Summary
Le sperme doit naviguer avec succès à travers l’oviducte pour fertiliser un ovocyte. Ici, nous décrivons un dosage pour mesurer la migration des spermatozoïdes dans l’utérus hermaphrodite de C. elegans . Ce dosage peut fournir des données quantitatives sur la distribution du sperme dans l’utérus après l’accouplement, ainsi que sur la vitesse, la vitesse directionnelle et la fréquence d’inversion.
Abstract
La fécondation réussie est fondamentale pour la reproduction sexuelle, mais on sait peu de chose sur les mécanismes qui guident le sperme vers les ovocytes dans le tractus reproducteur féminin. Alors que les études in vitro suggèrent que le sperme de fécondation interne des animaux peut répondre à divers indices de leur environnement, l’incapacité de visualiser leur comportement à l’intérieur de l’appareil reproducteur féminin crée un défi pour comprendre la migration des spermatozoïdes et la mobilité dans son environnement natal. Ici, nous décrivons une méthode utilisant C. elegans qui surpasse cette limitation et profite de leur épiderme transparent. C. elegans les mâles colorés avec un colorant mitochondrial sont accouplés avec des hermaphrodites adultes, qui agissent comme des femelles modifiées, et déposent des spermatozoïdes marqués fluorescemment dans l’utérus hermaphrodite. La migration et la motilité du sperme étiqueté peuvent ensuite être suivies directement à l’aide d’un microscope d’épi-fluorescence dans un hermaphrodite vivant. Chez les animaux de type sauvage, environ 90% du sperme étiqueté rampent dans l’utérus et atteignent le site de fertilisation, ou spermatheca. Les images de l’utérus peuvent être prises 1 h après l’accouplement pour évaluer la distribution du sperme dans l’utérus et le pourcentage de spermatozoïdes qui ont atteint la spermatheca. Alternativement, les images Time-lapse peuvent être prises immédiatement après l’accouplement pour évaluer la vitesse du sperme, la vitesse directionnelle et la fréquence d’inversion. Cette méthode peut être combinée avec d’autres outils génétiques et moléculaires disponibles pour le C. elegans pour identifier les nouveaux mécanismes génétiques et moléculaires qui sont importants dans la régulation du guidage du sperme et de la motilité dans l’appareil reproducteur féminin.
Introduction
Les mécanismes moléculaires par lesquels les spermatozoïdes (appelés spermatozoïdes) naviguent dans l’appareil reproducteur féminin vers l’ovocyte ne sont pas bien compris, mais sont fondamentaux à la reproduction sexuelle. La motilité du sperme est très dynamique et dépend des signaux de communication robustes qui modifient la vélocité du sperme et la motilité directionnelle1,2,3,4,5,6 , le 7 , le 8 , le 9 , le 10 , le 11 , 12. C. elegans est devenu un modèle puissant pour étudier le mouvement du sperme in vivo parce que l’épiderme transparent de l’hermaphrodite permet le suivi des spermatozoïdes vivants à la résolution2,3, 8,10. Le but de ce document est de fournir des méthodes pour évaluer le mouvement du sperme dans l’utérus hermaphrodite de C. elegans .
Chez les espèces animales où les spermatozoïdes et les ovocytes se rencontrent dans l’environnement extérieur (c.-à-d. les milieux acquatiques), les spermatozoïdes réagissent aux signaux chimiotactiques sécrétés par les ovocytes. Ces signaux guident la direction du mouvement des spermatozoïdes, les rapprochant de la source de signal4,6,11. Cependant, beaucoup moins est connu sur le mouvement du sperme dans les espèces qui fécondent en interne. Un défi majeur est l’architecture de l’appareil reproducteur féminin, qui est inaccessible à la microscopie chez la plupart des espèces. Les études in vitro chez les humains, les souris et les porcs, par exemple, fournissent des preuves que les sous-populations de spermatozoïdes peuvent réagir aux chimioattractants, au débit de fluide et aux gradients thermiques1,5,7,9, le 12. Avec ces systèmes, l’incapacité de visualiser et de suivre le mouvement du sperme in vivo impose de sérieuses limitations aux stratégies pour découvrir les mécanismes clés régissant ces fonctions.
Pour surmonter ces limitations, nous avons développé des méthodes utilisant le nématode C. elegans pour visualiser directement le sperme après insémination, pour mesurer les paramètres individuels de migration des spermatozoïdes in vivo, et pour mesurer la capacité d’une population de spermatozoïdes à cibler le site de fertilisation. Ces méthodes, avec l’ensemble d’outils moléculaires et génétiques C. elegans , facilitent la découverte des molécules de signalisation chimique et des machines moléculaires qui régulent les comportements de motilité des spermatozoïdes. Par exemple, des écrans génétiques peuvent être menés chez des hermaphrodites ou des mâles pour identifier les gènes qui sont essentiels pour un mouvement efficace du sperme in vivo13. Les molécules peuvent être injectées dans la gonade hermaphrodite pour tester les effets sur l’activation du sperme, la vitesse de migration et la motilité directionnelle3. En outre, les méthodes décrites peuvent être utilisées pour surveiller la migration de spermatozoïdes voyous dans des emplacements de corps ectopique et d’évaluer la compétition de sperme10,14.
C. les elegans existent dans la nature en tant qu’hermaphrodites et mâles (voir figure 1). La gonade hermaphrodite a deux bras en forme de U qui sont des images miroir de l’autre. Au cours du stade larvaire L4, les cellules germinales les plus proximaux (c.-à-d. les cellules près de la spermatheca) subissent une spermèse. Chaque spermatocyte primaire pénètre dans la méiose et produit quatre spermatides haploïdes. Ces spermatides sont poussés dans la spermathèque avec le premier ovocyte mature et subissent la spermiogenèse15. Hermaphrodites adultes passer de la spermonèse à l’oogenèse. Les ovocytes mûrissent dans une chaîne de montage le long de la gonade, avec l’ovocyte le plus mature à l’extrémité proximale de la gonade, à côté de la spermatheca. Les signaux MSP du sperme sont nécessaires pour déclencher la maturation méiotique et l’ovulation16,17. Les mâles C. elegans, d’autre part, ont une gonade en forme de J qui ne produisent que du sperme. Les spermatides sont stockés dans la vésicule séminale. Lors de l’accouplement avec l’hermaphrodite ou femelle, le mâle insère les spicules près de la queue dans la vulve. Les spermatides sont activés pendant l’éjaculation, lorsqu’ils entrent en contact avec le liquide séminal18. C. elegans les spermatozoïdes ne nagent pas car ils ne sont pas flagellés. Au lieu de cela, ils rampent à travers le tractus reproductif, en utilisant le pseudopode pour la locomotion. Il est bien établi que les spermatozoïdes mâles, qui sont de plus grande taille, ont un avantage concurrentiel sur le sperme hermaphrodite14.
Dans cette méthode, les mâles C. elegans agissent comme donneur de sperme et sont accouplés à des hermaprhodites adultes. Les mâles adultes sont colorés avec un colorant mitochondrial fluorescent pour produire des spermatozoïdes étiquetés. Une fois déposé par la vulve hermaphrodite, le sperme doit ramper autour des embryons dans l’utérus vers la spermatheca, ou site de fertilisation. L’épiderme transparent du modèle C. elegans permet la visualisation directe de chaque spermatozoïde individuel lorsqu’il navigue à travers le tractus reproducteur féminin. Au cours des dernières années, notre laboratoire a utilisé avec succès cette méthode pour démontrer l’importance d’une classe de prostaglandines de la série F en guidant le sperme de la vulve à la spermathèque19,20. Les mécanosims moléculaires gouvernant sa synthèse par l’hermaphrodite et la réponse par le sperme sont encore à l’étude. Cependant, cette méthode d’évaluation de la motilité et de la migration des spermatozoïdes facilite grandement l’identification des principaux acteurs qui contrôlent la communication des spermatozoïdes et des ovocytes chez les animaux fertilisants en interne. Le protocole suivant décrit étape par étape comment effectuer ce test.
Protocol
Remarque: toutes les étapes de ce protocole sont effectuées à température ambiante (~ 20-22 ° c) ou dans des incubateurs à température constante, fixés à 16 ° c ou à 20 ° c. Le mâle et l’hermaphrodite C. elegans sont cultivés en utilisant des conditions de culture standard et NA22 ou OP50 E. coli comme source de nourriture21,22. Des hermaphrodites de type sauvage N2 et des mâles Fog-2 (Q71) sont utilisés dans la procédure ci-dessous.
1. jour 1: prélèvement du stade L4 hermaphrodites pour l’accouplement
- Pour obtenir des résultats cohérents, tous les hermaphrodites doivent être synchronisés comme des adultes en reproduction active. Choisir 20-30 étape L4 hermaphrodites à une plaque de 6 cm de croissance des nématodes ensemencés (NGM). Incuber les hermaphrodites à 20 ° c pendant 28-30 h.
Remarque: Seulement 12-15 hermaphrodites seront utilisés pour l’accouplement. Les autres hermaphrodites sont excédentaires.
2. jour 1: coloration des mâles avec colorant mitochondrial fluorescent (Mito-Dye)
- Faire une plaque de coloration masculine en plaçant un point de E. coli (point de nourriture) au centre d’une plaque non ensemencée NGM. Pour faire le point de nourriture, utilisez l’extrémité d’une tige d’agitation en verre pour gratter E. coli de la pelouse de bactéries d’une plaque ensemencée et le déposer sur la plaque non ensemencée. Le point doit être ~ 5-7 mm de diamètre.
- Mélanger 2 μL de 1 mM de Mito-Dye (voir tableau des matériaux) dans le DMSO et 10 μl de tampon M9 (3 g de KH2po4, 6 g de Na2HPO4,5g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H2O à 1 L. Ajouter MgSO4 après autoclavage). Pipetter toute la solution de colorant de Mito sur le point de nourriture sur la plaque de coloration masculine. Laisser sécher la plaque dans l’obscurité (~ 30 min).
Remarque: Mito-Dye est sensible à la lumière. Protégez toutes les solutions, les plaques et les vers contenant la Mito-Dye de la lumière. Conserver le stock de 1 mM à-20 ° c. - Pick ~ 100 1-3 jours vieux mâles adultes23 à la Mito-Dye teinté point de nourriture sur la plaque de coloration mâle. Envelopper la plaque dans une feuille d’aluminium et incuber pendant la nuit à 16 ° c. Pour l’accouplement, utiliser ~ 50-60 mâles par 12-15 hermaphrodites. Si plus de ~ 100 mâles sont nécessaires, faire plus de plaques de coloration pour prévenir le surpeuplement des mâles.
Remarque: Les mâles peuvent également être colorés en incubant dans une solution de 10 μM de Mito-Dye dans le tampon M9 pendant 3 h sur un verre de montre. Gardez les vers couverts pour éviter l’évaporation et l’exposition à la lumière. Après 3 h, utiliser une pipette Pasteur pour transférer les mâles sur une plaque NGM ensemencée de 10 cm. Transférez aussi peu de la solution de Mito-Dye que possible. Envelopper la plaque dans une feuille d’aluminium et incuber pendant la nuit en 16 ° c.
3. jour 2: accouplement
- Choisissez les mâles colorés du jour 1 sur une nouvelle plaque NGM ensemencée. Laisser la plaque dans l’obscurité jusqu’à l’accouplement. Cette étape permet de s’assurer que l’excès de bactéries colorées de Mito-Dye autour des mâles sont enlevés. Le report des bactéries colorées excessives de Mito-colorant sur la plaque d’accouplement peut tacher le tissu hermaphrodite.
- Faire une plaque d’accouplement en déposant 2 μL d’un mélange d' E. coli épais sur une plaque non ensemencée de NGM. Laissez les bactéries épaisses sécher pour faire le point d’accouplement. Les mâles et les hermaphrodites seront transférés sur ce point pour l’accouplement. Pour faire e. coliépais, détournez 3 ml de e. coli pendant la nuit et Resuspendez le culot de bactéries dans 1 ml de M9. Ce mélange peut être conservé à 4 ° c et réutilisé jusqu’à 6 mois.
Remarque: L’épaisseur de la solution E. coli peut être ajustée. Si la solution est trop mince, les mâles peuvent ramper loin du point d’accouplement au lieu d’agréer sur lui pour l’accouplement. Les points d’accouplement fabriqués à partir d’un Soluton E. coli trop épais peuvent diminuer l’efficacité de l’accouplement. - Alors que la plaque d’accouplement de l’étape 3,2 est en cours de séchage, mélanger 300 μL de 1% (p/v) de tricaïne (tri), 300 μL de 0,1% (p/v) de Tétramisole (TET) et 900 μL de M9.
Remarque: Conserver 1% (p/v) de tricaïne et 0,1% (p/v) de Tétramisole comme aliquotes à-20 ° c. Évitez le gel dégel répété. - Transférer 600 μL de la solution TET/tri sur un verre de montre.
- Transférer 12-15 hermaphrodites cueillies le jour 1 à la solution TET/tri dans le verre de montre. Incuber pendant 30 min pour immobiliser les hermaphrodites. Gardez le verre de la montre recouvert pour empêcher la solution TET/tri de s’évaporer.
Remarque: Il est important que les hermaphrodites soient anesthésiés pendant au moins 30 min. moins de temps pourrait entraîner un ver en mouvement lors de l’acquisition d’images, ce qui peut interefere avec l’imagerie. - Pendant l’incubation des hermaphrodites, prélever 50-60 mâles colorés de l’étape 3,1 sur le point d’accouplement (étape 3,2). Rangez la plaque dans l’obscurité jusqu’à l’étape 3,8.
- Après 30 min d’incubation dans la solution TET/tri, utiliser une pipette Pasteur en verre pour transférer les hermaphrodites immobilisées du verre de la montre sur une plaque NGM non ensemencée. Retirer le plus de liquide possible et laisser sécher l’excédent de liquide.
Remarque: Ne laissez pas les hermaphrodites sécher excessivement. Dès que le liquide visible s’est évaporé, commencez l’étape suivante. - Transférer les hermaphrodites anesthésiées de la plaque NGM non ensemencée sur le point d’accouplement avec les mâles colorés. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min pour permettre aux mâles de s’accoupler avec les hermaphrodites.
- Après l’accouplement pendant 30 min, montez immédiatement les hermaphrodites pour l’imagerie Time-lapse ou transférez les hermaphrodites sur une nouvelle plaque NGM ensemencée pour reposer pendant 1 h avant l’imagerie.
Remarque: Les vidéos time-lapse de l’utérus hermaphrodite sont utilisées pour quantifier la vitesse du sperme et la fréquence d’inversion. Des images fixes de l’utérus prises 1 h après l’accouplement sont utilisées pour quantifier la distribution du sperme, ou des conseils de SPEM.
4. jour 2: montage des vers pour la visualisation
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Création d’une plaquette de montage avec 2% d’d’agarose en H2O
Note: 2% d’d’agarose peuvent être faits en vrac, alicités dans des tubes à essai en verre, et stockés à 4 ° c. En cas de besoin, chaque aliquote peut être micro-ondes avant chaque utilisation et stockée dans un bloc de chaleur pour l’empêcher de se solidifier.- Pour faire le pad de montage, alignez trois lames de microscope en verre côte à côte avec les bords longs touchant. Placez deux morceaux de ruban adhésif de masquage sur l’un de l’autre sur les deux glissières extérieures. Ces lames de verre extérieures avec de la bande agira comme le support de sorte que l’épaisseur du PAD d’d’agarose résultant sera "deux bandes profondes".
- Placer ~ 75 μL d’d’agarose fondu de 2% sur la glissière centrale (c’est la diapositive sans bande). Placez immédiatement une nouvelle glissière de microscope en verre sur le dessus de l’agarose. Cette glissière de verre supérieure doit être perpendiculaire aux autres diapositives, chaque extrémité reposant sur la bande des deux glissières de support.
- Laissez l’d’agarose durcir (~ 30 s). Retirez délicatement la glissière de verre supérieure en la glissant hors du PAD d’d’agarose.
- Placer 10-15 μL de la solution TET/tri sur le pad d’d’agarose à 2%. Transférer les hermaphrodites accouplées sur le pad. Prenez soin de transférer le moins de bactéries possible.
- Placez un glissement de couverture sur les vers sur le pad d’d’agarose.
5. jour 2: configuration de l’acquisition d’images
Remarque: Tout miscroscope droit équipé d’EPI-fluorescence, 10x et 60X objectifs, et un appareil photo numérique peut être utilisé pour acquérir des images pour la distribution de spermatozoïdes. Les logiciels capables d’acquérir des images périsées sont nécessaires pour évaluer la vitesse du sperme, la vélocité directionnelle et la fréquence d’inversion.
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Acquisition d’images 1 h après accouplement
- Montez la glissière sur la platine du microscope. Regardez à travers les éléments oculaires pour rechercher des vers sur le pad d’d’agarose en utilisant l’objectif 10x avec le filtre d’émission de fluorescence rouge (filtre TRITC). Une fois qu’un ver a été trouvé, allumez brièvement la lumière de fluorescence pour voir si le ver s’est accouplé. Si le sperme est visible dans l’utérus, passer à l’objectif 60X.
Remarque: La pression créée par l’objectif 60X sur la lamelle peut endommager certains vers fragiles, provoquant l’extrusion de l’intestin ou de la gonade de l’animal. La numérisation pour un accouplement réussi à l’aide de l’objectif 10x peut minimiser l’exposition des vers à la pression supplémentaire. Ne pas exposer les vers à des périodes prolongées de lumière fluorescente. - En utilisant la microscopie de contraste de brouillage différentiel (DIC), positionnez le ver de sorte que la vulve et une spermathèque soient en vue. Concentrez l’image en se concentrant sur le centre de la spermatheca. Vérifiez l’exposition pour les canaux DIC et TRITC. Dans DIC, les structures de ver internes doivent être clairement visibles. Dans le TRITC, le sperme individuel doit être visible en tant que puncta distinct.
Remarque: Chaque image doit capturer l’utérus de la vulve à l’une des spermatheca. Si l’utérus est trop long pour s’adapter à une image, deux images distinctes peuvent être prises. Il n’est pas nécessaire que toutes les images soient prises au même niveau d’exposition. Cependant, il est important que les spermatozoïdes individuels puissent être distingués et quantifiés dans les images de fluorescence. - Acquérir des images DIC et de fluorescence pour chaque utérus.
- Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.3 jusqu’à ce que tous les hermaphrodites ont été imagés.
- Montez la glissière sur la platine du microscope. Regardez à travers les éléments oculaires pour rechercher des vers sur le pad d’d’agarose en utilisant l’objectif 10x avec le filtre d’émission de fluorescence rouge (filtre TRITC). Une fois qu’un ver a été trouvé, allumez brièvement la lumière de fluorescence pour voir si le ver s’est accouplé. Si le sperme est visible dans l’utérus, passer à l’objectif 60X.
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Capturer des vidéos time-lapse
- Scannez le pad d’d’agarose et localisez les hermaphrodites qui contiennent des spermatozoïdes étiquetés dans l’utérus, comme décrit aux étapes 5.1.1 et 5.1.2
- Configurez le logiciel pour acquérir des images Time-lapse dans les canaux DIC et TRITC. En général, les images Time-lapse sont prises à intervalles de 15-30 s pour 10-20 min par utérus.
6. quantification des
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Quantification de la distribution des spermatozoïdes sur les images de l’utérus prises 1 h après l’accouplement
- En commençant par la vulve à une extrémité et la spermathèque de l’autre, divisez l’utérus en tiers. Ceux-ci représentent les trois zones. La zone 1 (Z1) contient la vulve et la zone 3 (Z3) contient la spermatheca.
- Comptez manuellement le nombre de spermatozoïdes dans chaque tiers de l’utérus, et signalez le nombre dans chaque zone en pourcentage du sperme total dans l’utérus entier. Un exemple est fourni ci-dessous.
Remarque: parfois, l’intensité du signal de l’image de canal TRITC doit être ajustée de sorte que chaque sperme qui a été capturé dans l’image peut être visible et quantifiée.
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Suivi du sperme dans les images Time-lapse
Remarque: Dans cet article, nous avons utilisé le logiciel NIS-Elements pour l’analyse. Dans les sections ci-dessous, nous donnons des instructions pour le suivi manuel du sperme à l’aide de ce logiciel (étape 6.2.1) ainsi que le logiciel open source ImageJ/Fiji (étape 6.2.2).-
Suivi du sperme avec NIS-Elements
- Ouvrez le fichier. CD2 avec la série Time-lapse à suivre. Pour commencer le suivi, ouvrez le panneau suivi en cliquant avec le bouton droit sur le logiciel et en sélectionnant contrôles d’analyse | Le suivi.
- Dans le panneau de suivi, sélectionnez définir un nouveau roi. Définissez chaque région d’intérêt (ROI) en cliquant sur chaque sperme qui sera suivi. Une marque colorée apparaîtra sur le sperme sélectionné. Cliquez sur Terminer lorsque tous les rois ont été sélectionnés.
- Une fois que les ROIs ont été identifiés, passez à la trame suivante dans la série Time-lapse. Faites glisser le marqueur de ROI vers la nouvelle position du sperme dans l’image. Continuez jusqu’à ce que le sperme ne puisse plus être suivi. Les lignes pointillées apparaîtront en connectant chacun des emplacements où le marqueur de ROI a été placé à travers toutes les trames de l’image Time-lapse.
Remarque: Seul le sperme dans la zone 2 doit être suivi comme le sperme dans les zones 1 et 3 tendent à se déplacer dans un modèle circulaire, même chez les animaux de type sauvage. - Exportez toutes les données quantifiables (par exemple, longueur de chemin, temps, position XY, etc.) du sperme suivi vers un document Excel en cliquant sur Exporter dans le panneau suivi.
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Suivi du sperme avec Fidji
- Convertissez les images de canal TRITC dans la série Time-lapse en fichiers. TIF. Enregistrez tous les fichiers d’une série dans un seul dossier.
- Importez les images vers Fidji à l’aide de la fonction d’importation BioFormats. Importez des images d’une série Time-lapse comme une seule hyperstack.
- Ouvrez TrackMate dans Fidji24 via plugins | Suivi | Suivi manuel avec TrackMate. Une boîte de diaglogue s’ouvrira.
- Sélectionnez l’outil TrackMate dans la barre d’outils Fiji. Double-cliquez sur le sperme qui sera suivi. Un cercle vert avec des lignes pointillées apparaîtra. Ce cercle peut être repositionné en cliquant à l’intérieur du cercle et en le faisant glisser jusqu’à la position souhaitée. La taille de ce cercle peut être modifiée en appuyant simultanément sur la touche ALT et en faisant défiler la souris.
- Une fois que la taille et la position du Tracker ont été définies, cliquez sur le cercle à nouveau. Les lignes vertes pointillées se transformeront en une ligne verte solide. Appuyez simultanément sur les touches MAJ et L pour activer le mode de suivi. Cela sera indiqué dans la barre d’outils Fidji.
- Passez à la trame suivante dans la série Time-lapse. Pour définir le nouvel emplacement du sperme suivi dans le nouveau cadre, passez la souris sur le nouveau point et appuyez sur la touche A . Le Tracker apparaîtra maintenant au nouvel emplacement, et une ligne apparaîtra en connectant les emplacements où le Tracker a été placé dans les images précédentes.
- Une fois les suivis terminés, cliquez sur analyser dans la boîte de dialogue TRACKMATE pour générer les données nécessaires.
- Pour calculer la vitesse, divisez la longueur totale du trajet du sperme par le temps écoulé.
- Pour calculer la vélocité vectorielle, tracer une ligne à travers l’utérus à partir de la vulve pointant vers la spermatheca. Mesurez la distance que le sperme a migré le long de cette ligne, du début à la fin de la trace. Divisez cette distance par le temps écoulé. Les valeurs négatives indiquent que le sperme a migré loin de la spermatheca.
- Pour enregistrer la fréquence d’inversion, comptez le nombre de fois où la trace du sperme a généré un angle inférieur à 90 ° pendant trois trames consécutives de laps de temps.
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Suivi du sperme avec NIS-Elements
Representative Results
Pour générer les résultats décrits dans cet article, les mâles Fog-2 (Q71) ont été souillés avec le colorant Mito et accouplés à des hermaphrodites de type sauvage, N2. La figure 2 fournit un schéma global pour la méthode, y compris la préparation du ver, l’accouplement et l’analyse. Comme le montre le film 1 , le tractus reproducteur hermaphrodite adulte a deux bras qui sont des images miroir de l’autre. Lors de l’accouplement, des spermatozoïdes étiquetés sont déposés dans l’utérus hermaphrodite par la vulve. Le sperme se déplace autour des embryons en développement dans l’utérus vers la spermatheca, où ils sont stockés jusqu’à la fécondation. Comme les cellules germinales dans l’hermaphrodite adulte se développent en ovocytes, l’ovocyte proximal, le plus mature est poussé dans la spermathèque par des contrations de cellules de gaine. La fécondation se produit pendant que l’ovocyte est dans la spermatheca.
Pour quantifier la distribution et la migration des spermatozoïdes à travers le tractus reproducteur féminin, l’utérus hermaphrodite est divisé en trois zones (film 1, figure 3A). La zone 1 couvre le premier tiers de l’utérus, à partir de la vulve. La zone 2 s’étend sur le tiers médian de l’utérus, et la zone 3 s’étend sur le dernier tiers de l’utérus et comprend la spermatheca. Un bon guidage du sperme à l’aide de mâles de type sauvage, de N2 hermaphrodites et de Fog-2 (Q71) devrait entraîner environ 90% du sperme étiqueté atteignant la spermatheca, ou la zone 3 (figure 3b). Les accouplements qui résultent en trop peu (figure 3C, moins de 10-15 spermatozoïdes) ou trop nombreux (figure 3D, utérus rempli de sperme) spermatozoïdes dans l’utérus ne doivent pas être comptés. Dans les accouplements qui entraînent moins de 10-15 spermatozoïdes, 3-4 spermatozoïdes voyous peuvent fortement fausser les données. De même, lorsque l’utérus est complètement rempli de spermatozoïdes, le sperme ne peut pas migrer convenablement. Le sperme peut sembler dispersé dans l’utérus de certains mutants qui présentent un mauvais phénotype de guidage du sperme. Cependant, dans ce cas, le sperme ne doit pas remplir chaque crevasse de l’utérus, comme on le voit dans la figure 3D. La quantification de chaque bras de la gonade est considérée comme un échantillon, ou un n.
Des images Time-lapse sont prises pour quantifier la vitesse du sperme et la fréquence d’inversion. Seuls les spermatozoïdes de la zone 2 doivent être suivis (figure 4a), car les spermatozoïdes des zones 1 et 3 (film 1) tendent à se déplacer dans un motif circulaire, même chez les animaux de type sauvage. Les images de LASPE de temps prises à des intervalles de 15-30 s sont habituellement utilisées pour suivre le sperme. Seuls les spermatozoïdes qui peuvent être suivis dans des trames consécutives pendant plus de 2.5-3 min sont quantifiés. Dans la figure 4b-M, le sperme marqué par les points rouges et bleus satisfait à ce critère, tandis que le sperme marqué par le point vert ne le fait pas. Par conséquent, les valeurs définies dans la figure 4N sont quantifiées pour le sperme marqué par les points rouges et bleus (figure 4o), tandis que celles pour le sperme marqué par le point vert n’ont pas été quantifiées.
Figure 1: dessin animé de l’adulte C. elegans hermaphrodite et mâle. Les principales structures de reproduction sont étiquetées dans la figure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: schéma schématique de la préparation des échantillons et de l’acquisition des données. Les mâles colorés avec la Mito-Dye sont accouplés à des hermaphrodites adultes synchronisés. Des images Time-lapse de hermaphrodites accouplées sont prises immédiatement après l’accouplement pour capturer des données pour la vitesse du sperme et la fréquence d’inversion. Des images fixes d’hermaphrodites accouplées sont prises 1 h après l’accouplement pour évaluer la distribution du sperme dans l’utérus. Référez-vous au texte pour plus de détails. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: quantification de la distribution des spermatozoïdes dans l’utérus hermaphrodite. (A). schéma de l’utérus hermaphrodite de C. elegans . V = vulve, E = embryon, S = spermatheca, O = ovocyte, Z1-Z3 = zones 1-3 utilisées pour mesurer la distribution du sperme. (B-D). DIC + TRITC a fusionné (panneaux de gauche) et TRITC seulement (panneaux de droite) des images de l’utérus hermaphrodite de type sauvage 1 h après l’accouplement à Fog-2 (Q71) mâles colorés avec le Mito-Dye. Les spermatozoïdes apparaissent en rouge. Les contours jaunes indiquent l’emplacement de la spermatheca. Barre d’échelle: 20 μM. La quantification Z1, Z2, Z3 en B représente le pourcentage de spermatozoïdes dans chaque zone ± écart type. Les images en c et en d représentent des accouplements qui ont entraîné une trop faible (c) ou un trop grand nombre (d) de spermatozoïdes pour la quantification. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: quantification de la vitesse du sperme et de la fréquence d’inversion pendant la migration à travers l’utérus. (A). dic + TRITC A fusionné l’image d’un utérus hermaphrodite contenant du sperme fluorescent (rouge). V = vulve, jaune = spermatheca, Z1-Z3 = trois zones de l’utérus, boîte noire: zone 2. (B-M). Les images du canal TRITC en accéléré se sont agrandies sur la zone 2 (boîte noire en A). Les images ont été acquises à des intervalles de 20 s. 3 spermatozoïdes individuels ont été suivis dans chaque image (points rouges, verts et bleus). Les points colorés dans le panneau M représentent le chemin de chaque sperme de B-L. Barre d’échelle = 20μm. (N). équations et définitions pour la vitesse du sperme, la vitesse vectorielle et la fréquence d’inversion. (O). vitesse, vélocité vectorielle et fréquence d’inversion du sperme suivi dans les panneaux B-L par les points rouges et bleus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1: film de mouvement du sperme et de la migration. Un type sauvage hermaphrodite a été accouplé à Fog-2 (Q71) mâles colorés avec Mito-Dye. Le film est un composite d’images Time-lapse prises à des intervalles de temps variés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
Discussion
La capacité du sperme à naviguer dans le tractus reproducteur féminin et à trouver des ovocytes est critique pour la reproduction sexuelle. Des études récentes utilisant le sperme d’animaux fertilisants internes suggèrent qu’ils réagissent activement à divers indices environnementaux, y compris les signaux chimiques, le débit de fluide, et les gradients de température1,5,7, le 9 , 12. Cependant, ces observations ont largement résulté d’expériences in vitro et on sait peu de chose sur le comportement et la communication des spermatozoïdes au sein de l’appareil reproductif. L’un des principaux obstacles à l’acquisition de données in vivo sur la migration et la motilité des spermatozoïdes est le manque de visibilité dans la plupart des secteurs reproducteurs féminins. La méthode que nous avons décrite ici en utilisant C. elegans surpasse cette limitation. Comme le démontrent les résultats représentatifs, l’épiderme transparent permet la visualisation directe et le suivi de chaque spermatozoïde à la résolution d’une seule cellule dans un organisme vivant et intact.
C. elegans a deux sexes. Les mâles, avec un génotype XO, ne produisent que du sperme, et dans cette méthode, sont utilisés comme donneurs de sperme. Les hermaphrodites, avec un génotype XX, sont des femelles modifiées. Leurs gonades subissent d’abord la spermgenèse pendant le quatrième stade larvaire et passent à l’oogenèse à l’âge adulte25. Ce dosage utilise des hermaphrodites adultes, dont les tissus reproducteurs fournissent un modèle pour le tractus reproducteur féminin. L’utilisation des deux sexes dans ce dosage nous permet d’identifier les voies génétiques et moléculaires chez les mâles et les femelles qui peuvent réguler le guidage du sperme et la motilité. Combinée à l’ensemble des techniques génétiques et moléculaires disponibles pour C. elegans, cette méthode peut conduire à de nouvelles connaissances sur la migration et la motilité du sperme ainsi que sur la communication des spermatozoïdes et des ovocytes.
Quelques étapes cruciales de ce protocole justifient un examen plus approfondi, en plus des détails fournis dans la section du protocole.
Vers
les mâles mutants Fog-2 (Q71), him-5 (e1490)ou him-8 (e1489) peuvent être utilisés à la place des mâles N2. Ces mutations augmentent la fréquence des mâles dans les cultures, mais n’affectent pas les fonctions mâles d’accouplement ou de sperme13. Les femelles, comme les femelles Fog-2 (Q71) , peuvent être utilisées à la place des hermaphrodites. Cependant, les femelles doivent être préaccouplées avec des mâles pour permettre un développement adéquat des ovocytes. La présence d’embryons fertilisés de ce pré-accouplement assure également que l’utérus est assez long pour évaluer correctement la distribution du sperme. Si des hermaphrodites mutants ou expérimentaux sont évalués, inclure un ou des groupes témoins. Par exemple, les hermaphrodites mutantes doivent être appariées avec des hermaphrodites de type N2 comme un contrôle pour d’autres variables dans le dosage. Les hermaphrodites qui ont été nourris avec des bactéries contenant des plasmides pour les essais d’interférence d’ARN devraient également être nourris avec des bactéries contenant le contrôle vectoriel vide. La distance de la vulve, où les spermatozoïdes sont inséminés, à la spermatheca, le site de fertilisation, peut varier en fonction du nombre d’oeufs dans l’utérus (c.-à-d., l’utérus se développe avec le nombre croissant d’oeufs). Si des comparaisons entre les génotypes sont faites, sélectionnez hermaphrodites dont l’utérus contient un nombre similaire d’oeufs. Ne pas sélectionner les hermaphrodites contenant des embryons à couver ou des larves en mouvement. Un cours de temps peut être effectué pour identifier l’âge optimal auquel les hermaphrodites doivent être analysés.
Cueillette des hermaphrodites et des mâles
Il est important que les hermaphrodites choisies pour ce dosage ne proviennent pas de plaques surcultivées ou affamées. Les signaux alimentaires et de phéromone modulent l’expression de DAF-7, un homolog TGFß. La voie DAF-7 a été montré réglementer la synthèse des prostaglandines de la série F qui jouent des rôles importants dans le guidage du sperme à la spermathèque20. La cueillette des hermaphrodites à partir de plaques surpeuplées ou affamées peut entraîner un mauvais guidage du sperme non lié à la cible d’intérêt. La densité des plaques ne semble pas affecter le sperme mâle. Cependant, les mâles qui sont trop jeunes ou trop âgés peuvent entraîner une diminution de l’efficacité de l’accouplement (c.-à-d. le pourcentage d’hermaphrodites sur la plaque d’accouplement qui ont suffisamment de spermatozoïdes dans leur utérus pour quantifier). les mâles adultes âgés de 1-3 jours sont optimaux pour ce dosage23.
Anesthésiant hermaphrodites
Dans nos mains, la combinaison Tetramisole et tricaïne garantit que les vers sont immobilisés et restent vivants pendant l’accouplement et l’acquisition d’images. D’autres anesthésiques, comme l’azide de sodium, peuvent également être utilisés. Cependant, l’azide de sodium est hautement toxique et les conditions doivent être normalisées. Les techniques d’immobilisation utilisant des microbilles, des agarose et des chambres microfluidique ne sont pas recommandées car elles interfèrent avec l’accouplement.
Coloration masculine
Le Mito-Dye utilisé dans ce manuscrit, MitoTrackerCMXRos, a été largement utilisé pour l’étiquetage des spermatozoïdes, ainsi que d’autres mitochondrie, dans C. elegans. Le sperme étiqueté avec ce Mito-Dye est entièrement fonctionnel, conservant sa capacité à être activé, migrer, fertiliser les ovocytes et produire des descendants viables26,27. D’autres colorants mitochondriaux, tels que la rhodamine 6G et le DiOC6 ont été utilisés pour colorer C. elegans mitochondries28,29. Cependant, les conditions pour ces colorants doivent être normalisées pour l’étiquetage des spermatozoïdes dans ce dosage. En plus des mécanismes d’étiquetage mitochondrial, des taches d’ADN, telles que Syto17, peuvent également être utilisées pour étiqueter le sperme pour les essais de migration30. Bien que ces techniques d’étiquetage soient relativement faciles et rapides à réaliser, des stratégies transgéniques peuvent également être employées pour générer des spermatozoïdes qui expriment des étiquettes fluorescentes sous les promoteurs spécifiques du sperme31,32.
accouplement
Les points d’accouplement trop épais peuvent diminuer l’efficacité de l’accouplement. Il faut prendre soin de transférer le moins de bactéries possible lors du transfert des mâles et des hermaphrodites anesthésiés sur le point d’accouplement.
Faire des tampons d’d’agarose et placer le feuillet de couverture
Des bulles d’air peuvent être générées dans les tampons d’d’agarose. Ils peuvent réagir la lumière pendant l’acquisition de l’image ou, lorsqu’ils sont assez grands, provoquer la chute des vers, rendant impossible l’acquisition de l’image (s). De même, des bulles d’air peuvent être créées le long des hermaphrodites lorsque le feuillet de couverture est placé sur eux sur le pad d’d’agarose. Ces bulles réforment la lumière et conduisent à une qualité d’image diminuée. La pratique aidera à diminuer l’occurrence des bulles d’air.
Quantification
Lors de la quantification de la distribution des spermatozoïdes, différents plans z à travers l’utérus d’un ver peuvent avoir de légères différences dans la distribution des spermatozoïdes. Nous constatons que la prise d’une image unique axée sur la spermathèque nous donne des résultats reproductibles qui sont semblables aux résultats obtenus par la moyenne de plusieurs sections z. Nous recommandons de concentrer l’image sur le centre de la spermatheca, mais les plans focaux peuvent être légèrement modifiés en fonction des besoins de l’expérimentat. Il est cependant essentiel que toutes les images soient prises de la même manière. En outre, il est important que seuls les spermatozoïdes qui sont en discussion sont comptés. C’est la discrétion du comptoir dans la détermination des critères de mise au point du sperme. Cependant, il est essentiel que les critères soient appliqués systématiquement à chaque ver quantifié. Pour le suivi des spermatozoïdes, de nombreux logiciels offrent des capacités de suivi automatique. Cependant, nous constatons que le suivi manuel surpasse l’algorithme de suivi automatique du logiciel pour deux raisons principales: 1) l’abondance de noyaux de taille similaire dans l’espace confiné rend difficile pour le logiciel de distinguer entre les spermatozoïdes individuels et créer des ROIs définis pour chaque sperme. 2) comme le sperme entrer et hors de focus, leurs intensités se déplacent, ce qui rend difficile pour le logiciel de garder une trace du sperme sur de longues périodes de temps.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement notre regretté mentor, le Dr Michael Miller, pour son mentorat inspirant et désintéressé et la création de cette méthode comme un outil pour mieux comprendre la communication de spermatozoïdes et d’ovocytes. Sa disparition soudaine a été une perte énorme pour sa famille, son laboratoire, et la communauté scientifique. Cette étude a été soutenue par les NIH (R01GM085105 à MAM et F30HD094446 à MH). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Material | |||
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
| Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
| N2 | CGC | N2 | |
| fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
| Platinum wire 0.25 mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
| 5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Watch glass | Fisher | 02-612A | |
| 5 mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
| MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20 °C |
| Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
| Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C. |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20 °C |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
| Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 16 °C and 20 °C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
| Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
| Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
| Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |
References
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