi aplicada ao patch sobre 400 MS. a solução de banho continha 60 mM K+ e o potencial de reversão era ~-20 MV. Os traços representativos foram gerados de uma pilha endothelial isolada recentemente das artérias mesentérica do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de subtração de vazamento para análise precisa da corrente de Kir mecanoativada. (A) registro cru representativo da corrente de Kir de uma pilha endothelial mesentérica do rato preliminar com corrente externa notável do escapelinear (eu escapo). Uma rampa de-140 mV para + 40 mV foi aplicada ao patch sobre 400 MS. a solução de banho continha 60 mM K+ e o potencial de reversão era ~-20 MV. (B) euvazamento impede a análise da atividade real canal Kir. Para subtrair Ivazamento, primeiro Calcule a condutância de inclinação linear de ivazamento (GSlope = (ia-ib)/(va-vb)). Multiplicar GSlope por tensões correspondentes de todo o traço bruto para plotarvazamento nos dados brutos. A linha deve sobrepor o escape linear externo exatamente. (C) subtrair o plotado euvazamento de todo o traço de modo que a corrente externa linear é ~ 0 PA/PF e a corrente Kir real pode ser analisada. Observe no painel C que a corrente de Kir interna é aproximadamente metade da do rastreamento de dados brutos original no painel A. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Altura (milímetro) | Largura (milímetro) | Comprimento (milímetro) | Informações adicionais | ||
| Peça A | 8 | 80 | 98 | Contem um furo do diâmetro de 3 milímetros para a tubulação da perfusão da entrada (veja a tabela dos materiais) e 53 milímetros x 60 milímetros de espaço Retangular para o acesso às partes e às pilhas médias | |
| Peça B | 1 | 80 | 98 | Contém um espaço (20 mm diagonal) debaixo do orifício de perfusão da peça A e três fendas de 2 mm x 17 mm para o acesso às células | |
| Peça C | 1 | 80 | 98 | Contém um espaço de 22 mm x 50 mm onde a parte D é aderida usando a solução de elastômero de silicone (ver tabela de materiais) | |
| Peça D | 0,16 | 24 | 40 | Fundo de corrediça retangular de vidro da câmara de fluxo | |
| Peça E | 5 | 80 | 120 | Contém um espaço de 45 mm x 50 mm para permitir a visualização de células na peça D. Um espaço de 20 mm x 45 mm está presente para a tomada de vácuo do reservatório, peça F, a ser aderido | |
| Peça F | 0,16 | 24 | 50 | Fundo de corrediça retangular de vidro do reservatório de saída de vácuo | |
| MPP montado | 15 | 80 | 120 | A câmara de fluxo é separada da perfusão da entrada e do vácuo da tomada por duas etapas para evitar o rompimento da tesoura laminar bem definida | |
| Câmara de fluxo de MPP montado | 1 | 22 | 42 | A parte D é a parte inferior de vidro da corrediça da câmara do fluxo | |
Tabela 1: dimensões do MPP (montados e desmontados) e informações adicionais específicas para cada parte do dispositivo.
| Solução | Receita (em mM) | Ph | ||
| Dissociação | 55 NaCl, 80 na-glutamato, 6 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CAcl2, 10 glicose, 10 HEPES | 7,3 | ||
| (Isolamento celular) | ||||
| Banho (electrofisiologia) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CAcl2, 10 glicose, 10 HEPES | 7,4 | ||
| Pipeta (electrofisiologia) | 5 NaCl, 135 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl2,5glicose, 10 HEPES | 7,2 | ||
Tabela 2: exemplos de soluções com receitas utilizadas nos experimentos.
| Protocolo de isolamento de células endoteliais | Referências | |
| Coquetel de protease neutra e elastase (0,5 mg/ml cada; 1 h a 37 ° c) seguido de colagenase tipo I (0,5 mg/ml; 2,5 min) | 6,7 | |
| Raspagem mecânica suave de uma região de 5 cm2 localizada na parede interna da aorta torácica descendente | 11 | |
| NA | 17 | |
| NA | 3 | |
| Tipo de Collagenase IA (1 mg/mL) para 14 min a 37 ° c | 8 | |
Tabela 3: metodologia para o estudo de canais iônicos mecanosensíveis utilizando técnicas eletrofisiológicas.
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Discussion
O sistema vascular está constantemente exposto a forças hemodinâmicas ativas, que ativam os canais deíons mecanosensíveis,22 mas os papéis fisiológicos desses canais na mecanotransdução induzida por estresse de cisalhamento são apenas começando a emergir4,6,8. Os mecanismos responsáveis pela mecanosensibilidade dos canais ativados por estresse de cisalhamento permanecem desconhecidos. O protocolo detalhado aqui descreve o método para a investigação direta de canais de íons mecanosensíveis expostos à tensão de cisalhamento laminar em tempo real.
A etapa crítica e essencial deste protocolo é o uso de uma câmara de fluxo paralela modificada da placa que tenha aberturas estreitas para permitir que uma pipeta eletrofisiológicos seja abaixada na câmara e as pilhas do acesso o fluxo. O princípio geral deste dispositivo é que se as aberturas são estreitas bastante, o esforço fisiológico da tesoura (até 15 dyn/cm2) pode ser conseguido sem estouro da solução devido às forças de tensão de superfície10. A fim de realizar esses experimentos com sucesso, é crítico: (i) para as células de semente na área da placa inferior que está diretamente debaixo das aberturas; (II) estabelecer um selo giga-ohm antes do início do fluxo ou durante um fluxo de fundo muito lento (< 0,01 dyn/cm2); (III) manter um selo estável enquanto intensifica o fluxo. As dimensões do aparelho acrílico de quatro peças utilizadas em nosso laboratório são fornecidas juntamente com esquemas detalhados (Figura 1), de forma que a câmara de fluxo MPP e o sistema de fluxo (Figura 2) podem ser replicados para uso em qualquer laboratório que investiga canais de íons mecanosensíveis. Essas dimensões também podem ser modificadas para aumentar a área semeada pelas células e para alterar a altura do canal de fluxo, o que alteraria a relação entre a taxa de fluxo e a tensão de cisalhamento. Uma diminuição na altura da câmara de fluxo resultaria em maior tensão de cisalhamento para a mesma vazão, o que poderia ser benéfico para a obtenção de tensões de cisalhamento mais elevadas. A câmara pode igualmente ser modificada para incluir uma barreira da separação do fluxo que induz uma região local de recirculando o fluxo perturbado23.
As principais vantagens do uso da câmara de fluxo MPP incluem (1) investigação em tempo real de canais iônicos ativados por cisalhamento de células endoteliais em cultura e células recém-isoladas do tecido vascular, (2) exposição de células e a resposta de íons mecanosensíveis canais para níveis fisiologicamente relevantes de tensão de cisalhamento, e (3) fácil montagem e desmontagem com opções de perfusão para experimentação. Com relação a outros métodos existentes, o único outro método que permite realizar gravações eletrofisiológicas estresse de cisalhamento bem definido é semeando as células dentro de uma extremidade capilar e inserindo a pipeta de gravação na abertura capilar, como foi feito nos primeiros estudos3,22. Há, entretanto, as desvantagens múltiplas comparadas ao método descrito aqui, tal como a dificuldade de semear pilhas nos capilares, o acesso a um número muito pequeno de pilhas que são próximas bastante à extremidade capilar para que a pipeta possa alcançá-las, e distúrbios de fluxo no final do canal de fluxo (capilar neste caso). Cada uma dessas desvantagens dificulta a realização de eletrofisiologia fluxo em células cultivadas na abertura capilar e virtualmente impossível de remendar ou mesmo células de semente recém-isoladas da vasculatura. Também é impossível introduzir um passo para gerar uma área de fluxo perturbado. Todos os outros métodos existentes que empregam câmaras abertas24,25 ou soluções de sopro diretamente em uma célula17,18 não imitam o ambiente hemodinâmico no vaso sanguíneo.
A principal limitação deste método, no entanto, é uma restrição para atingir o estresse de cisalhamento em níveis mais elevados da faixa fisiológica. Especificamente, os níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento foram estimados para atingir até 70 dyn/cm2 em artérias saudáveis26. Em contrapartida, o maior nível de tensão de cisalhamento que pudemos alcançar na configuração atual da câmara foi de 15 dyn/cm2, após o que as forças de tensão superficial não se tornam suficientes para evitar que a solução derrame as aberturas10. É possível que a diminuição da altura do canal de fluxo possa permitir alcançar níveis mais elevados de tensão de cisalhamento. Manter um selo de giga-ohm estável alta tensão de cisalhamento é outro desafio, mas a taxa de sucesso é razoável com a prática. Nós encontramos que usando a técnica perfurada do remendo (que inclui o anfotericina antibiótico B na solução da pipeta como descrita acima) rende umas gravações mais estáveis do que a configuração padrão da pilha inteira. Adicionalmente, a câmara de fluxo MPP e as soluções usadas não replicam exatamente o cisalhamento do fluxo sanguíneo nas artérias. O sangue é um fluido viscoso e não newtoniano que não replicamos em nossos experimentos in vitro. Adicionalmente, a câmara usada aqui é uma câmara paralela quando a tensão de cisalhamento nas artérias for calculada melhor usando a fórmula para a tesoura em um cilindro.
Há considerações importantes e limitações para executar gravações de canal único em fluxo. Esse método é apropriado para uma configuração conectada à célula (pipeta anexada à membrana de uma célula intacta), que produz vedações estáveis. É crítico embora estar ciente que os únicos canais cuja a atividade está sendo gravada não são expostos diretamente à tensão de cisalhamento porque são protegidos pela pipeta da gravação, especial na configuração do interior-para fora27. Nós acreditamos que as configurações de remendo excisadas não são as mais confiáveis quando usadas para testar a sensibilidade dos canais de íons para fluir porque a membrana extirpada é tipicamente puxada para a pipeta de gravação e, portanto, não é exposta a um fluxo bem definido.
Em termos do tipo de células que podem ser utilizadas nessas experiências, as células endoteliais vasculares representam o tipo de célula mais aplicável ao estudo do estresse de cisalhamento e dos canais mecanosensíveis. Estudos anteriores centraram-se principalmente em células endoteliais cultivadas3,28 que são facilmente disponíveis. Foram testados e ampliados o uso desse método para as células endoteliais recém-isoladas das artérias de resistência do camundongo6,7. Outros tipos de células devem definitivamente ser considerados. Células musculares lisas vasculares, por exemplo, podem tornar-se expostas à tensão de cisalhamento durante os Estados de doença onde o endotélio foi danificado e removido29,30. Isto representa uma área intrigante do estudo por meio de que os canais mechanosensitive que residem no músculo liso, que de outra maneira seriam não influenciados pelo esforço de cisalhamento, contribuiriam agora aos mecanismos potencial fisiopatológicos da doença. Além disso, o transfection de linhas de pilha do veículo como HEK ou CHO com o gene que codifica a canaleta do interesse é uma plataforma excelente para as análises biofísicas dos canais em combinação com o uso da câmara do fluxo de MPP.
Também é importante notar que, embora a intenção original para a câmara de fluxo MPP foi para a investigação em tempo real de mecanoactivation canal iônico, a aplicação do dispositivo pode estender para além deste objetivo. Especificamente, a mesma abordagem pode ser usada para estudos que usam sensores de eletrodo, como um sensor de óxido nítrico (NO) para determinar a liberação de no em resposta à tensão de cisalhamento. Portanto, fornecemos uma metodologia generalizada para aqueles com interesse em investigar processos biológicos regulados mecanicamente em tempo real e promover uma nova modificação da câmara MPP para atender às necessidades específicas de pesquisa para aqueles que estudam processos mecanosensíveis em uma variedade de campos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do coração, pulmão e sangue (R01 HL073965, IL) e (T32 HL007829-24, ISF). Os autores também gostariam de reconhecer a oficina de máquinas científicas na Universidade de Illinois, em Chicago, por gerar nossas mais recentes câmaras de fluxo MPP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
