Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller

Published: September 4, 2019 doi: 10.3791/59780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Crispr-Cas9-teknologien er en effektiv metode til præcist at redigere pattedyrs genomet i en hvilken som helst celletype og udgør et nyt middel til at udføre genom-dækkende genetiske skærme. Her er en detaljeret protokol, der diskuterer de nødvendige skridt til en vellykket udførelse af poolede Genome-Wide CRISPR-Cas9-skærme.

Abstract

Genomredigering ved hjælp af CRISPR-CAS systemet har langt fremme evnen til præcist at redigere genomer af forskellige organismer. I forbindelse med pattedyrsceller udgør denne teknologi et nyt middel til at udføre Genome-dækkende genetiske skærme til funktionelle genomforskning. Biblioteker for guide RNAs (sgRNA), der er rettet mod alle åbne læse rammer, tillader, at der fremstilles tusindvis af genetiske forstyrrelser i en enkelt pulje af celler, som kan screenes for specifikke fænotyper for at involvere genfunktion og cellulære processer i en upartisk og systematisk måde. Crispr-CAS-skærme giver forskerne en enkel, effektiv og billig metode til at afdække de genetiske tegninger for cellulære fænotyper. Endvidere, differentiel analyse af skærme udført i forskellige cellelinjer og fra forskellige kræfttyper kan identificere gener, der er kontekstuelt væsentlige i tumorceller, afsløre potentielle mål for specifikke anticancer behandlinger. Udførelse af genomdækkende skærme i humane celler kan være skræmmende, da dette indebærer håndtering af snesevis af millioner af celler og kræver analyse af store datasæt. Detaljerne i disse skærme, såsom cellelinje karakterisering, CRISPR Library overvejelser, og forståelse af begrænsningerne og mulighederne i CRISPR teknologi under analyse, er ofte overset. Forudsat her er en detaljeret protokol for en vellykket præstation af poolede Genome-Wide CRISPR-Cas9 baserede skærme.

Introduction

CRISPR-CAS, kort til klyngeopdelte korte palindromiske gentagelser og CRISPR-associeret nuclease, består af et enkelt nukleaseprotein (f. eks. Cas9) i kompleks med et syntetisk guide-RNA (sgRNA). Dette ribonucleoprotein-kompleks er rettet mod Cas9-enzymet for at fremkalde dobbeltstrenget DNA-pauser ved en specifik genomlocus1. Dobbelt-strandede pauser kan repareres via homologi instrueret Repair (HDR) eller, mere almindeligt, gennem ikke-homologous end-sammenslutning (nhej), en fejlbehæftet reparations mekanisme, der resulterer i indsættelse og/eller sletninger (indeler), der ofte forstyrrer genfunktion 1. den effektivitet og enkelhed crispr gør det muligt for et tidligere uopnåeligt niveau af genomisk målretning, der langt overgår tidligere genomredigering teknologier [dvs., zink finger nucleaser (znf) eller transkriptionsaktivator-lignende Effector nucleaser ( Talens), som begge lider af øget design kompleksitet, lavere transfektering effektivitet, og begrænsninger i multiplex gen redigering2].

Den grundlæggende forskning anvendelse af CRISPR single-guide RNA-baserede genomredigering har gjort det muligt for videnskabsfolk til effektivt og billigt at afhøre de funktioner af individuelle gener og topologi af genetiske interaktion netværk. Evnen til at udføre funktionelle genomdækkende skærme er blevet stærkt forbedret ved brug af CRISPR-CAS-systemet, især i sammenligning med tidligere genetiske perturbationsteknologier såsom RNA-interferens (RNAi) og mutagenese af gen Trap. RNAi lider især af høje off-Target effekter og ufuldstændig Knockdown, hvilket resulterer i lavere følsomhed og specificitet i forhold til crispr3,4,5, mens gentrap metoder er kun muligt i haploide celler til tab af funktions skærme, hvilket begrænser omfanget af cellemodeller, der kan afhøres6. CRISPR 's evne til at generere komplet gen-knock-out giver et mere biologisk robust system til at afhøre mutant fænotyper med lav støj, minimal off-Target effekter og konsekvent aktivitet på tværs af reagenser5. Crispr-Cas9 sgrna biblioteker, der er rettet mod hele det menneskelige genom, er nu alment tilgængelige, hvilket giver mulighed for samtidig generering af tusinder af gen-Knock-outs i et enkelt eksperiment3,7,8,9 .

Vi har udviklet unikke crispr-Cas9 Genome-Wide sgrna lentiviral biblioteker kaldet Toronto knock-out (TKO) biblioteker (tilgængelige via addgene), der er kompakte og sekvens-optimeret til at lette høj opløsning funktionelle genomforskning skærme. Det seneste bibliotek, TKOv3, mål ~ 18.000 humane protein-kodning gener med 71.090 guider optimeret til redigering effektivitet ved hjælp af empiriske data10. Derudover er TKOv3 tilgængelig som et One-Component Library (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294), der udtrykker Cas9 og sgRNAs på en enkelt vektor, hvilket mindsker behovet for at generere stabile Cas9-ekspression celler, hvilket muliggør Genome-dækkende knock-out på tværs af en bred vifte af pattedyrscelle typer. TKOv3 er også tilgængelig i en vektor uden Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) og kan udnyttes i celler, der udtrykker Cas911.

En genomdækkende CRISPR-Cas9-redigeret cellepopulation kan eksponeres for forskellige vækstforhold, med den overflod af sgRNAs med tiden, der er kvantificeret ved næste generations sekvensering, og som giver en aflæsning til at vurdere frafald eller berigelse af celler med sporbare genetiske forstyrrelser. CRISPR knock-out biblioteker kan udnyttes til at identificere gener, der ved perturbation, forårsage cellulære konditions defekter, moderat lægemiddel følsomhed (f. eks. følsomme eller resistente gener), regulere protein ekspression (f. eks. reporter) eller er påkrævet for en bestemt pathway funktion og cellulær tilstand12,13,14. For eksempel kan differentiale fitness skærme i en Cancer cellelinje identificere både nedbrydning eller reduktion af onkogener og berigelse eller en stigning af tumor suppressorer gener3,14,15. Tilsvarende, ved hjælp af mellemliggende doser af terapeutiske lægemidler kan afsløre både narkotika resistens og sensibilisering gener16,17.

Forudsat her er en detaljeret screening protokol for genom-skala CRISPR-Cas9 tab-of-funktion screening ved hjælp af Toronto knock-out biblioteker (TKOv1 eller v3) i pattedyrceller fra bibliotek generation, screening ydeevne til dataanalyse. Selv om denne protokol er blevet optimeret til screening ved hjælp af Toronto knock-out biblioteker, kan den anvendes og blive skalerbar til alle CRISPR sgRNA poolede biblioteker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De nedenfor beskrevne eksperimenter bør følge instituttets retningslinjer for miljø-og sundhedssikkerhed.

1. poolede CRISPR sgRNA lentiviral Library plasmid amplifikation

  1. Fortynd det færdiglavede CRISPR sgRNA plasmid DNA-bibliotek til 50 ng/μL i TE (f. eks. TKOv3).
  2. Electroporate biblioteket ved hjælp af elektro kompetente celler. Indstil i alt fire elektroporations reaktioner som beskrevet nedenfor.
    1. Tilsæt 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliotek til 25 μL optøede elektro kompetente celler til forkølede kuvetter (1,0 mm) på is.
    2. Elektroporat ved hjælp af optimale indstillinger foreslået af producentens protokol. Inden for 10 s af pulsen tilsættes 975 μL restitutions medium (eller SOC medium) til kuvetten.
    3. Overfør elektro porterede celler til et kulturrør, og tilsæt 1 mL genvindings medium. Der inkuberes i en ryste inkubator ved 250 rpm i 1 time ved 37 °C.
  3. Indstil en fortyndings plade for at titer biblioteket og anslå Transformations effektiviteten.
    1. Pool alle 8 mL genvundne celler og bland godt. 10 μL af de poolede celler overføres til 990 μL genvindings medium for en 800-fold fortynding og blandes godt.
    2. Plade 20 μL af fortyndingen på en præ-opvarmet 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agar plade. Dette resulterer i en 40.000-fold fortynding af transformanterne, der vil blive brugt til at beregne Transformations effektiviteten.
    3. Plade 400 μL genvundne celler på hver plade i alt 20 forvarmede 15 cm LB + carbenicillin agar plader. Pladerne inkubates i 14 – 16 timer ved 30 °C.
      Bemærk: vækst ved denne lavere temperatur minimerer rekombinationen mellemlang-Terminal gentagelser (LTR)18.
    4. For at beregne Transformations effektiviteten tælles antallet af kolonier på 40.000-fold fortyndings pladen (trin 1.3.2). Multiplicere antallet af kolonier tælles med 40.000 for at opnå det samlede antal kolonier på alle plader. Fortsæt, hvis det samlede antal kolonier repræsenterer en Biblioteks dækning svarende til minimum 200x kolonier pr. sgRNA (mest optimale er 500-1000x).
      1. For eksempel er det minimale koloni nummer for TKOv3 Library (71.090 sgRNA) 1,4 x 107, hvilket svarer til 200x kolonier per sgrna. Hvis koloni repræsentationen er utilstrækkelig, øges antallet af elektro porationer i trin 1,2 baseret på antallet af kolonier på fortyndings pladen for at opnå minimums Biblioteks dækningen.
  4. Høst kolonierne som beskrevet nedenfor
    1. Til hver 15 cm plade tilsættes 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) medium, så skrabe kolonierne af med en celle spreder. Med en 10 mL pipette overføres de afskede celler til en steril 1 L konisk kolbe eller flaske.
    2. Skyl pladen igen med 5 mL LB + carbenicillin medium, og Overfør opløsningen til flasken.
    3. Gentag for alle plader til at samle celler fra 20 plader i en steril flaske.
  5. Bland indsamlede celler med en Stir bar for 1 h ved stuetemperatur (RT) at bryde op celle klumper. Overfør celler til forvejede Centrifugerings flasker, og centrifuger ved 7.000 x g til pellet bakterier, og kassér derefter mediet.
  6. Den våde celle pellet vejes, og Centrifugerings flaskens vægt trækkes fra for at bestemme den endelige vægt af den våde pellet. Rense plasmid DNA ved hjælp af en maxi-eller Mega-skala plasmid rensning kit afhængigt af mængden af bakteriel pellet hver kolonne kan behandle.

2. storstilet CRISPR sgRNA Library lentivirus produktion

Bemærk: alle trin i dette afsnit af protokollen udføres i en BSL2 + facilitet i en klasse II, type a2 biosikkerhed kabinet.

  1. Beregn antallet af 15 cm plader, der kræves til virus produktion baseret på skønnet, at 18 mL af virus typisk høstes fra 1 15 cm plade.
  2. Forbered celler til transfektering ved at såning hek-293t emballage celler i lav-antibiotika vækstmedier (DMEM + 10% FBS + valgfri: 0,1 x pen/STREP) ved 8 x 106 celler per 15 cm plade i 20 ml medier. Inkubatceller natten over ved 37 °C, 5% CO2. Sørg for, at de belagte celler er 70%-80% konflydende og jævnt spredt på tidspunktet for transfection.
  3. Næste dag, forberede tre transfektering plasmider blanding som skitseret i tabel 1 for 15 cm plader. Beregn mængden af plasmid nødvendig for en transfektering og lave en blanding af plasmider for antallet af plader, plus en, der skal transfected.
  4. Der fremstilles et lipid-baseret transfektering reagens for hver transfektering som beskrevet i tabel 2. Aliquot reducerede serum medier til individuelle 1,5 mL mikrocentrifuge glas til det antal plader, der skal transfteres. Tilsæt transfektering reagens, bland forsigtigt, og Inkuber i 5 minutter ved rt.
  5. Efter 5 min inkubation tilsættes den mængde DNA, der kræves for en transfektering til transfektering reagens for en 3:1 ratio af transfektering reagens-til-μg af DNA-kompleks. Bland forsigtigt og Inkuber i 30 minutter ved RT.
    Bemærk: efterfølgende transfections kan tilberedes i sæt på fem eller derunder, med 5 minutters intervaller for at optimere for tiden og undgå over-inkubation.
  6. Efter 30 min inkubation overføres omhyggeligt hver transfektering blanding til hver plade af emballage celler. Tilsæt hele blandingen ved hjælp af en 1 ml pipettespids dråbevis i en cirkulær, zigzag bevægelse uden at forstyrre celle monolayer. Inkubatceller ved 37 °C i 18 timer ved 5% CO2.
  7. Forbered viral høst medier: 500 mL DMEM medium + 32 mL BSA bestand (20 g/100 mL, opløst i DMEM, filter steriliseret med 0,22 μm filter) + 5 mL 100x pen/STREP.
  8. Efter 18 timer fjernes mediet (brug korrekt håndtering af lentivirus affald såsom inkubation i 1% natriumhypochlorit i 30 minutter før bortskaffelse). Udskift forsigtigt med 18 mL viral høst medie til hver plade. Inkubatceller ved 37 °C i 18 timer ved 5% CO2.
  9. Efter 24 timer, check emballage celler for unormal og smeltet morfologi som en indikation af god virus produktion. Derefter høstes lentivirus ved at samle alle supernatanten og overføre til et sterilt konisk centrifugeglas.
  10. Spin mediet indeholdende virus på 300 x g i 5 min og pellet emballagen celler. Aliquot supernatanten ind i et sterilt polypropylenrør uden at forstyrre pellet.
  11. Virussen opbevares ved 4 °C i korte perioder (mindre end 1 uge) eller umiddelbart ved-80 °C ved langtidsopbevaring. Aliquot storstilet virus Preps til engangsbrug volumener til langtidsopbevaring for at undgå fryse/optøning.

3. cellelinje karakterisering til screening

  1. Vælg den ønskede cellelinje.
    1. Måle og registrere den omtrentlige fordobling tid af cellerne.
    2. Bestem optimal celle plating tæthed for dyrkning celler hver 3 – 4 celle fordoblinger i en vævskultur fartøj valg (f. eks, 15 cm vævskultur plader).
  2. Bestem den puromycin-koncentration, der skal anvendes i den ønskede cellelinje for udvælgelse af TKO-biblioteker indeholdende puromycin resistens markør som følger:
    1. Frøceller i en 12 brønd plade ved den tæthed, der kræves for at nå sammenløbet efter 72 h, derefter inkubere natten (37 °C, 5% CO2).
    2. Den næste dag skiftes til et medie, der indeholder et fortyndings område af puromycin-koncentrationer fra 0 μg/mL til 10 μg/mL, i intervaller på 0,5 μg/mL. Cellerne inkubates i 48 h.
    3. Efter 48 h måles cellens levedygtighed ved celletælling eller Alamarblå farvning.
    4. Bestem den laveste koncentration, der dræber 100% af cellerne i 48 h. Brug denne koncentration til at vælge til CRISPR Library-transducerede cellepopulationer i trin 4,6 og 5.2.6.
      Bemærk: for cellelinjer med længere fordoblings tider kan længere inkubationer med puromycin tolereres. I disse situationer skal du bestemme drabs kurven for den inkubations tid, der kræves til < 3-celle doublings. Minimer tidspunktet for udvælgelse for at undgå frafald af essentielle gener, før screening påbegyndes.
  3. Kontroller cellerne for følsomhed over for hexadimethrinbromid (op til 8 μg/mL) ved at udføre en dosisresponskurve i samme metode, som anvendes til måling af puromycin-følsomhed (trin 3,2). Hvis der observeres toksicitet med < 8 μg/mL hexadimethrinbromid, må det ikke anvendes.

4. funktionel titrering af poolede CRISPR lentivirus bibliotek til bestemmelse af MOI

  1. Tø en frisk alikvot af poolede CRISPR sgRNA Library lentivirus (f. eks. LCV2:: TKOv3) og hold på is.
  2. Designe en serie af virus mængder til at teste mellem intervallet 0 – 2 mL (dvs., 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL, og 2 mL).
  3. Høst målceller og frøceller i 15 cm plader ved den tæthed, der kræves for at nå konfluence i 72 h.
  4. For hver virus volumen, der skal testes, forberede duplikerede plader. Tilsæt celler, virus, hexadimethrinbromid (8 μg/mL) og medier til et endeligt volumen på 20 mL. Bland pladerne grundigt, sidde plader niveau i inkubator og Inkubér i 24 h (37 °C, 5% CO2).
  5. Efter 24 timer fjernes virus indeholdende medier og bortskaffes (brug biosikkerhedsforholds regler ved håndtering af lentivirus affald). Du skal eventuelt forsigtigt vaske pladen med varm PBS for at fjerne uvedkommende virus.
  6. For hver virus tilstand, Udskift med 20 mL af medier, der indeholder puromycin ved hjælp af koncentrationen bestemmes til at dræbe celler i punkt 3, til en replikat plade. Til den anden plade tilsættes 20 mL friske medier uden puromycin. Inkuber i 48 h (37 °C, 5% CO2).
  7. Efter 48 h, Kontroller, at alle ikke-inficerede celler (0 mL virus tilstand) behandlet med puromycin er døde. Høst alle plader individuelt og sprede celler ved gentagen blid pipettering.
  8. Tæl celler fra alle pladerne og Beregn MOI for hver virus volumen ved at sammenligne celletal med puromycin udvælgelse til celletal uden puromycin (dvs., +/-puromycin).
  9. Graf resultater til at bestemme virus volumen, der fører til 30%-40% celle overlevelse med puromycin udvælgelse versus uden puromycin. Brug denne virus volumen til at opnå en MOI på 0,3 – 0,4 under skærmen under de samme vævskultur betingelser.

5. primær skærm infektion, udvælgelse, og celle passaging

  1. Vælg den CRISPR sgRNA Library dækning, der skal vedligeholdes i hele skærmen (anbefales minimum 200-fold).
    1. Baseret på Biblioteks dækningen skal du bestemme antallet af celler, der kræves for at bevare denne dækning pr. sgRNA, og det antal celler, der kræves til infektion i MOI 0,3 (tabel 3).
    2. Bestem det antal plader, der skal bruges til at opsætte infektionen (tabel 4).
  2. Inficerer cellerne med CRISPR Library
    1. Høst celler og frø det nødvendige celle nummer til hver 15 cm plade.
    2. Tilsæt hexadimethrinbromid (8 μg/mL) til alle plader.
    3. Tilsæt virussen ved den mængde, der kræves til MOI 0,3 til screening og kontrol 2 pladerne. For kontrol 1, skal du ikke tilføje virus, og erstatte denne diskenhed med medier.
    4. Bland pladerne grundigt ved at vippe. Placer pladerne i inkubator, og sørg for, at de er i niveau.
      Bemærk: batch infektioner kan gøres ved at kombinere en masterblanding af virus, medier og hexadimethrinbromid til celler i suspension før plating.
    5. Fjern mediet, og Udskift det med friske medier indeholdende puromycin ved den koncentration, der er fastlagt i trin 3.2.4 til screening og kontrol 1 plader 24 timer efter virus infektion. Tilsæt friske medier uden puromycin til kontrol 2 pladen. Inkubatceller i 48 h (37 °C, 5% CO2).
    6. 48 h efter puromycin tilsætning, sikre, at alle uinficerede celler er døde (Control 1) for at bekræfte puromycin aktivitet, derefter høste de inficerede celler.
  3. Høst inficerede celle befolkning og celle passaging
    1. Høst de puromycin-udvalgte celler fra alle screening plader i en steril beholder. Saml cellerne fra hver kontrol plade separat. Disperse celler ved blid gentagen pipettering.
    2. Tæl celler fra poolede Screenings celler, kontrol 1 og kontrol 2 separat og beregn antallet af celler pr. 1 mL.
    3. Beregn MOI og fold dækning opnået som følger:
      Equation 1
      Equation 2
    4. Saml tre replikater af celle pellets fra de poolede celler ved den valgte Biblioteks dækning for genomisk DNA-ekstraktion. Cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 min. vask med PBS. Mærk rørene og fryse tørre celle pellets ved-80 °C (disse er t0 referenceprøver).
    5. Opdel puljen af inficerede celler i tre replikate grupper (f. eks Repliker A, Repliker B, Repliker C), samtidig med at Biblioteks dækningen bevares inden for hver replik. Frøceller ved samme såningstæthed, som normalt ville blive anvendt ved udvidelse af dem. Brug det samme antal celler til hver replikatplade og det samme samlede antal celler mellem replikater.
    6. Fortsæt til passage celler og høst tre replikater af celle pellets fra hver replikat af poolede inficerede celler som ovenfor, hver 3-8 dage afhængigt af celle linjen, for op til 15 – 20 celle doublings. Ved hver passage, høst cellerne fra alle plader i hver replikat gruppe med hinanden (dvs. alle celler fra replikere en plader er re-blandet sammen, alle celler fra replikat B plader er re-blandet sammen, etc.).
    7. Mærk hver pellet med en tid (T) og Repliker betegnelse. Dette svarer til det antal dage efter t0, som pellet opsamles (f. eks. T3_A, T3_B, T3_C osv.).
  4. For de negative udvælgelse narkotika skærme, tillade celler at inddrive for mindst én passage efter t0 før behandling. På T3 eller T6 opdeles cellerne fra hver replikat gruppe (A, B, C) i stof behandlings-og kontrolpopulationer ved hjælp af den samme såningstæthed, der anvendes i trin 5.3.5.
    1. Separat pulje antallet af celler, der kræves til Biblioteks dækning for hver replikat i lægemiddel behandlingsgruppen. Tilsæt stoffet ved intermediære koncentrationer (IC20-IC50). Frø cellerne og Inkuber (37 °C, 5% CO2) indtil næste passage.
    2. Separat pulje antallet af celler, der kræves til Biblioteks dækning for hver replikat i køretøjskontrol gruppen. Tilføj køretøjets betjeningsenhed med samme volumen som lægemidlet (< 0,5% v/v). Frø cellerne og Inkuber (37 °C, 5% CO2) indtil næste passage.
    3. Fortsæt med at passere cellerne og høst celle pellets for genomisk DNA hver 3 dage som beskrevet i trin 5.3.5, mens forfriskende lægemidlet eller køretøjet ved hver passage.
  5. For den positive udvælgelse eller resistens skærme, opdele hver replikat gruppe i henhold til antallet af celler, der kræves for Biblioteks dækning. Tilsæt IC90 lægemiddelkoncentrationer til hver replikat. Hos IC90vil et flertal af cellerne blive dræbt. Tillad resistente populationer at vokse og indsamle celle pellets (1 – 2 x 107 celler) for GENOMISK DNA ekstraktion.

6. prøveforberedelse og sekventering af CRISPR

  1. Genomisk DNA-rensning
    1. Inkubere de frosne celle piller 5 – 10 min ved RT til optøning.
    2. Der tilsættes 1,4 mL PBS til et 50 mL centrifugeglas indeholdende en celle pellet. Vortex for 20 s at resuspendere cellerne og hvile i 1 min. Hvis det er nødvendigt, skal du pipettere 15x med P1000 for at opdele de resterende celle klumper. Hvis der overføres celler fra et 15 mL-eller 1,5 mL-rør, skal cellerne resuspenderes med 1 mL PBS, hvorefter cellerne omføres til et 50 mL rør, og det originale rør skylles med 400 μL PBS.
    3. Tilsæt 5 mL Nuklei lysis-opløsning til de resuspenderede celler. Ved hjælp af en 10 mL pipette blandes prøven ved pipettering op og ned 5x.
    4. Tilsæt 32 μL RNase A (20 mg/mL; for at opnå en slutkoncentration på 100 μg/mL) til det nukleare lysværk, og bland prøven ved at invertere røret 5x. Blandingen inkubates ved 37 °C i 15 minutter, og prøven kan afkøles i 10 minutter ved RT.
    5. Tilsæt 1,67 mL protein fældnings opløsning til lysatet og vortex kraftigt i 20 s. små protein klumper kan være synlige efter blanding.
    6. Centrifugeres ved 4.500 x g i 10 minutter ved rt.
    7. Ved hjælp af en 10 mL pipette overføres supernatanten til et 50 mL centrifugeglas, der indeholder 5 mL isopropanol. Bland forsigtigt opløsningen 10x ved inversion, indtil DNA'ET observeres.
      Bemærk: DNA kan observeres som hvide, trådlignende tråde, der danner en synlig masse.
    8. Centrifugeres ved 4.500 x g i 5 minutter ved rt for at pille DNA'et.
    9. Brug en 10 mL pipette til forsigtigt at fjerne supernatanten og undgå at skille DNA-pillerne ad. Tilsæt 5 mL 70% ethanol ved RT til DNA'ET. Drej forsigtigt røret for at vaske DNA-pellet og siderne af centrifugeglasset.
    10. Centrifugeres ved 4.500 x g i 5 minutter ved rt.
    11. Brug en 10 mL pipette til forsigtigt at fjerne 70% ethanol og undgå at skille DNA-pillerne ad. Lufttørret genomisk DNA i 10 minutter ved RT.
    12. Tilsæt 400 μL TE-opløsning til røret og lad DNA'ET opløses ved at inkubere ved 65 °C i 1 time. Bland DNA'ET ved forsigtigt at fslikke røret hver 15 min. Hvis DNA'et ikke opløses fuldstændigt, Inkubér røret ved 65 °c i yderligere 1 time, mens røret forsigtigt svirpe hver 15 min., og lad det ligge ved 4 °c natten over.
    13. Centrifuge ved 4.500 x g i 1 min ved RT og Overfør GENOMISK DNA til et 1,5 ml lavbindende rør.
    14. Kvantificer og mål renheden af genomisk DNA på både Spektrofotometer (for totalt nukleinsyre indhold) og fluorometer (for dobbeltstrenget DNA-indhold).
  2. Eventuelt udfældelse af genomisk DNA, hvis der er problemer med downstream PCR amplifikation af sgRNA som følger.
    1. Overfør 400 μL genomisk DNA til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    2. Tilsæt 18 μL 5 M NaCl (slutkoncentration på 0,2 M) og 900 μL 95% ethanol.
    3. Vend røret 10x, indtil det blandes grundigt, og centrifuger derefter ved 16.000 x g i 10 minutter ved rt.
    4. Fjern forsigtigt supernatanten, og undgå at skille DNA-pillerne ad. DNA-pellet vaskes med 500 μL 70% ethanol. Drej forsigtigt røret for at vaske DNA-pellet.
    5. Centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved rt.
    6. Fjern forsigtigt supernatanten og undgå at skille sig af med DNA-pellet. Lufttørret genomisk DNA i 10 minutter ved RT.
    7. Tilsæt 300 μL TE for at opløse DNA som beskrevet i trin 6.1.12.
    8. Kvantificer og mål renheden af genomisk DNA som beskrevet i trin 6.1.14.
  3. Forberedelse af crispr sekventering Library
    1. Konfigurer PCR 1 som beskrevet i tabel 5 med i alt 100 μg GENOMISK DNA. Tilsæt 3,5 μg genomisk DNA pr. 50 μL reaktion, og sæt identiske reaktioner på 50 μL for at opnå den ønskede dækning. Tabel 6 viser eksempler på primer-sekvenser til forstærkning af LCV2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Tabel 7 viser eksempler på primer-sekvenser til forstærkning af pLCKO2:: TKOv3 sekvensering biblioteker.
    2. Amplify PCR 1-reaktioner i en termo cycler ved hjælp af det program, der er beskrevet i tabel 8.
    3. Kontrollér PCR 1-amplifikation ved at køre 2 μL af PCR-produktet på en 1% agopstået gel. PCR 1 giver et produkt på 600 BP.
    4. Pool alle individuelle 50 μL reaktioner for hver genomisk DNA-prøve og blandes ved vortexing.
    5. Der oprettes en PCR 2-reaktion (50 μL) for hver prøve som beskrevet i tabel 9 med 5 μl af det poolede PCR 1-produkt som skabelon. Brug unikke indeks primer-kombinationer for hver enkelt prøve for at tillade samling af eksempler på sekvensering af biblioteker.
    6. Amplificere PCR 2-reaktionen i en termo cycler ved hjælp af det program, der er beskrevet i tabel 10.
    7. Clean agrose gel udstyr til rensning af forstærkede produkter med 0,1 N HCl i 10 min før støbning af en gel. Forbered en 2% agopstået gel indeholdende DNA-pletter til rensning af PCR 2 amplificerede produkter.
    8. Kør PCR 2-produktet på 2% aghas-gel ved lav spænding (1,0 – 1,5 timers kørsel). PCR 2 giver et produkt på 200 BP.
    9. Visualiser PCR-produkterne på en blå lys-transilluminator. Punkt 200 BP-båndet og rense DNA fra agrose gel Slice ved hjælp af et gel ekstraktions udstyr. Kvantificere og måle renheden af sekvensering biblioteket på både Spektrofotometer og fluorometer.
      Bemærk: en typisk gel-renset sekventering Library koncentration spænder fra 5 – 10 ng/μl og et samlet udbytte på 150 – 300 ng.
  4. Sekvensering med høj gennemløb
    1. Sekvensere CRISPR sekvensering biblioteker på næste generation sequencers.
    2. Sekvens reference t0 prøver ved højere læse dybde på 400-til 500-fold Biblioteks dækning. Sekvens eksperimentelle tidspunkt prøver for Drop-out skærme på en minimum læse dybde på 200-fold. For stærke positive valg skærme er et minimum af læse dybde på 50-fold dækning tilstrækkeligt til identifikation af beriget sgRNAs.
      Bemærk: det er afgørende at sekvens t0-prøven for at bestemme Biblioteks repræsentationen for en bestemt skærm og fungere som en reference for den afgørende sgRNA fold ændringer over tid.

7. data analyse

  1. Juster sekvens ved hjælp af programmer som Bowtie at kort sekvens læser til Referencebiblioteket ved hjælp af følgende parametre:-v2 (tillader to mismatch) og-M1 (kassere enhver læst, der er knyttet til mere end én sekvens i biblioteket).
  2. Normaliser antallet af entydigt kortlagte læsninger for hver sgRNA for en given prøve til 10.000.000 læsninger pr. prøve som følger:
    Equation 3107
  3. Den LOG2 fold ændring af hver sgRNA beregnes for hver replikat ved hvert tidspunkt (TN) sammenlignet med t0-prøven (TN/t0). Tilføj en pseudo tælling på 0,5 læser til alle læste optællinger for at forhindre diskontinuiteter fra nuller. Eksklude sgRNAs med < 30 rå læsninger i t0-prøven fra fold-Change-beregning og downstream-analyse.
  4. Analyser fold ændringer med Bayesian analyse af gen væsentlighed (BAGEL) algoritme < https:/github.com/Hart-Lab/Bagel >, ved hjælp af de centrale væsentlige og ikke-væsentlige Træningssæt defineret tidligere19 for gene væsentlighed skærme ( Supplerende tabel S1) eller drugz < https://github.com/Hart-Lab/drugz > til lægemiddel skærme20.
  5. Beregn præcision og tilbagekaldelse for vurdering af skærmens ydeevne ved hjælp af BF-scorer. Brug det essentielle sæt fra trin 7,4 som den sande positivliste for precision_recall_curve-funktionen i Scikit-Learn library for Python sammen med den ovenstående under gruppe for BF-score. Alternativt kan du udføre det samme ved hjælp af PRROC-pakken i R.
  6. Beregn den gennemsnitlige fold ændring af alle vejledninger for hvert Gen. Generere tæthed parceller for de væsentlige og ikke-essentielle gener (Se trin 7,4) i R eller tilsvarende software. I R, hvis x. ESS er en vektor, der indeholder log fold ændre værdier af essentielle gener og x. nonEss indeholder ikke-essentielle gener, plot ved hjælp af følgende kommando:
    Plot (tæthed (x. ESS), XLAB = "Mean logFC", Col = "rød", LWD = 2)
    streger (tæthed (x. nonEss), Col = "blå", LWD = 2)
    Bemærk: for Python-versionsoplysninger og pakker, der bruges, se scikit-Learn v 0.19.1: (udgivet af Pedregosa et al.21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversigt over genom-skala CRISPR screening workflow

Figur 1 illustrerer en oversigt over det POOLEDE crispr screening arbejds flow, begyndende med infektion af målceller med crispr Library lentivirus ved et Low Moi for at sikre enkelt integrations hændelser og tilstrækkelig Biblioteks repræsentation (typisk 200-til 1000 -Fold). Efter infektion, celler behandles med antibiotika puromycin at vælge for transducerede celler. Efter udvælgelsen opsamles en baseline t0-celle pellet for at vurdere Biblioteks distributionen ved starten af screeningen. De resterende celler, der består af en heterogen population af genetiske forstyrrelser, er urerne på det ønskede Biblioteks repræsentation hver 3-4 dage for 15-20 fordoblinger at tillade genredigering og de resulterende virkninger at manifestere. Skærme med lægemidler behandlinger er typisk tilsættes på T3 eller T6 efter cellerne er genoprettet fra virus infektion og puromycin udvælgelse. Celler høstes på det ønskede bibliotek repræsentation ved hver passage for genomisk DNA, at bestemme guide overflod ved næste generation sekvensering på ønskede tidspunkter.

Det anbefales at indsamle flere prøver i tilfælde af fejl, der kan opstå i downstream sekvensering bibliotek forberedelse trin. Poolet skærme er typisk levedygtighed-baserede assays, der er designet til enten positive eller negative udvælgelse af essentielle sgRNAs. Positive skærme identificerer gener, der udviser resistens eller øger overlevelsen under specifikt selektions tryk (f. eks. stoffer eller mutant cellelinje). I dette tilfælde vil de fleste celler dø fra udvælgelsen, og celler, der forbliver vil blive beriget til sgRNAs målretning gener, der er resistente over for stoffet eller tilstand testes. Negative valg skærme eller "Drop-out"-skærme identificerer gen-Knock-outs med øget følsomhed over for eller tab af overlevelse under skærm markerings trykket. For at identificere forstyrrelser, der har en fænotypisk effekt, såsom en vækst defekt, er guide tæthed på hvert tidspunkt kvantificeret ved næste generations sekvensering og sammenlignet med t0 for at vurdere frafald eller berigelse af hjælpelinjer i løbet af skærmen. Ved hjælp af analyseplatforme måles logfold ændringer for guider, og algoritmer som BAGEL kan anvendes for at muliggøre rangering af genhits.

Biblioteks forstærkning og vedligeholdelse af Biblioteks repræsentation i poolede CRISPR-skærme

Figur 2 illustrerer den forventede fordeling af hjælpelinjerne efter forstærkning af plasmid-biblioteket. TKOv3 Library består af 71.090 sgRNAs med fire sgRNAs pr. gen, målretning ~ 18.000 protein kodning gener10. Et ideelt bibliotek skal have hver eneste sgRNA repræsenteret i lignende mængder. Derfor anbefales det at bekræfte fordelingen af vejledninger i det forstærkede bibliotek ved næste generations sekvensering. Vist her er et forstærket bibliotek med meget stram distribution af sgRNAs, hvilket bekræfter, at > 95% af alle sgRNAs er inden for 4-fold distributionsområde (figur 2). En bredere fordeling af sgRNAs vil indikere, at den overflod af Biblioteks guider ikke er ligeligt repræsenteret og kan bidrage til støjen i puljede skærme.

Evaluering af skærmens ydeevne

Figur 3 illustrerer, at præstations kvaliteten af en skærm kan evalueres ved at vurdere fold Change fordelingen af alle sgRNA mod en guld standard referenceliste over essentielle (684 gener) og ikke-essentielle gener (926 gener) og visualiseret som præcision-Recall kurver10. Ved hjælp af reference sættene af guldstandarden beregnes Bayes Factor (BF)-scorer for skærm slutpunktet, og kurver for præcisions tilbagekaldelser afbildes. BF scores beregnes ved at analysere loggen-fold ændring for alle guider rettet mod et gen ved hjælp af en Bayesian ramme (BAGEL algoritme beskrevet tidligere19) til at sammenligne fordelinger af kendte væsentlige og ikke-væsentlige vejledning sæt. Falske Discovery rates (FDR) er afledt empirisk ved hjælp af de samme guld standard reference sæt. En højtydende skærm skal genvinde et stort antal essentielle gener ved en tærskel på BF > 6 og FDR < 5%, som det fremgår af en skarp "albue" i de fleste kurver og en lige linje til Terminal punktet som vist af den blå linje i figur 3a. Frafaldet af vejledninger, der er rettet mod essentielle og ikke-essentielle gener, bør også undersøges (figur 3b). Vejledninger, der er rettet mod reference ikke-essentielle gener, skal vise en stort set symmetrisk fordeling af logfold ændringer centreret ved nul, som vist af den stiplede linje i figur 3b. Fold skifte fordelingen af guider rettet mod essentielle gener viser et stærkt negativt skift i forhold til fordelingen af guider rettet mod ikke-essentielle gener, som det fremgår af den solide linje i figur 3b.

Essentielle gener

En af de grundlæggende anvendelser af poolet genom-dækkende Drop-out skærme er at identificere essentielle gener. Essentielle gener, en under kategori af fitness gener, er gener, hvis forstyrrelse forårsager celle dødelighed, også betragtes som løst som spredning gener. I forbindelse med kræft biologi, er det muligt at identificere kontekstspecifikke Essentials for at identificere afhængigheder for en bestemt tumor cellelinje. Figur 4, viser genet rang af essentielle gener ved hjælp af Bayes faktor scores, afledt af BAGEL algoritme. Bayes faktor (BF) repræsenterer en tillids måling, at genet knock-out resultater i en fitness defekt. Mere positive resultater indikerer højere tillid til, at perturbationen forårsager et fald i fitness.

Skærmbilledet positivt valg

Genome-brede knock-out puljer kan dyrkes i nærværelse af overskydende Drug agent til at lede efter suppressor/resistensgener. Vist her er et eksempel på HCT116 celler screenet i nærværelse af thymidin at kigge efter suppressorer af G1/S anholdelse3. Oplysninger om dette skærmbillede findes i en tidligere publikation3. Kort, 6 dage efter udvælgelsen af CRISPR Library inficerede celler, celler blev opdelt i replikater opretholde Biblioteks dækning og behandlet med thymidine. Celler blev urerne i nærværelse af stof, indtil rigelig resistente celler blev genvundet for genomisk DNA-prøvetagning. Positive valg kan sorteres (læse dybde) ved lavere dækning end negative skærme, da kun en lille brøkdel af guider vil forblive på grund af det stærke selektive tryk. I dette eksempel blev sekvensering opnået med nogle få millioner læsninger, og 11 af 12 sgRNAs rettet mod thymidinkinase (TK1) blev genfundet og beriget som forventet (figur 5).

Beløbene blev fastsat på grundlag af molær ratio på 1:1:1
Komponent Beløb pr. 15 cm plade en stor
LCV2::TKOv3 pLCKO2::TKOv3
psPAX2 4,8 μg 7,0 μg
pMD2. G 3,8 μg 4,0 μg
TKOv3b 8,0 μg 5,0 μg
en stor Fastsatte beløb baseret på de fleste produktive plasmid kombination for TKO bibliotek på 1:1:1 molære ratio
b Beløb TKO plasmid baseret på CRISPR Library vektor backbone. LCV2 alt-i-en vektor = 13 KB, ikke-Cas9 pLCKO2 Vector = 7,6 KB

Tabel 1: anbefalet mængde plasmid til TKOv3 transfection.

Komponent Beløb pr. 15 cm plade
Opti-MEM 800 μL
Transfection reagens 48 μL

Tabel 2: lipid-baseret transfektering reagens set-up.

Fold-dækning Antal celler pr. sgRNAb  Antal celler, der kræves til infektionb
(sgRNA bibliotek størrelsea × fold dækning) (sgRNA Biblioteks størrelse × fold dækning ÷ 0,3 MOI)
200 1,5 x 107 5 x 107
500 3,6 x 107 1,2 x 108
1000 7,1 x 107 2,4 x 108
en stor Baseret på TKOv3 Biblioteks størrelse = 71.090 sgRNA
b Tal rundes op

Tabel 3: bestemmelse af cellenumre, der kræves til TKOv3 CRISPR Library-infektion og celle belægning ved forskellige fold-dækning.

Behandling Antal plader, der kræves til infektion
Screening plader Virus, + puromycin (sgRNA bibliotek størrelse × 200-fold) ÷ 0,3 MOI ÷ celle såning tæthed ved infektion = antal plader krævesen
Control 1 Ingen virus, + puromycin (0% overlevelse kontrol) 1
Control 2 Virus, + ingen puromycin (100% overlevelse kontrol) 1
a omfatter ekstra plader til at RUMME for Moi udsving og vækstrater

Tabel 4: beregning for infektion set-up.

Reagenser Beløb pr. 1x-reaktion
2x Master Mix 25 μL
10 mM PCR 1 LCV2 Forward primer 2,5 μL
10 mM PCR 1 LCV2 reverse primer 2,5 μL
Genomisk DNA 3,5 μg
Vand op til 50 μL
Samlede 50 μL

Tabel 5: Opsætning af PCR 1.

Tabel 6: PCR primere til forstærkning af LCV2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tabel 7: PCR primere til forstærkning af pLCKO2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Trin Temperatur Tid
1 98 °C 30 sek
2 98 °C 10 sek 25 cyklusser (trin 2 – 4)
3 66 °C 30 sek
4 72 °C 15 sek
5 72 °C 2 min
6 10 °C Holde

Tabel 8: PCR 1-cyklusparametre.

Reagenser Beløb pr. 1x-reaktion
2x Master Mix 25 μL
10 mM i5 fremad primer 2,5 μL
10 mM i7 reverse primer 2,5 μL
PCR 1-produkt 5 μL
Vand 15 μL
Samlede 50 μL

Tabel 9: Opsætning af PCR 2.

Trin Temperatur Tid
1 98 °C 30 sek
2 98 °C 10 sek 10 cyklusser (trin 2 – 4)
3 55 °C 30 sek
4 65 °C 15 sek
5 65 °C 5 min
6 10 °C Holde

Tabel 10: PCR 2-cyklusparametre.

Supplerende tabel S1. TKO reference gensæt venligst klik her for at downloade denne fil.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over samlede Screenings arbejdsgange. (A) målcelle populationen er inficeret med crispr Library lentivirus hos Low Moi for at sikre, at de fleste celler får en viral integration, og at Biblioteks repræsentationen bevares. De forskellige farver repræsenterer forskellige sgRNAs i hver viral partikel. Der er valgt genetisk modificerede celle puljer. Når valget er færdigt, udtages der celler til t0-reference og serielt passaged. B) ved den første passage efter t0 er cellerne genvundet fra infektion, og der kan om nødvendigt tilsættes medicin behandlinger. Efter behandling, cellepopulationer er serielt urerne i flere uger. Under hver passage indsamles celler for genomisk DNA og igen på den krævede fold dækning af sgrna biblioteket. C) der kan udføres to typer skærme: 1) positive markerings skærme, som identificerer mutante celler, der udviser resistens eller øget overlevelse under det specifikke tryk (f. eks. stoffer eller mutant cellelinje), da de vil blive beriget under skærms eller 2) negative valg skærme, som identificerer mutante celler med øget følsomhed over for eller tab af overlevelse under skærm markerings trykket, da de vil gå tabt under skærmen. D) GENOMISK DNA HØSTES og PCR-amplificeres for at berige for guide regioner. (E) guide overflod er kvantificeret ved næste generations sekvensering og beriget, eller udtømte guider er bestemt for "hit" identifikation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kvaliteten af forstærket CRISPR sgRNA bibliotek. Amplificerede Biblioteks plasmider analyseres ved næste generations sekvensering (anbefalede læsninger: 30.000.000 læsninger, svarende til ~ 400-fold repræsentation af biblioteket). Her vises et bibliotek med en stram distribution af sgRNAs, med > 95% af alle sgRNAs inden for et 4-fold distributionsområde.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: evaluering af Drop-out skærmkvalitet ved hjælp af guld-standard væsentlige gen reference sæt. A) analyse af præcisions tilbagekaldelses resultater med hensyn til genvinding af essentielle gener ved en tærskelværdi på BF > 6 og FDR på 5%. Højtydende skærm er repræsenteret af blå linje og lav ydeevne skærme er repræsenteret ved rød linje. (B) fold ændring fordeling af sgRNA rettet mod essentielle gener (solid Line) og ikke-essentielle gener (punkterede linjer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bestemmelse af gen væsentlighed. Bayes faktor rangordning af genet hovedsagelig i en bestemt skærm. Bayes faktor (BF) repræsenterer en tillids måling, at genet knock-out resultater i en fitness defekt. Højere Bayes faktorer indikerer øget tillid til, at gen knock-out resultater i fitness defekt, (røde prikker). Lavere Bayes-faktor scorer tyder på, at knock-out giver vækst fordel (blå prikker). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: positiv valg skærm for suppressor af thymidinblok i HCT116 celler. Normaliserede læse tællinger for alle sgRNAs ved t0 plottet mod gennemsnitlige normaliserede læse tællinger for thymidinbehandlede prøver. For positiv udvælgelse skærme (dvs. ved hjælp af en IC90 koncentration af narkotika), antallet af perturbationer, der vil give resistens over for lægemidlet forventes at være lille. Af denne grund, læse dybden kan være lavere end hvad der er behov for negative skærme, i sikkerhedskopien det meste af biblioteket forventes at være repræsenteret. TK1 sgrnas er cirklet med rødt. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af sin enkelhed i brug og høj smidighed, er crispr teknologi blevet bredt vedtaget som det foretrukne værktøj til præcis genom redigering. Samlet CRISPR-screening giver en metode til at afhøre tusinder af genetiske forstyrrelser i et enkelt eksperiment. I poolede skærme fungerer sgRNA Libraries som molekylære stregkoder, da hver sekvens er unik og er knyttet til det målrettede gen. Ved at isolere det genomiske DNA fra celle populationen kan gener, der forårsager fænotype af interesse, bestemmes ved at kvantificere sgRNA-overflod ved næste generations sekvensering. Massivt parallelle sekvensering metoder udnyttes til at kvantificere sgRNAs i prøver, hvilket betyder, at flere uafhængige cellepopulationer kan samles i samme sekvensering Lane for at minimere omkostningerne.

Før man påbegynder et storstilet Screenings projekt, er det vigtigt at have en velkarakteriseret og teknisk optimeret model. Genetiske baggrund, vækstrate, og transduktivitet effektivitet er vigtige faktorer, når du vælger din cellelinjer til screening. For eksempel, vækstrater og redigering effektivitet vil bestemme skalerbarhed og teknisk egnethed af modellen. For i tilstrækkelig grad at repræsentere store sgrna biblioteker, snesevis af millioner af celler er nødvendige, derfor celle nummer kunne være en begrænsende faktor i screening gennemførlighed for cellelinjer med langsommere fordoblinger eller dem, der ikke har en god proliferativ kapacitet (f. eks primære celler). Baseret på vækstrater, bør cellekultur betingelser såsom celle såning tæthed og pladestørrelse til screening vælges i overensstemmelse hermed. Det anbefales at kultur celler i det største fartøj, der er praktisk og teknisk muligt for skærmen.

Lentivirus-transduktivitetseffektiviteten varierer mellem celle typerne, da cellerne er forskellige i den iboende infektionsevne. Som et resultat, mængden af virus, der kræves for at opnå tilstrækkelig infektion i en celletype vil ikke nødvendigvis være den samme i en anden. Derfor er det afgørende at funktionelt titer hvert parti af lentivirus bibliotek produceret i cellen linje, der skal screenes for at sikre tilstrækkelig dækning af biblioteket og for det meste enkelt transduktionshændelser pr celle ved at transducere ved lavere MOIs omkring 0,3 (afsnit 4). Transduktionseffektiviteten kan også påvirkes af celle dyrkningsforholdene. Derfor bør funktionelle titre bestemmes ved hjælp af de samme celle betingelser, der vil blive anvendt på skærmen. Det er, det er vigtigt at bruge de samme væv kultur fartøjer, medier bestanddele og volumen, celle plating tæthed, og virus Preps uden forudgående thaws. Målinger, der foretages i forskellige formater eller tilstande, skaleres ikke pålideligt til Screenings formatet.

På trods af fordelen ved at bruge All-in-One CRISPR-Cas9 guide biblioteker såsom LCV2:: TKOv3, er genet kodning Cas9 ret stor, hvilket gør det vanskeligt at effektivt pakke ind i virale partikler (105-106 Tu/ml). At levere lavere lentiviral titre kan være en begrænsning for cellelinjer, der er svære at transformere, da de vil have endnu mere besvær med All-One-crispr-bibliotekerne. For at afbøde dette bør Cas9 udtrykkes i celle linjen på forhånd, efterfulgt af levering af CRISPR-biblioteker, der kun indeholder sgRNAs (f. eks. pLCKO2:: TKOv3), som kan laves ved meget højere titre (107-108 Tu/ml). Den Ploidi i en celle kø er ligeledes betydelig, nemlig sig afgører den antal i mål loci at savn at blive forandret. Evnen til at generere komplette Knock-outs i haploide celler er mere effektiv end i celler med flere eksemplarer af et givent gen. Derfor kan skærme i haploide celler være mere følsomme og give data af højere kvalitet end skærme udført i diploide eller aneuploid Cell Lines6. Test af kendte gener, der er knyttet til Fænotypen, vil hjælpe med at bestemme skærm evnen for en cellelinje model. For eksempel, for væsentlighed skærme, guider rettet mod en underenhed af 26s proteasome, PSMD1 (addgene: plasmid #74180), et centralt vigtigt gen, kan bruges til at teste redigering effektivitet og infektivitet af cellelinjer, som forstyrrelse af PSMD1 vil resultere i celledød.

Robustheden af poolet skærme afhænger meget af sgRNA repræsentation. Dette er en vigtig Metric, der bestemmer bibliotekets ydeevne under en skærm og muligheden for at identificere hits. Biblioteks diversiteten er partisk i repræsentationen af hver sgRNA; Derfor bør populationen af celler, der skal screenes og analyseres, være tilstrækkelig stor til at sikre erobringen af underrepræsenterede sgRNAs6. 200-til 1000-fold repræsentation af hver sgrna er den typiske dækning, der er blevet brugt i offentliggjorte skærme (dvs., 200-1000 celler per sgrna)10,15. Denne repræsentation bør opretholdes, når du forstærker biblioteket plasmid (afsnit 1) og i hele skærmen ved at inficere og passaging det krævede celle nummer (afsnit 5) til at repræsentere den ønskede Biblioteks dækning og under sekvensering bibliotek forberedelse (protokol nr. 6) som beskrevet i hele protokollen. For eksempel, for at opnå ~ 200-fold dækning af TKOv3 bibliotek kræver udvælgelse og passaging af 15.000.000 inficerede celler. Under sekvensering, under forudsætning af et diploide humant genom indeholder ~ 7,2 PG af DNA og 1 sgRNA per genom, i alt 100 μg genomisk DNA er nødvendig for at generere sekvensering bibliotek for 15.000.000 sekvens læser. Beslutningen om dækning vil afhænge af størrelsen af biblioteket, som dækningen af større biblioteker vil kræve dyrkning større antal celler, der kan være vanskelige at vedligeholde og ikke teknisk praktisk. Et minimum af 200-fold dækning anbefales med TKOv3 biblioteker, som 200-fold giver en optimal balance mellem logistik af screening stort antal celler og opretholde tilstrækkelig dynamikområde til at detektere ægte biologiske sgRNA drop-outs med begrænset støj fra tilfældige depletions22,23. Højere fold bibliotek repræsentationer vil resultere i forbedret reproducerbarhed og sikre tilstrækkelig vindue til påvisning af ændringer i sgRNA overflod, især for negative valg. En begrænsende træk ved negative skærme er, at forstyrrelse kun er opbrugt i det omfang, at det var til stede i Start biblioteket24. Til sammenligning, den dynamiske vifte af positive udvælgelse skærme er meget større, da de er afhængige af tilsætning af celler, og kunne berige til 100% af den endelige befolkning23. Derfor, for positiv udvælgelse skærme (f. eks resistens skærme), biblioteks dækning og læse dybde kan reduceres til 50-til 100-fold repræsentation, da kun en lille celle befolkning forventes at overleve.

Den sekvente Rings Biblioteks protokol, der er beskrevet her, er en to-trins PCR, der er optimeret til TKOv3 crispr-biblioteker i begge vektor backbones og sekvenseret på Illumina sekventering platformen. Disse sekvensering biblioteker kan også genereres ved hjælp af en enkelt PCR-protokol, svarende til den, der er beskrevet i Hart et al.3. For andre færdiglavede biblioteker bør de primere og sekvente Rings protokoller, der er fastsat for disse biblioteker, konsulteres. Ved tilberedning af genomisk DNA og PCR-prøver er det vigtigt at være hensynsfuld over for kontaminerings foranstaltninger. For eksempel, et dedikeret område for genomisk DNA rensning anbefales stærkt. Det bør også være fysisk adskilt fra bakterielle plasmid Preps, som er almindelige forurenende stoffer, der findes i genomisk DNA-prøver. PCR-reaktioner bør sættes op i en dedikeret PCR-hætte, da dette vil minimere kontaminering fra plasmider og andre sekvensering biblioteker. For god praksis kan en ikke-skabelon negativ kontrol medtages for at hjælpe med at overvåge for PCR-kontaminering.

Data analyse til at oversætte sekvensering læser fra skærme er en ikke-triviel opgave, i betragtning af størrelsen og mangfoldigheden af disse datasæt. Når sekvens aflæsninger er justeret og normaliseret, er der flere bioinformatiske værktøjer til rådighed til at hjælpe med at evaluere skærmens ydeevne (figur 3) og hit-identifikation (figur 4). BAGEL er beskrevet i denne protokol som det vigtigste værktøj til dataanalyse. BAGEL bruger en Bayesian ramme til at sammenligne fordelinger af kendte væsentlige og ikke-væsentlige gensæt til log-fold ændring af alle guider rettet mod et gen. Denne metode er beskrevet i detaljer i Hart et al3. Ud over BAGEL, andre algoritmer designet til at identificere både beriget og forarmet sgRNAs, såsom MAGeCK25 kan også bruges. For narkotika skærme, anbefales det at bruge DrugZ algoritme til at identificere både synergistiske og suppressor kemiske genetiske interaktioner. DrugZ var designet til at sammenligne den relative forekomst af sgRNA i en behandlet population med den relative forekomst af sgRNA i en ubehandlet population på samme tidspunkt20.

En begrænsning af CRISPR skærme er, at Cas9 ikke altid fører til en knock-out, da der altid er en mulighed for, at indels skabt er i-frame mutationer, forlader genet funktion intakt13. Dette resulterer i en blandet befolkning, hvilket gør skærmen "støjende" og fortolkning af data udfordrende. Ved hjælp af flere uafhængige sgRNAs målretning et gen kan opbygge-i redundans, reducere effekten af sgRNAs med lav aktivitet. En yderligere advarsel til CRISPR undersøgelser er effekten af den dobbelte streng pauser skabt af Cas9 nuclease, hvilket kan føre til cellulær dødelighed uafhængig af genet bliver målrettet. Denne anti-proliferative virkning øges med Target site kopi nummer, hvilket fører til falsk positiv identifikation af gener inden for stærkt forstærkede regioner26. Beregningsmæssige metoder som CERES er blevet udviklet til at korrigere for kopi nummer effekter27. Disse arbejdsprocesser betragter kopierings taleffekten til at estimere genafhængigheds niveauerne i knock-out-baserede væsentligheds skærme. Omhyggelig undersøgelse af genomiske lokaliteter af hit gener i forstærkede regioner kan hjælpe med at bestemme falske positiver, der skyldes multiplicitet af skære effekter13. Primære skærme kan kun identificere potentielle hits. Det er vigtigt at følge op med en sekundær skærm eller protokol for at validere hits og skelne on-Target fra off-Target effekter, lugning ud falske positiver og sikre gener, der scorede svagt på grund af ineffektive forstyrrelser er ikke efterladt som falsk negativer23.

Denne protokol fokuserer på levedygtigheds baserede screeningsmetoder, hvor undersøgelsens tilstand bør føre til en sprednings defekt eller cellernes død. For processer, der ikke fører til en ændring i cellernes levedygtighed, kan den rentabilitets baserede pulje screeningsmetode være restriktiv. Et alternativ er at udføre skærme ved hjælp af reporter eller markør baserede analyser og tilsætning ved fluorescens aktiverede celle sorteringsmetoder (FACS). I markør baserede markerings skærme er Fænotypen baseret på mutationer, der regulerer markør genekspression i stedet for celle sundhed13,23. Arrayed CRISPR-formater er også tilgængelige for et-gen pr. brønd screening. Arrayed formater er mere modtagelig for komplekse eller mikroskopi-baserede læse outs. Dog kræver klædt formater automatiseret udstyr og store mængder af reagenser28.

Den screening protokol, der diskuteres her, bruger S. pyogenes Cas9 nuclease til at skabe null alleler, som er den mest udbredte til genetiske skærme, og for hvilke mange biblioteker er tilgængelige (addgene: poolet biblioteker). Alternative muligheder for at knock-out biblioteker er også tilgængelige, som bruger en katalytisk død dCas9 bundet til kromatin modifikator proteiner til at hæmme (CRISPRi) eller aktivere (CRISPRa) transkriptionen af gener. I lighed med RNAi tilbyder CRISPRi evnen til at studere fænotypiske effekter ved forskellige gendoser og essentielle gener, der ikke tåler fuldstændig knock-out, mens CRISPRa kan bruges til at udføre Gain-of-Function-skærme. Hver af disse teknologier har deres fordele, men generelt er CRISPR knock-out-tilgangen den mest udviklede. Det har vist sig at fungere godt med lav støj, minimal off-Target effekter, og eksperimentel konsistens, især i dødelighed-baserede essentielle genskærme, sammenlignet med knock-down tilgange ved hjælp af enten CRISPRi og shRNAs5. På trods af sin omfattende anvendelighed til dato, forbliver CRISPR screening teknologi i sine tidlige stadier. Nye værktøjer er fortsat bygget fra de grundlæggende komponenter i CRISPR. Disse omfatter kombinatoriske gen redigering strategier, der kan målrette flere genomisk loci, optimering af ortogonale CAS-enzymer, og modifikationer med kromatin funktionelle domæner til at diversificere Cas9 aktiviteter. Da CRISPR-teknologien fortsætter med at vokse, vil dens kobling til genetiske screening tilgange fungere som en stærk platform for funktionel opdagelse i genetik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Genome Canada, Ontario Research fund, og de canadiske institutter for sundhedsforskning (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Tags

Genetik CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteker Toronto-knock-out Genome-dækkende CRISPR-screening puljede Drop-out skærme funktionel Genomics essentielle gener celle egnethed spredning
Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K.… More

Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter