Summary
Dieses Protokoll zeigt einen einfachen und flexiblen Ansatz für die Bewertung neuer Konditionierungsmittel oder Strategien zur Erhöhung der Durchführbarkeit von Herzspenden nach Kreislauftod.
Abstract
Die Nachfrage nach Herztransplantationen steigt; Dennoch ist die Verfügbarkeit von Organen aufgrund eines Mangels an geeigneten Spendern begrenzt. Organspende nach Kreislauftod (DCD) ist eine Lösung, um diese begrenzte Verfügbarkeit zu adressieren, aber aufgrund einer Zeit der längeren warmen Ischämie und des Risikos von Gewebeverletzungen ist ihre routinemäßige Anwendung bei Herztransplantationen selten zu sehen. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das aktuelle klinische Praktiken im Kontext von DCD mit kontinuierlicher Überwachung der Herzfunktion nachahmt, so dass die Bewertung neuartiger kardioprotektive Strategien und Interventionen Ischämie-Reperfusionsverletzung.
In diesem Modell wird das DCD-Protokoll bei anästhesierten Lewis-Ratten initiiert, indem die Beatmung gestoppt wird, um den Kreislauftod auszulösen. Wenn der systolische Blutdruck unter 30 mmHg sinkt, wird die warme ischämische Zeit eingeleitet. Nach einer voreingestellten warmen ischämischen Periode werden die Herzen mit einer normothermen kardioplegischen Lösung gespült, beschafft und auf ein Langendorff ex vivo Herzperfusionssystem montiert. Nach 10 min anfänglicher Reperfusion und Stabilisierung wird die Herzrekonditionierung 60 min lang kontinuierlich mit hilfe der intraventrikulären Drucküberwachung evaluiert. Eine Herzverletzung wird durch Messung des Herztroponins T beurteilt und die Infarktgröße wird durch histologische Färbung quantifiziert. Die warme ischämische Zeit kann moduliert und auf die gewünschte Menge an strukturellen und funktionellen Schäden zugeschnitten werden. Dieses einfache Protokoll ermöglicht die Bewertung verschiedener kardioprotektive Konditionierungsstrategien, die zum Zeitpunkt der Kardioplegie, der anfänglichen Reperfusion und/oder während der Ex-vivo-Perfusion eingeführt wurden. Die aus diesem Protokoll gewonnenen Erkenntnisse können in großen Modellen reproduziert werden, was die klinische Übersetzung erleichtert.
Introduction
Feste Organtransplantationen im Allgemeinen und Herztransplantationen im Besonderen sind weltweit auf dem Vormarsch1,2. Die Standardmethode der Organbeschaffung ist die Spende nach dem Hirntod (DBD). Angesichts der strengen Inklusionskriterien der DBD werden weniger als 40% der angebotenen Herzenakzeptiert 3, wodurch das Angebot angesichts der steigenden Nachfrage begrenzt und die Orgelwarteliste erweitert wird. Um dieses Problem anzugehen, wird die Verwendung von Organen, die nach dem Kreislauftod gespendet werden (DCD), als mögliche Lösung betrachtet4.
Bei DCD-Spendern sind jedoch eine agonale Phase nach Entzug der Pflege und eine Periode ungeschützter warmer Ischämie vor Reanimation unvermeidlich5. Die mögliche Organverletzung nach dem Kreislauftod kann zu Organfunktionsstörungen führen, was die Abneigung gegen routinemäßige DCD-Herztransplantationen erklärt. Es wird berichtet, dass nur 4 Zentren DCD-Herzen klinisch verwenden, mit strengen Kriterien, die sehr kurze warme Ischämie-Zeiten und junge Spender ohne chronische Pathologienumfasst 6,7. Aus ethischen und rechtlichen Gründen können bei Spendern vor dem Kreislauftod5,8,9begrenzte oder keine kardioprotektive Eingriffe angewendet werden. Daher ist jede Abschwächung zur Linderung der Ischämie-Reperfusion (IR)-Verletzung auf kardioprotektive Therapien beschränkt, die während der frühen Reperfusion mit kardiopdiogischen Lösungen eingeleitet werden, und lässt keine ordnungsgemäße funktionelle Bewertung zu. Ex-vivo-Herzperfusion (EVHP) und Rekonditionierung des DCD-Herzes mit speziellen Plattformen wurde als alternative Lösung vorgeschlagen und von verschiedenen Wissenschaftlern untersucht10,11,12,13 . EVHP bietet eine einzigartige Gelegenheit, Post-Konditionierungs-Agenten an DCD-Herzen zu liefern, um die funktionelle Erholung zu verbessern. Für eine effiziente klinische Übersetzung müssen jedoch noch viele technische und praktische Fragen angegangen werden, und dies wird noch verstärkt durch einen Mangel an Konsens über eine Reihe von Perfusions- und funktionellen Kriterien zur Bestimmung der Transplantierbarkeit6, 8.
Hierin berichten wir über die Entwicklung eines reproduzierbaren präklinischen DCD-Protokolls für Kleintiere in Kombination mit einem Ex-vivo-Herzperfusionssystem, das zur Untersuchung der zum Zeitpunkt der Beschaffung eingeleiteten Organpostkonditionierung während der ersten Reperfusion verwendet werden kann, und /oder in ganz EVHP.
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Protocol
Alle Tierpflege- und Versuchsprotokolle entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom institutionellen Tierpflege- und Einsatzausschuss des Centre Hospitalier de l'Université de Montréal Research Center genehmigt.
1. Vorvorbereitungen
- Schalten Sie das Wasserbad ein, um das Cardioplegie-Abgabesystem (Abbildung 1A) und das Langendorff ex vivo Perfusionssystem (Abbildung 1B) zu erwärmen. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 38,5 °C für eine Lösungstemperatur von 37 °C ein. Setup-Fotos sind in der Ergänzenden Abbildung 1A,B zusehen.
- Bereiten Sie 1 L kardionlegische Lösung vor. 1 ml 2% Lidocainhydrochlorid und 10 ml 2 mM KCl (Endkonzentration 20 mM) zu 1 L Plasma-Lyt A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, 27 mM Acetat, 23 mM Gluconat) hinzufügen. Korrigieren Sie pH auf 7,4 mit 6 N HCl.
ACHTUNG: Dieses Modell ist sehr empfindlich auf pH-Wert. Eine falsche pH-Korrektur (außerhalb des physiologischen Bereichs 7.3-7.4) oder pH-unstable-Lösungen kann das Experiment gefährden oder unzuverlässige Daten liefern. - Bereiten Sie 4 L Krebs Lösung (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2PO4, 1,25 mM CaCl2, 1 mM MgCl26H2O, 5,5 mM MM D-Glucose, 25 mM NaHCO3). Die Substratmassen pro 1 L Lösung sollten wie folgt sein: 6,1 g NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g MgCl26H2O, 0,192 g NaH2PO4, 0,1387 g CaCl2, 0,99 g D-Glucose, 2,1 g NaHCO3 , Endvolumen von 1 L in ultrareinem entionisiertem Wasser. Fügen Sie die NaHCO 3 zuletzt, um Niederschlag zuvermeiden. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m Filter und lagern Sie sie über Nacht. Korrigieren Sie den pH-Wert auf 7,4, wenn die Lösung bei 37 °C liegt, und blasen Sie mit 5% CO2/95% O2.
- Füllen Sie die Langendorff-Schaltung mit Krebs-Lösung und starten Sie die Systempumpe. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in den Schläuchen gelassenwerden. Stellen Sie die peristaltische Pumpendrehzahl auf 80 Rpm (entspricht 1 L/min) ein. Passen Sie mit dem Zwei-Wege-Stopphahn den Durchfluss an, um einen langsamen Tropf durch die Aortenkanüle aufrechtzuerhalten, bis das Herz befestigt ist (Abbildung 1B). Halten Sie eine Probe der Krebs-Lösung (15 ml) in einem 50 ml Kegelrohr auf Eis für den Herztransport.
- Füllen Sie das Cardioplegie-Liefersystem mit der kardioplegischen Lösung. Sobald die Blasen entfernt sind, schalten Sie die Schaltung mit einem 3-Wege-Stopp-Hahn in Die Saline um (Abbildung 1A). Passen Sie die Tropfrate an. Saline muss langsam von der Spitze des Katheters tropfen, um sicherzustellen, dass vor dem Tod des Tieres keine kardionlegische Lösung injiziert wird.
2. Tierzubereitung
- Mit einer Inhalationskammer eine Anästhesie mit 3% Isofluran induzieren. Sobald das Tier nicht reagiert, führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) oder ähnlich geeignetean anesthetische, nach den örtlichen Vorschriften, um Anästhesie für den Rest des Verfahrens zu erhalten. Stellen Sie die Tiefe der Anästhesie sicher, indem Sie keine Reaktion auf Zehenkneifen und palpebralen Reflex.
- Intubieren Sie das Tier mit einem 14 G, 2-Zoll-I.V.-Katheter. Beginnen Sie die Belüftung mit 50 Atemzügen pro min, wobei der Atemwegsdruck auf 20 cmH2O begrenzt ist.
- Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, das auf "Medium" eingestellt ist, und decken Sie es mit einem saugfähigen Pad ab, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Setzen Sie eine rektale Temperatursonde ein und befestigen Sie einen transdermalen Pulsoximetersensor an einem der Füße. Halten Sie die Rektaltemperatur während des gesamten Verfahrens bei 37 °C.
-
Gefäßzugang
- Machen Sie einen 3 bis 4 cm mittelseitigen Hautschnitt im Hals mit einer Schere. Mit stumpfer Spitze gekrümmte Schere, stumpf sezieren Sie das subkutane Gewebe und belichten die rechte sternohyoid Muskel. Mit nicht-traumatischen Zangen, bewegen Sie den Muskel seitlich, bis die rechte Halsschlagader (pulsierend), Jugularvene (nicht pulsierend) und der Vagusnerv (weiß) visuell identifiziert werden (Ergänzende Abbildung 2A). Trennen Sie den Vagusnerv vorsichtig von der Halsschlagader mit einer stumpfen, gebogenen Schere.
- Heparin (2.000 I.E./kg) über die richtige Jugularvene injizieren. Wenden Sie Druck auf die Injektionsstelle nach dem Nadelrückzug an, um Blutleckszufuhr zu vermeiden.
- Mit gebogenen Zangen, passieren Sie zwei 5-0 Seiden Nähte um die Halsschlagader. Fest befestigen Eine distale Naht, um die Halsschlagader am überlegenen Aspekt der exponierten Arterie zu verschließen. Halten Sie die proximale Naht ungebunden. Das Ziehen der proximalen Naht wird zur Blutungskontrolle im nächsten Schritt verwendet (Zusatzabbildung 2B). Der Abstand zwischen den Nähten sollteca. 2 cm betragen.
- Mit einem Stereomikroskop für eine bessere Visualisierung, sorgfältig einen 1 mm Schnitt mit Mikrochirurgie Schere über die vordere Wand der Halsschlagader. Legen Sie einen 22 G, 1-Zoll geschlossenen I.V.-Katheter in Richtung Aortenbogen ein. Der Katheter ist mit einem 2-Wege-Stopphahn verbunden, der den Anschluss an einen Druckwandler für eine konstante Überwachung ermöglicht, mit der Möglichkeit, Koch- oder Kardioplegie über das Cardioplegia-Liefersystem zu injizieren (Abbildung 1A).
3. Einleitung einer Herzspende nach Kreislauftod (DCD) Protokoll
HINWEIS: Eine vollständige Protokollzeitleiste ist in Abbildung 2zu sehen.
- Die Anästhesietiefe wird durch eine Zehenklemmung und die Bewertung des palpebralen Reflexes erneut untersucht. Wenn eine Reaktion beobachtet wird, führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (37,5 mg/Kg) und Xylazin (2,5 mg/Kg) durch. Nach 5 Minuten neu bewerten. Wenn keine Antwort beobachtet wird, fahren Sie mit dem Verfahren fort. Trachealklemme sollte nur bei ausreichend anästhesierten Tieren durchgeführtwerden.
- Schalten Sie das Beatmungsgerät aus und extubieren Sie das Tier. Mit Mückenzangen die Luftröhre einklemmen. Dieser Moment gilt als Beginn der Agonalphase. Beginnen Sie mit der Zählung der funktionellen warmen ischämischen Zeit (WIT), wenn der systolische Spitzenblutdruck unter 30 mmHg sinkt oder wenn Asystole oder Kammerflimmern auftritt, was auch immer zuerst kommt (Abbildung 3).
HINWEIS: Schadensumfang sollte proportional zu WIT sein. Experimente sind notwendig, um die WIT-Zeit entsprechend der verwendeten Anästhesie, der verwendeten Tierstämme, des Geschlechts und des gewählten Gewichts zu optimieren. Bei Kontrolltieren wird unmittelbar nach der Sicherung des Karotis-Gefäßzugangs Eine Kardioplegie injiziert und das Herz beschafft, wie im nächsten Schritt beschrieben (Abbildung 2). Der Beginn der Perfusion mit Kardioplegie gilt als das Ende von WIT. - Führen Sie am Ende von WIT eine mediale Sternotomie durch. Halten Sie den Thorax offen, indem Sie einen Alm-Retraktor verwenden. Öffnen Sie mit einer Schere die untere Vena cava und beide Vorhöfe, um Myokardverspannungen oder Kardioplegie-Rezirkulation zu vermeiden (Zusatzabbildung 3). Klemmen Sie die Aorta über dem Zwerchfell. Durch die zuvor katheterisierte Karotisarterie die kardioplegische Lösung bei einem konstanten Druck von 60 mmHg für 5 min mit dem Cardioplegia-Liefersystem einzudecken. Der Infusionsdruck kann durch Änderung der Höhe der Wassersäule verändert werden.
- Am Ende der kardiepischen Infusion die aufsteigende proximale Aorta aus der Lungenarterie mit gekrümmten Zangen zu dissektieren (Zusatzfigur 4A). Schneiden Sie die Aorta distal auf die linke subklavische Arterie. Stellen Sie eine Aortenlänge von mindestens 0,5 cm für die Cannulation für das Langendorff-Gerät sicher.
- Halten Sie das Herz von der Aorta, vervollständigen Sie die Kardiektomie, indem Sie das Herz von den Lungenvenen und anderen Thoraxstrukturen trennen (Ergänzende Abbildung 4B). Tauchen Sie schnell das Herz in die eiskalte Krebs-Lösung für den schnellen Transport zum Ex-vivo-System ein. Halten Sie die Sezieren und Transportzeiten so kurz wie möglich (5 min).
4. Ex Vivo Heart Perfusion System (EVHP) und Cardiac Functional Assessment
- Öffnen Sie das Aortenlumen mit Zangen. Deair the aorta by filling the lumen with the dripping Krebs solution to avoid forcing bubbles in to the coronary vessels. Senken Sie die Kanüle in die Aorta, wobei Sie darauf achten, die Aortenwurzel nicht zu passieren oder die Aortenklappenblätter zu beschädigen. Beheben Sie das Setup mit einer kleinen Klemme.
- Mit dem 2-Wege-Stopphahn, erhöhen Sie den Fluss, um nach möglichen Lecks in der Aorta zu suchen. Wenn keine erkannt werden, fixieren Sie die Aorta mit einer 2-0 Seidennaht fest an der Kanüle. Öffnen Sie den Fluss zur Kanüle vollständig. Aortendruck bei einem physiologischen Druck von 60-70 mmHg (angepasst durch Änderung der Systemhöhe). In diesem Moment wird die erste Reperfusions- und Stabilisierungszeit eingeleitet. Der Aortendruck kann nach dem Versuchsplan des Prüfers geändert werden.
- Drehen Sie das Herz so, dass die Basis des Herzens (Atria) dem Drucksensor zugewandt ist. Verbreitern Sie die linke ventrikuläre Vorhoföffnung, indem Sie die Lungenvenen sezieren. Legen Sie den Latexballon ein, der mit einem Drucksensor verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass der Ballon vollständig im Inneren des Ventrikels positioniert ist, indem Sie dies durch sichtoptische Inspektion enden. Füllen Sie den Ballon langsam mit Kochsaline, bis der Enddiastolischer Druck (EDP) auf 15 mmHg eingestellt ist. Stellen Sie sich nach Bedarf ein, um die EDP-Konstante zu halten (vorbestimmtes physiologisches EDP). Das EDP kann an die experimentellen Ziele jedes Prüfers angepasst werden.
- Legen Sie die Schrittelektrode in die vordere Gesichtsfläche des Herzens (rechtsventrikulärer Abflusstrakt) ein. Vermeiden Sie das Punktieren der Herzkranzgefäße. Sobald spontanes Schlagen beobachtet wird, initiieren Sie Tempo bei 300 Schlägen pro min. Erforderliche Spannung kann zwischen Experimenten und Rattenstämmen variieren.
- Nach 10 min Stabilisierung eine kontinuierliche intraventrikuläre Druckmessung einleiten. Dieser Moment gilt als Beginn der Instandsetzungs- und Bewertungsphase (Zeit 0), die 1 h dauern wird (Abbildung 2). Die Instandsetzung kann verlängert werden, aber in allen Herzen wird mit einem zeitabhängigen Rückgang der Kontraktilität gerechnet.
- Zu Beginn der Rekonditionierung, sammeln Herzabwässer aus den Herzvenen für 5 min für Baseline koronare Flussbewertung und biochemische Analysen. Für Troponin T alle 15 min wiederholen (mal 0, 15, 30, 45 und 60 min). Für andere Analysen ist eine Individualisierung der Sammelzeiten erforderlich (Abbildung 2).
5. Ende der Erfahrung
- Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Apparat.
- Entfernen Sie mit einer geraden Hochkohlestahlklinge (Mikrotomeklinge oder ähnliches) die Basis des Herzens (einschließlich Aorta und Lungenarterie).
- Mit dem rechten Ventrikel nach unten, schneiden Querventrikuläre von 1-2 mm Dicke. In einem repräsentativen Abschnitt (normalerweise der dritte) verbrauchen Sie den rechten Ventrikel und fangen Sie den linken Ventrikel ein. Diese Probe kann für biochemische Analysen verwendet werden.
- Untertauchen Sie die restlichen Abschnitte in frisch zubereitete 5%2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid in kommerziellen Phosphatpuffer-saline-pH-Gehalt 7,4 für 10 min bei 37 °C. Lebensfähige Gewebe sind rote Ziegel gefärbt.
- Zweimal mit Phosphatpuffer-pH-gehalt 7,4 waschen und über Nacht mit 10% Formalin bei 4 °C fixieren. Zweimal mit Phosphat gepufferter saline pH 7.4 waschen und jede Scheibe unter Wasser halten.
- Überschüssige Flüssigkeit und Gewicht pro Rutsche zurückziehen. Nehmen Sie digitale Farbbilder von beiden Seiten. Verwenden Sie planimetrische Analysen, um die Prozentuale Infarktgröße zu berechnen und das Gewicht der Scheibe und des gesamten ventrikulären Gewichts zu korrigieren. Die Färbung verblasst mit der Zeit. Fotos müssen so schnell wie möglich gemacht werden.
6. Datenanalysen
- Speichern Sie alle Druckdaten in einer neuen Datei pro Tier.
- Wählen Sie für Druckanalysen mindestens 200 Druckzyklen pro Zeitpunkt aus. Analysen können online (nach Abschluss des Experiments) mit dedizierter Software (z.B. LabChart) durchgeführt werden. Häufige kardiovaskuläre Parameter sind: Maximal erzeugter Druck, End-Diastolischer Druck, +dP/dt (steilste Steigung während des Aufschlags der Druckkurve, Indikator für ventrikuläre Kontraktilität), -dP/dt (steilste Neigung während der Druckkurve, ein Indikator für die ventrikuläre Entspannungsfähigkeit) u.a..
HINWEIS: Bei Troponinanalysen wird eine Erhöhung der Troponinfreisetzung bei der Reperfusion erwartet. Nach 1 h Reperfusion im EVHP-System können die Troponinspiegel auf den Ausgangswert sinken, was die Notwendigkeit eines sorgfältigen Timings bei der Entnahme und Handhabung dieser Proben betont.
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Representative Results
Nach der Extubation sinkt der Blutdruck in einem vorhersagbaren Muster rapide (Abbildung 3). Die erwartete Todeszeit beträgt weniger als 5 min.
Abbildung 4 zeigt eine durchschnittliche Druck-/Zeitkurve zu Beginn der Instandsetzung nach 0, 10 und 15 min WIT. Die Kontraktile-Funktion wird sich im Laufe der Zeit verbessern. Die Verwendung kurzer WIT-Zeiträume wird es ermöglichen, dass sich die Kontraktilität wieder normalisiert, und morphologische Schäden sind nicht nachweisbar (Abbildung 5 und Abbildung 6).
Proof-of-Concept-Einsatz eines mit der Kardioplegie und in der Stabilisierungsphase hinzugefügten Konditionierungsmittels zeigen, dass die durch 15 min WIT in diesem Modell verursachten Schäden durch kardioprotektive Mittel modulationsfähig sind (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6).
Abbildung 1: Erforderliche Geräteschemata. Minimale Anforderungen an ein (A) Cardioplegia-Abgabesystem und ein (B) Langendorff ex vivo Herzperfusionssystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Protokollzeitleiste. Zeitleiste vom Zeitpunkt der Extubation bis zum Ende des Protokolls. Bei Kontrolltieren wird Die Kardioplegie ohne DCD oder warme ischämische Zeit eingeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Intrakarotise Blutdruck-/Zeitdiagramm. Typische Entwicklung des intrakarotiden Blutdrucks nach Extubation. Warme Ischämie-Zeitsterne, wenn der spitzen systolische Blutdruck unter 30 mmHg fällt, oder wenn Asystole oder Kammerflimmern auftritt, was auch immer zuerst kommt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ex-vivo-Durchschnittliche Beat-to-Beat-Ventrikulärdruck-Zeitkurve. Bild abgeleitet aus Analysen von Daten, die nach 10 min Stabilisierung und Perfusion (Zeit 0 in Abbildung 2) mit oder ohne Verwendung eines experimentellen pharmakologischen kardioprotektiven Konditionierungsmittels aufgenommen wurden. Die ischämische Zeit bezieht sich auf warme ischämische Zeiten (WIT). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ex-vivo-Recovery und Funktionsanalysen. (A) Kontinuierliche ventrikuläre Druck-Zeit-Kurve nach 10 min Stabilisierung und Perfusion mit oder ohne Verwendung eines experimentellen pharmakologischen kardioprotektiven Konditionierungsmittels. Pfeile zeigen Artefakte aufgrund der manuellen Änderung von EDP. (B) Maximale (+dP/dt) und minimale (-dP/dt) Druckänderungsrate im LV vs. Zeitdiagramm, abgeleitet von (A), die eine zeitabhängige Verbesserung der Kontraktilität ohne Behandlung zeigt (grüne Linie). Kurze WIT-Herzen (rote Linie) oder behandelte (gelbe) Herzen zeigen ein Muster, das der Kontrollgruppe (blaue Linie) ähnelt. Datenpunkte sind der Mittelwert von mindestens 200 einzelnen Beats. Balken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts jedes Datenpunkts an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: 2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid-Färbung am Ende der Experimente. Infarktbereich beobachtet nach verschiedenen warmen ischämischen Zeiten (WIT) und der Verwendung eines pharmakologischen kardioprotektive naktiven Konditionierungsmittels. Ziegelrot: lebensfähiges Gewebe. Hellgelb: nicht lebensfähiges Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Setup-Foto. (A) Foto mit dem Setup für das Cardioplegia-Liefersystem. Nummerierte Geräte entsprechen: Cardioplegiebehälter (1), Blasenfalle (2), Drucksensor und Katheter (3), Peristaltikpumpe (4), Polygraph, der mit dem Drucksensor (5) und Kleintierventilator (6) verbunden ist. (B) Foto zeigt das Setup für das Langendorff ex vivo Herzperfusionssystem. Nummerierte Ausrüstung entspricht: Perfusate Behälter (1), Konditionierungsmittelbehälter (2) und Herzkammer (3). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Halssektion. (A) Fotografie, die die exponierte Jugularvene (Pfeil) vor der Heparin-Injektion zeigt. (B) zeigt die sezierte Halsschlagader (Pfeil) mit den Nähten zur Blutungskontrolle platziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Öffnung der Vorhöfe zur Verhinderung der Rückführung. (A) Fotografie, die die Öffnung des linken Vorhofanhängs (1) zeigt. Auf dem Hintergrund wird die Aorta (2) über dem Zwerchfell (3) eingeklemmt. (B) Zeigt die Öffnung des rechten Vorhofanhängs (1). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Herzbeschaffung. (A) Fotografie, die die Verwendung von gekrümmten Zangen zeigt, um die Aorta (Pfeil) und die Lungenarterie zu trennen. (B) Fotografie mit Herzsezieren und Beschaffung. Das Herz wird von der Aorta mit Zangen gehält. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll stellt ein einfaches, bequemes und vielseitiges Modell von Herz-DCD vor, das die Möglichkeit bietet, die herzfunktionelle Erholung, Gewebeschäden und den Einsatz von kardioprotektive naktiven Nachhilfemitteln zu bewerten, um die Genesung des Spenders zu verbessern. Herzen, die sonst zur Transplantation verworfen werden. Ex-vivo-Herzperfusionssysteme (EVHP) wurden optimiert, um eine Plattform zur Beurteilung der Herzfunktion zu bieten und eine einzigartige Möglichkeit zu bieten, modifizierte Lösungen zu liefern und zu testen, die mit post-conditioningen pharmakologischen Wirkstoffen ergänzt werden, um erhalten und reparieren DCD Herzen in kleinen15 und großen Tieren16,17 Modelle von Herz-DCD. Dennoch sind die Protokolle oft unzureichend detailliert und nicht immer klinisch relevant, was die klinische Übersetzung erschwert.
Im Bereich der DCD-Modelle fehlt ex vivo DCD-Modellen, wie sie von Sanz18beschrieben werden, an einer agonalen Phase. Durch die Induktion von Herzstillstand durch Anhalten der mechanischen Beatmung wird das sympathische Nervensystem überaktiviert, was zu einem "Katecholamin-Sturm" führt19. Diese Zunahme der Katecholamine verändert die Eigenschaften der Spenderorgane und wurde mit einem reduzierten funktionellen Status der experimentellen DCD-Organe19in Verbindung gebracht. Darüber hinaus führt der fortschreitende Funktionsrückgang vor Asystole zu rechtsventrikulärer Dehnung und daraus resultierender Verletzung. In unserem Protokoll haben wir den Kreislauftod mit einem klinisch relevanten Erstickungsmodell induziert, das diese Reaktionen aufrechterhält.
Zwei hauptin vivo Kardial-DCD-Modelle werden in der Literatur beschrieben: offene Brust15 und geschlossene Brust20 Modelle. Die Herzphysiologie wird durch den offenen Brustansatz verändert, indem die mechanische Lungen-Herz-Interaktion und Vorbelastung reduziert wird. Darüber hinaus wird bei offenen Brustverfahren der Wärmeverlust des Körpers beschleunigt, was sich weiter auf die funktionellen Ergebnisse auswirkt21. Daher ist es vorzuziehen, einen geschlossenen Brustansatz beizubehalten, der Wärmeverlust verhindert. Eine weitere Verfeinerung besteht darin, die Variabilität der Zeit bis zum Kreislauftod zu minimieren. Kearns et al. berichteten, dass die Zeit bis zum Tod (Zeit bis zum nichtpulsatilen oder mittleren Blutdruck unter 30 mmHg) zwischen 3 und 11 min lag. In den 10 und 20 min WIT erholten sich 40% bzw. 60% der Herzen nicht an einem ex vivo arbeitenden Herzapparat, was die Dateninterpretation erschwerte15. Eine Alternative zur Verkürzung der Zeit bis zum Kreislauftod ist die Verwendung von Gelähmten20; dennoch deuten einige Hinweise auf direkte kardiale Wirkungen von Vecuronium hin, aufgrund seiner Auswirkungen auf die sympathische und parasympathische Innervation22. Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, haben wir uns für die Trachealklemmung entschieden, kombiniert mit einer präzisen arteriellen Drucküberwachung, die eine homogenere Agonalzeit (<5 min) ermöglicht. Es ist bekannt, dass Organschäden vor dem Moment des Kreislauftodes beginnen; einige Autoren betrachten einen abgeschnittenen systolischen Blutdruck unter 50 mmHg als Beginn der funktionellen WIT6, was die Zurückhaltung bei der Transplantation von Organen nach einer langen Periode Form Zurückziehen von lebenserhaltenden Maßnahmen bis zur Reperfusion erklärt. In diesem Protokoll folgt die verwendete WIT-Definition dem aktuellen experimentellen Standard15, dennoch sind weitere Studien erforderlich, um den genauen Satz hämodynamischer Parameter zu klären, die die Induktion von Organschäden kennzeichnen, um WIT zu verbessern. berechnung und bietet somit bessere Informationen für die klinische Praxis.
Die Infusion kardiver Lösung bei konstantem physiologischen Druck und Temperatur bietet eine einzigartige Gelegenheit, Herzkonditionierung und Gewebeschutz mit jedem pharmakologischen Mittel oder auf andere Weise zu initiieren. Technische Verfeinerungen umfassen das Spannen der thorakalen Aorta, die Begrenzung der Perfusion auf das Herz und damit die Verringerung der Lösungsmenge, die für jeden Aufsatz benötigt wird. Sobald sich das Herz auf dem EVHP-System befindet, ist eine standardisierte Funktionsauswertung erforderlich. Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung eines EVHP-Systems das Potenzial hat, die Reanimation von Herzen zu verbessern, die zuvor als nicht transplantierbar galten23,24. Interessanterweise bewertet das klinisch verfügbare EVHP-System die Herzlebensfähigkeit nur anhand der seriellen Laktatmessungen8,23. Laktatmessungen stehen nicht im Zusammenhang mit der Herzleistung von DCD-Herzen24,25, daher sind zusätzliche Messungen zur Beurteilung der Transplantierbarkeit notwendig. Dieses experimentelle Setup ermöglicht eine vollständige funktionelle Auswertung, einschließlich erzeugter Drücke und myokardischer Kontraktilitätsmessungen, einschließlich +dP/dT und –dP/dT, was eine gründlichere Beurteilung der Herzfunktion vor der endgültigen Transplantation ermöglicht. Entscheidung getroffen wird. Zusätzlich sind Messungen von Herztroponin, einem Marker von Myokardschäden, die direkt mit ischämischer Infarktgröße26korreliert, und Freisetzungskinetik mit dem Ausmaß der Herzischämie in einem Langendorff Ischämie/Reperfusionssystem verbunden. Insbesondere bei langen ischämischen Zeiten (60 min) werden die Troponinspiegel nach 1 h Reperfusion aufrechterhalten, während LDH und Kreatininkinase signifikant abnehmen und nicht mit dem Ausmaß der Herzschädigung in Zusammenhang stehen27,28, die Anwendung von seriellen Troponin-Maßnahmen gewährleistet eine vollständige Bewertung der Organlebensfähigkeit vor der Transplantation. Eine wichtige Störvariable in der kardialen funktionellen Bewertung ist die Herzfrequenz. Die spontane Herzfrequenz hängt umgekehrt mit der Länge der Ischämie29zusammen, und die Herzfrequenz korreliert direkt mit +dP/dt in isolierten Rattenherzen30 und in Tiermodellen31. Interessanterweise wurde in kürzlich veröffentlichten Arbeiten über Nagetiermodelle von DCD-Herzen und EVHP-Konditionierung, Tempo nicht verwendet und Herzraten waren variabel und in ihren Protokollenaufgezeichnet 15,18,20. Um die physiologische Herzfrequenz aufrechtzuerhalten, wurde das Tempo verwendet, sobald das Herz die rhythmische Kontraktion wiederhergestellt hatte. Die gewählte 300 bpm Frequenz ähnelt der von gesunden, nicht gestressten Ratten32.
Zu den Einschränkungen dieses Protokolls gehört die Verwendung von flüchtigem Anästhetikum zur Induktion. Es hat sich gezeigt, dass diese Mittel eine ischämische Vorbedingung für33verleihen. Dennoch hatte die kurze Zeit der inhalativen Anästhesie anwendung keine beobachtbare Wirkung in diesem Protokoll und progressive Myokardfunktionsstörung wurde immer noch mit zunehmender WIT festgestellt. Die Verwendung von normothermischer Kardioplegie kann auch als Einschränkung betrachtet werden. Die Verwendung normothermischer Kardioplegie ermöglicht eine optimale Übersetzung aus den In-vitro-Bedingungen, die für die Entwicklung von pharmakologischen Konditionierungsmitteln verwendet werden, da Die Zellen in der Regel bei 37 °C gehalten werden. Dennoch kann in diesem Setup die Kardioplegietemperatur leicht nach den Anforderungen des Prüfers reguliert werden. Andererseits könnte der Einsatz einer Langendorff-Zubereitung im Vergleich zu einer Arbeitsherzvorbereitung zur Rekonditionierung auch als Einschränkung angesehen werden. Die Arbeitsherzvorbereitung ermöglicht eine kontinuierliche Aufzeichnung einer Druck-/Volumenschleife12,15, mit kontrollierter Vor- und Nachspannung, wodurch eine vollständige funktionelle Auswertung möglich ist. Der Hauptvorteil einer Langendorff-Zubereitung besteht darin, dass sie einen konstanten Aorten- und Perfusionsdruck aufrechterhält, insbesondere bei der ersten Reperfusion, wenn der erzeugte Druck minimal ist. Darüber hinaus ist die Auswertung für das Langendorff-Herz einfacher als bei einer Arbeitsherzvorbereitung. Dennoch kann dieses Setup bei Bedarf in eine Arbeitsherzvorbereitung umgewandelt werden. Alternativ kann die Herzreanimation vor Ort mit normothermischer regionaler Perfusion durchgeführt werden, wobei die Herzleistung direkt durch den Einsatz eines Millar-Katheters34gemessen wird, was eine umfassende hämodynamische und myokardische Bewertung vor der Organbeschaffung. Beim Menschen wurden sowohl In-situ- als auch Ex-vivo-Rekonditionierungsstrategien beschrieben6, so dass die Entwicklung beider Modelle experimentelle Vergleiche ermöglicht, die sich in einer Optimierung der klinischen Praxis niederschlagen können. Schließlich können die geringe Größe und die hohe Herzfrequenz dieses Tiermodells aufgrund der potenziellen technischen Schwierigkeiten, die bei der Durchführung dieser Experimente beobachtet werden, und der unvermeidlichen physiologischen Unterschiede zwischen Ratte und menschlichen Herzen als Einschränkung betrachtet werden. Wenn die EVHP-Bewertung bereits standardisiert ist, kann ein Forscher mit dieser Technik vertraut gemacht werden, indem er nur 3 Experimente durchführt. Andererseits ermöglicht die Verwendung dieses Kleintiermodells ein bequemes Screening zu angemessenen Kosten, wobei größere und teurere Tiermodelle wie das Schweinemodell auf Therapien mit hohem menschlichen Übersetzungspotenzial zurückgehalten werden.
Zusammenfassend lässt das hier beschriebene Protokoll die Best Practices berücksichtigen, die von mehreren Gruppen stammen, die DCD-Herzen erforschen. Dieses Protokoll gewährt die volle Kontrolle über WIT, was eine umfassende strukturelle und funktionelle Bewertung von kardioprotektive Konditionierungsbehandlungsstrategien bei Ratten ermöglicht. Dieses Protokoll kann hochskaliert und auf große Tiermodelle übertragen werden, was es ermöglicht, Forschungsergebnisse in die klinische Realität umzusetzen und letztlich die Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen, die die Qualität und Verfügbarkeit lebensrettender Organe erhöhen, die von den Patienten.
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Disclosures
Die Autoren berichten kein proprietäres oder kommerzielles Interesse an einem in diesem Artikel erwähnten Produkt oder Konzept.
Acknowledgments
Ein Teil dieser Arbeit wurde durch einen großzügigen Beitrag der Fondation Marcel et Rolande Gosselin und der Fondation Stefane Foumy unterstützt. Nicolas Noiseux ist Gelehrter der FRQ-S.
Die Autoren bedanken sich bei Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi und Catherine Scalabrini für ihre Unterstützung bei der Datenerhebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride. 1 L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14 G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22 G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1,000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/mL | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/mL |
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