使用自动训练器评估小鼠的熟练前向

Summary

评估培训对运动技能的影响的方法是一个有用的工具。不幸的是，大多数行为评估可能是劳动密集型和/或昂贵的。我们在这里描述了一种机器人方法，用于评估小鼠的自理（达到-抓握）技能。

Abstract

我们描述了一种将天真的老鼠引入一种新颖的自命不及（达到把握）任务的方法。老鼠单独安置在笼子里，有一个正面槽，允许老鼠伸出笼子，取回食物颗粒。最小食物限制用于鼓励小鼠从槽中取回食物。当老鼠开始联想到槽里吃食物时，颗粒被手动拉开，以刺激爪子的延伸和刺激，通过正面槽抓住和取回颗粒。当小鼠到达槽时开始接触颗粒时，行为测定可以通过测量它们成功抓住并检索所需颗粒的速率来执行。然后，它们被介绍给一个自动训练器，自动为鼠标提供食物颗粒的过程，并记录成功和失败的到达和把握尝试。这允许以最小的工作量为多个小鼠收集到达数据，并酌情用于实验分析。

Introduction

实验测试运动技能前神经损伤和后神经损伤以及调整运动训练的时间、数量和类型的方法对转化研究具有重要意义。在过去的十年里，由于遗传操作的易用性，小鼠已经成为一种流行的模型系统，可以阐明损伤前和损伤后的运动学习机制。然而，小鼠的行为检测没有像其他哺乳动物（尤其是大鼠）那样得到优化。此外，老鼠和老鼠的行为之间有重要的区别，这强烈地暗示了以不同方式训练这两个^{物种1，2。}

熟练的前体运动使用手/爪将食物放入嘴里，操纵物体，或使用工具。事实上，伸手去掌握日常生活中的各种物体是上肢的基本功能，而伸手可吃的行为是许多哺乳动物使用的一种自我控制形式。许多遗传、生理和解剖学的变化，支持前恒技能的获取，已经在^领域3中得到了很好的定义。在将临床前发现转化为临床结果时，需要一个高效且可重复的相关测试。对啮齿动物和人类接触的研究表明，在人类^和动物中，习性行为是相似的。因此，这些相似性表明，前体测试可以作为研究运动学习以及人类疾病损伤和治疗的翻译模型。因此，评价小鼠的发病可以为研究健康和^{疾病状态的}转化研究提供强有力的工具。

不幸的是，老鼠的先验任务，即使是小规模的实验室设置，可能既费时又费时。为了缓解这个问题，我们在这里描述一个自动版本的预处理任务。所述任务要求小鼠通过小鼠的家笼正面槽伸出一只爪子，将延长的爪子拉上，抓住食物颗粒奖励，并将颗粒拉回笼子内部食用。所得数据以成功或失败的形式呈现。这种自动化成功地记录了数据，并减轻了研究人员必须承担任务的负担和时间。

Protocol

此处描述的所有方法均已获得约翰霍普金斯大学ACUC（动物护理和使用委员会）的批准。

1. 准备鼠标笼子供使用

1. 从每个保持架前端的底座创建宽度为 0.8 厘米和 7 厘米高度的开槽开口，如图1所示。这个槽作为动物到达的开口。
   注：自动训练器专为大多数动物研究用品供应商提供的标准小鼠笼尺寸（如图1所示）而设计。此外，自动培训器将可轻松支持其他保持架类型。
2. 在每个单独的笼子内，在槽旁边添加一个平台，让老鼠站立并到达呈现的颗粒。确保平台位于笼子垃圾地板上方，高度约为 3 厘米。使用用超级胶水粘贴的培养皿，用约 10 厘米 x 15 厘米的金属板盖住，但是，任何足够大的平面足够大，让鼠标站立即可到达。
3. 通过笼子前部中间创建一个垂直切口，宽 0.8 厘米，高 7 厘米，让鼠标从笼子中伸出爪子。
4. 从一块薄薄的金属片（约2毫米厚）切割一个笼门成矩形，尺寸为5厘米x10厘米，作为动物通过它到达的统一开口。
   注：老鼠可能会咀嚼塑料笼子，这将改变开口的大小。在使用胶带进行测试期间，当金属笼门被放置在笼子的开槽开口上时，鼠标将穿过这个 0.8 厘米的槽，保持笼子之间的槽的有效宽度。
5. 当鼠标未经过测试以防止垃圾从笼子中排出时，用胶带盖住每个笼子的插槽。

2. 将小鼠引入到达运动

1. 记录每只鼠标的起始重量，并计算该值的 85% 以查找其目标权重，如果结果较小，则舍入至 20 g。给他们一个喂食制度，让他们，然后保持这个目标的重量。
   1. 第一天给每只老鼠2.5克的颗粒，并在24小时后注意其重量的任何变化。
      注：每天称一次小鼠体重，预计每天体重下降0.25-1克。
   2. 根据需要更改每只小鼠的每日进给量，根据初始变化和每只小鼠体重的持续变化，以诱导逐渐减肥（每天减少 0.8 克以下），然后保持最终的目标重量。每天在三到六个 500 毫克颗粒（1.5 至 3.0 g）之间变化，以有效。
      注：小鼠保持这种饮食，以保持他们的目标体重在整个协议。
2. 当鼠标达到目标重量时，将每只鼠标引入到门槽上进行补充食物颗粒的概念。在球粒表面（直接位于槽前）放置 45 mg 颗粒，然后让每只鼠标取回训练。大多数小鼠将在1-2天内采取这种喂养安排。
3. 一旦鼠标将一个打开的槽与喂食，鼓励他们接触用爪子，而不是嘴。
   注意：这是最复杂的步骤，需要1-2天，在老鼠身上误入反作用是很容易的;有关详情及建议，请参阅讨论部分。
   1. 使用一对钳子，将颗粒放在鼠标以前取回的颗粒的相同位置。当鼠标开始咬取颗粒时，将其拉开约半厘米，使颗粒无法到达其嘴。
      注：鼠标在其目标重量将尝试检索无法触及的颗粒。每当鼠标伸出爪子通过槽，加强这种行为，允许它吃颗粒。有些老鼠在伸展食物时，可能表现出对一只爪子比另一只爪子的偏好。
   2. 虽然对实验没有帮助，但记录左爪或右爪是否优先。这可能允许在行为测定中提高总体成功率;或者，通过强迫每只鼠标用同一个爪子到达来消除一个变量。
      注：如果小鼠使用它们喜欢的爪子，则获得更好的结果。
   3. 由于每只小鼠将爪子伸出与吃颗粒联系在一起，因此通过抑制颗粒以响应试图用嘴和舌头取回颗粒来进一步强化这种行为。老鼠将在2至3天内开始遵守这一安排。
   4. 通过将 45 mg 颗粒放置在离笼门外边缘仅 1 厘米以下的位置，从而确定所需爪子到达行为的引入，以便颗粒的最左侧或最右侧点（无论是从调查员提供的笼子槽的右侧还是左侧）的透视（分别）与从网箱门槽边缘直接伸出的线相切。允许鼠标尝试检索颗粒，警惕删除颗粒，并防止其消耗，如果鼠标应该尝试一些其他方法比爪扩展。
      注：当鼠标始终伸出爪子抓住并能够触摸提供的颗粒时，它可以使用下面描述的自动训练器和相关的行为检测进行测试。从天真的介绍到准备的时间会有所不同;如果有需要两周以上才能理解的流器，则应从数据集中排除它们。

3. 使用自动培训器

注：有关自动培训师的硬件、软件和物理操作的完整说明，请参阅图 1-3和讨论部分。

1. 准备培训课程。
   1. 校准诱饵颗粒传感器。单击 LabVIEW 界面中的运行箭头，并注意诱饵颗粒传感器在有颗粒和无颗粒到位的情况下读取读数。单击"停止"按钮以停止此测试运行，并将诱饵颗粒传感器目标更改为这两个读数之间的值（图 3和表 2）。大多数照明条件提供介于 1 和 4 之间的读数。
   2. 将修改后的鼠标保持架放在自动训练器上 （图 2）。将保持架门固定（图1），并将颗粒与槽边缘对齐，就像手动步骤一样。
2. 使用 LabVIEW 界面运行鼠标的定型会话。
   1. 根据需要输入信息以记录有关培训课程的数据（图 3和表 2）。
      1. 单击"鼠标 ID"字段，使用计算机的键盘键入每个训练会话的文件名。
      2. 单击"常规期间要分配的总颗粒"，以控制单个实验（通常为 20 - 30）分配多少粒。为此，请单击向上和向下箭头或使用计算机键盘输入数字。
      3. 单击"球后暂停"字段，在从跳板中取出指示的颗粒后设置 5 s 暂停。为此，请单击向上和向下箭头或使用计算机键盘输入数字。
      4. 单击"暂停长度"字段，在从跳板上取出颗粒与分配新颗粒的时间之间设置暂停。为此，请单击向上和向下箭头或使用计算机键盘输入数字
         注： 通常 1 s 是适当的暂停时间。如果每次颗粒分配后小鼠焦虑，建议使用暂停长度字段将暂停长度增加到 5 s。
      5. 手动记录颗粒放置在"到达距离"字段中的距离。为此，请单击向上和向下箭头或使用计算机键盘输入数字
         注：加速和时间数组的大小公开用于调试目的，可能会忽略。
      6. 单击"文件夹以包含日志"字段以选择文件位置以保存收集的数据。
      7. 填写信息字段后，单击"运行"按钮开始培训课程。自动训练器将分配单个颗粒，并跟踪它们是否通过漏斗，直到分配颗粒总数，并且鼠标已检索或丢弃最后一个颗粒。此时程序将自动停止。如有必要，也可以通过单击"停止"按钮提前停止。
   2. 设置软件后，将鼠标的家庭笼子放在底座上进行测试，观察鼠标，以便测量鼠标是否确实学会了尝试所需的新颖到达行为。单击"运行"按钮后，允许鼠标调查插槽及其不熟悉的新环境。
      注意：与将小鼠引入接触的概念类似，希望有些小鼠比其他小鼠更合规。已经掌握了这个概念的老鼠应尽量在5-10分钟内达到，并将自动训练器的运动与呈现的颗粒联系起来，就像它们在本协议的初始阶段将未覆盖的槽与食物相关联时一样。

Representative Results

通常，建议每个训练单元包含大约 20-30 个试用单元，这些试验可能由用户设置，由自动培训器自动运行，并每节和鼠标保存到单个日志文件中。每个试验可以连续运行，就在其他试验之后，暂停 2-5 s。在自动训练器上训练的老鼠在 10 次训练中表现出技能的提高。

为了将自动训练器的效用与手动训练（被认为是黄金标准）进行比较，我们手动使用自动训练器培训了 100 到 140 天的成年雄性 C57bl/6 小鼠。所有动物的处理和使用均根据约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会进行，并获得批准。与自动训练师一起训练的老鼠学习了预处理任务，并表现出运动技能的明显增加（图4）。这种技能的增加类似于在不使用自动训练器的情况下手动训练动物时所看到的（图4）。对于这些数据，当鼠标通过狭缝到达前肢，抓住颗粒，并吃了它，没有敲它，从它的休息空间，下降它，或任何其他方式失去控制，手动捕管被评分为成功。成功进行内塞尝试的百分比是确定每个颗粒的。训练块由30个颗粒组成，距离为1厘米，每次一粒。在自动训练器上训练的老鼠根据上述协议接受培训。图 4中的每个点表示一天的训练，在此期间，动物达到 30 粒，并绘制成正确百分比。使用非参数 t 检验法对多个比较进行校正的两条线之间没有统计差异。

图1：家庭笼子的范例照片。（A） 标准家庭笼子的鸟瞰图，该标准家庭笼子与平台（橙色）和笼子正面的插槽一起修改。（B） 家庭笼子的前视图，其开槽开口约0.8厘米 x 7厘米（C）笼门，从一块细金属片上切出，用胶带包裹，以保护边缘。（D， E） 放在插槽前面的笼门，作为鼠标到达的统一开口;提供的正面 （D） 和斜 （E） 意见.请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:自动培训师的范例图片。（A， B）图为自动训练器没有 （A） 或 （B） 改装的鼠标笼。（C-J）潜水板食品颗粒架设计的详细视图，要么从前面（C，D，H，I）或从侧面（E，F，G，J），与（D，E，F，I）或没有（C，G，H，J）食物颗粒。请注意，与动物的颗粒距离很容易被修改，因为从潜水板的笼子距离是可修改的。请点击此处查看此图的较大版本。 

图 3：软件的屏幕截图。用于运行自动培训器的程序的屏幕截图。该图显示了协议中描述的重要输入字段。有关进一步说明，请参阅表 2。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4: 代表性数据.使用自动训练器和手动训练模式，熟练的培养功能会增加到类似的高原水平。图显示了达到把握的成功（平均 +/- SEM;手动：灰色，n = 14;自动训练器：黑色，n=15）。请点击此处查看此图的较大版本。

步	估计持续时间（以天）	评论
2.1 减肥	3 到 5	取决于体重，因此，在目标之前要减掉多少体重
2.2 插槽培训	1	老鼠学会在接近食物的空隙时感到可口
2.3 整形	4 到 8
2.3.1 爪子使用	1	这里的成功取决于在老鼠之后快速提供颗粒，拒绝它的食物，为颗粒提供桶。
2.3.2 爪偏好	1	确定鼠标是喜欢左爪还是右爪。
2.3.3 减少坏爪子的使用	2 到 3	与前一步一样，防止用嘴和舌头进行检索至关重要。
2.3.4 钳子	1	有些老鼠会绊倒自己取颗粒，而不是从钳子中，少吃一点。
3. 自动培训	10 到 15	数天，直到阿倒乌姆托特。

表 1：使用自动培训器进行鼠标训练的时间表。

输入字段	使用
鼠标 ID	输入将保存收集的数据的文件名。
常规期间要分配的总颗粒	输入训练期间将分配的颗粒总数。
球丸编号后暂停	已弃用函数。可用于在分配指定颗粒后暂停训练会话。
暂停长度（s）	暂停持续的时间长度。
到达距离（毫米）	记录鼠标必须到达的最小距离以上以取回颗粒。默认情况下为零。
加速度计和时间数组的大小	为调试目的公开的功能。保持默认值 500。
文件夹以包含日志	单击文件夹图标以选择收集的数据保存位置。
设备名称	将硬件连接到软件的 LabVIEW 功能。默认为 Dev1。根据 USB 连接，硬件可能会出现在另一个号码下的下拉菜单中;因此，硬件可能会显示在下拉菜单中。选择设备，直到一个工作。
箭头按钮，左上角	单击以运行程序，无论是用于培训课程还是校准。
停止标志按钮，左上角	过早停止程序。

表 2：软件接口。

Discussion

我们的自动培训师以自动的方式评估前肢的伸向（前肢）。为了实现这一端点，许多专为小鼠捕集任务设计的参数，包括颗粒放置、颗粒大小和训练标准，已迭代数年，并根据以前的协议^{2、5进行修改，6}.这里的进步是使用机器人实现任务的自动化，该机器人允许家庭笼式外壳。家庭笼外壳使小鼠保持平静，以更少的焦虑执行任务。非家庭笼训练与压力增加有关，这可能导致时间增加和精度降低7，8，9。我们在这里展示的精度类似于我们自己的结果与手动家庭笼训练5，7，8。虽然家笼训练存在^大鼠10，据我们所知，这是第一个自动训练器，利用训练鼠在他们的家笼。

我们的自动训练器包括一个可调节的平台，可调节的支架上，有一个开槽的保持架，可以降低或提升到适当的高度，以便与食品颗粒支架（也称为潜水板）对齐。颗粒分配系统将食物颗粒放在潜水板支架上。食品颗粒保持器具有诱饵颗粒传感器组件，该组件由反射物传感器组成，用于检测潜水板支架上是否存在食物颗粒。由于光敏度问题，反射物体传感器可在安装时进行校准，以适应实验室的照明环境。每个鼠标的笼子都放置在自动训练器上，使颗粒的内边缘与保持架门槽的外边缘一致，与上述手动步骤 2.3.4 相对应。两个丢失的颗粒传感器方向相反，位于潜水板弹丸架下方的漏斗中，可检测掉落的颗粒。采用两个丢失的颗粒传感器的一个好处是，它确保不同尺寸和形状的各种食品颗粒的高检测精度。两个丢失的颗粒传感器由标准透射光中断器组成，具有通孔设计，无需接触即可感应掉落颗粒的运动。

该软件由运行自动培训程序的程序组成，并收集有关成功和失败的数据。用户输入包括记录数据的文件位置、在一次训练会话中分配多少粒，在分配特定颗粒后暂停训练会话的选项，记录其距离增加（如果有）的字段鼠标必须到达，并一个字段来控制程序计算中使用的数组大小（在正常使用期间可能会忽略）。此外，该软件使用户能够调整潜水板的反射物体传感器，以便根据需要重新校准光灵敏度。每个试用项的输出会向用户显示，并记录并保存在日志文件中，以供以后检索。

单个试验包括单个食物颗粒在跳板上花费的时间，直到通过鼠标操作将其移除。如果颗粒离开由诱饵颗粒传感器确定的潜水板，并且颗粒在不久后被任何丢失的颗粒传感器检测到从漏斗中掉落，则软件会将其记录为失败的试用。如果诱饵颗粒传感器确定颗粒离开潜水板，但任何一个丢失的颗粒传感器均未检测到掉落的物体，则假定该颗粒已被鼠标拉入笼子，并被视为成功试验。

使用此公式是因为它有助于设计一种行为测定，其中直接执行的任务而不是间接地提供奖励。这样，动物方面对于任务是什么（例如，饥饿、寻找食物、获取食物、吃食物）没有歧义。在利用这种范式的许多任务中，这种评估的任务已经变得相当受欢迎。这项任务只是要求动物使用单肢来达到和抓住一个食物，动物随后将食物带到嘴里食用。先合任务评估的行为与许多哺乳动物使用的日常行为非常相似。最重要的是，预处理任务类似于人类的运动^行为4。这种概括性增强了从行为的临床前评估中得出的原则在临床上适用于疾病状态的期望。例如，在中风、亨廷顿舞蹈症、帕金森病和多发性硬化症中，熟练前肢和手部使用方面的损伤可见一斑。因此，模拟小鼠的行为缺陷和随后的恢复对于理解人类的恢复^{以及如何鼓励它}进行实验是无价^的。

本文提出的自动培训器的许多方面大大有利于研究过程。首先，大多数行为检测要求实验者密切训练和监控日常训练，这可能成本高昂、耗费大量人力且耗时令人望而却步。我们的自动培训器允许独立于实验者收集行为数据。其次，我们的自动训练器可以进行复制，以便对多只小鼠进行客观、高效和同时的训练和评估，从而最大限度地减少时间和精力。第三，自动培训器成本低廉，可同时复制和使用多个自动培训器，以便进行大规模和高效的测试。

应该指出，需要认真监督的临界点是在培训的塑造阶段。值得注意的是，该协议的主要弱点是，在一些^小鼠11中，不良使用的风险变得固定。该协议旨在模仿像梯级测试这样的测试，因为成功完成任务会提供奖励。但是，任务本身仍必须在协议的第 2.3 步中教给小鼠，这与梯级梯级测试不同。最有可能导致老鼠在学习这项任务时绊倒的概念是从将爪子伸出笼子到用爪子实际抓住颗粒。在步骤2.3.1的第一个会话中，老鼠应该仅仅因为把爪子伸出笼子而得到奖励。然而，在接下来的几天里，调查人员应该注意奖励老鼠，少一些只延长爪子，多一些延长爪子和触摸颗粒，正如我们在步骤2.3.3中描述的那样。

请注意，大约 5% 的小鼠将无法超过此阶段，通常是因为它们的数字扩展有限，无法拉取食物颗粒。这种小鼠会用一只或两只爪子失败，很少考虑颗粒的实际位置，提供很少或根本没有有用的数据。为了将鼠标在此阶段发生故障的可能性降至最低，强烈建议在学习过程中用钳子将颗粒拉开时，请谨慎。特别是，当老鼠伸出爪子时，而且当老鼠抓住颗粒并施加足够的力来使调查人员满意时，它应该得到食物的奖励。在这个阶段，小鼠用舌头舔球，也构成与潜在失败类似的风险。当训练容易舔的小鼠时，将颗粒横向放置到远离槽的位置。老鼠会发现，在更大的侧向距离上很难用舌头到达，但手臂和爪子的运动范围更能够缩小距离。

我们描述的协议可轻松扩展到不同的实验室环境或不同的数据收集方法。例如，自动培训器作为节省劳动力的设备非常有用，但数据收集并非严格要求，因为可以提供颗粒，也可以手动记录成功/失败。个人到达也可以根据比简单的成功/失败更详细的信息进行分类，例如，通过考虑每只鼠标的方法角度、不接触颗粒的到达尝试次数或检索机制议案，近年来受到更多^关注。动物检索颗粒的能力只是一个衡量标准。使用额外的硬件，我们还将能够测量动物肢体运动的速度、角度和轨迹。这种运动学是神经损伤前后运动学习的一个重要方面。为此，我们目前正在采用各种新方法分析老鼠抓握动作的运动和运动学。我们正在探索使用高速摄像机获取抓地力的运动测量，并将压力传感器和加速度计连接到食品颗粒架上，以测量与抓取相关的力和质量数据。这些新功能将增强自动训练器的功能，以收集通过简单通过或失败试验的重要数据，并帮助说明鼠标通过疾病进展的把握步态。今后，我们将利用机器人辅助治疗任务作为评估神经损伤后康复类型、剂量和时间的平台。今后，我们将继续改进任务，通过改进，以帮助减少错误的行为，提高任务获取率和培训时间。

总之，我们已经开发出一种新的自动训练器，用于评估小鼠上前肢的培养能力。这项任务要求老鼠通过缝隙到达它们的爪子，抓住一个小的食物颗粒，并拉颗粒朝他们身体的方向，以便他们可以吃颗粒。任务设置受到机械约束，以确保主要爪子的使用。小鼠可以快速和同时训练，只需进行人工输入的整形过程。测试可以有效地管理并自动进行分析。这种高通量行为测定可量化成功率，并可轻松修改，以便将来分析运动学和力动力学。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS Filament	Custom 3D Printed	N/A	utilized for pellet holder, frame, arm and funnel
ABS Sheet	McMaster-Carr	8586K581	3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base
Adruino Mini	Adruino	A000087	nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers
Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand	McMaster-Carr	9967T43	35 lbs. load capacity
Clear Acrylic Round Tube	McMaster-Carr	8532K14	ID 3/8"
Low-Carbon Steel Wire	McMaster-Carr	8855K14	0.148" diameter
Pellet Dispenser	Lafayette Instrument: Neuroscience	80209-45	with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand
Photointerrupter Breakout Board	SparkFun	BOB-09322 ROHS	designed for Sharp GP1A57HRJ00F
Reflective Object Sensor	Fairchild Semiconductor	QRD1113	phototransistor output
Servo Motor	SparkFun	S8213	generic metal gear (micro size)
Transmissive Photointerrupter	Sharp	GP1A57HRJ00F	gap: 10 mm, slit: 1.8 mm