Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer ulike cellulære rom. Her har vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs for å overvåke deres transport inne i cellen.
Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer både kjernefysiske og cytoplasmatiske faser, og det siste steget skjer i et kjernefysisk rom kalt Cajal kroppen. Men sekvenser som direkte snRNA lokalisering i denne subnuclear strukturen har ikke vært kjent før nylig. For å finne sekvenser som er viktige for akkumulering av snRNAs i Cajal-organer, brukte vi microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs etterfulgt av deres lokalisering i celler. Først forberedte vi snRNA sletting mutanter, syntetisert DNA maler for in vitro transkripsjon og transkribere snRNAs i nærvær av UTP kombinert med Alexa488. Merket snRNAs ble blandet med 70 kDa-Dextran bøyd med TRITC, og microinjected til kjernen eller cytoplasma av menneskelige HeLa celler. Celler ble inkubert for 1 t og fast og Cajal Body markør Marianne ble sett på av indirekte immunofluorescence, mens snRNAs og dextran, som fungerer som en markør for kjernefysisk eller cytoplasmatiske injeksjon, ble observert direkte ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Denne metoden gjør det mulig for effektiv og rask testing av hvordan ulike sekvenser påvirker RNA lokalisering inne i cellene. Her viser vi viktigheten av SM-bindende sekvens for effektiv lokalisering av snRNAs i Cajal kroppen.
RNA skjøting er en av de avgjørende trinnene i genuttrykk, som er katalysert av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt spliceosome. Totalt er mer enn 150 proteiner og 5 små kjernefysiske RNAs (snRNAs) integrert i spliceosome på ulike stadier av skjøting veien. U1, U2, U4, U5 og U6 snRNAs deltar i skjøting av store GU-AG introns. Disse snRNAs delta i spliceosome som pre-formet små kjernefysiske ribonucleoprotein partikler (snRNPs) som inneholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller like-SM proteiner, som forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner spesifikke for hver snRNP.
Montering av snRNPs innebærer cytoplasmatiske og kjernefysiske stadier. Nylig transkribere snRNA eksporteres til cytoplasma der den får en ring montert fra syv SM proteiner. Den SM ringen senere fungerer som et signal for snRNA re-import tilbake til kjernen. Defekt snRNAs som ikke klarer å assosiere med SM proteiner er beholdt i cytoplasma1. Nylig importerte snRNPs først vises i Cajal kroppen der de møter snRNP-spesifikke proteiner og fullføre sin modning (gjennomgått i referanse2,3). Vi har nylig viste at hemming av siste modning trinn resulterer i opptak av umodne snRNPs i Cajal organer4,5. Vi foreslo en modell der den endelige snRNP modning er under kvalitetskontroll som overvåker tillegg av snRNP-spesifikke proteiner og dannelsen av aktive snRNPs. Men molekylære detaljer om hvordan celler skille mellom riktig montert modne og avvikende umodne partikler forblir unnvikende.
For å bestemme snRNA sekvenser som er avgjørende for målretting og akkumulering av snRNAs i kjernefysiske Cajal organer, bestemte vi oss for å ansette microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs. Microinjection var en metode for valg fordi: 1) det krever ikke en ekstra sekvens kode for å skille syntetiske snRNAs danne sine endogene kolleger som er spesielt viktig for korte RNAs med liten plass for innsetting av ekstra kodesekvens; 2) det tillater analyse av sekvenser som er viktige for kognitiv. For eksempel er SM sekvensen viktig for SM ring montering og re-import til kjernen6. Når snRNAs er uttrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvensen er degradert i cytoplasma og ikke nå kjernen og Cajal organer7. Men snRNAs uten SM sekvensen kan direkte microinjected inn i kjernen og dermed en potensiell rolle SM sekvensen i Cajal kroppen lokalisering analyseres.
Her beskriver vi i detalj en microinjection metode som vi brukte for å fastslå snRNA-sekvenser som er nødvendige for å målrette snRNAs inn i Cajal-legemet5. Vi viste at SM og SMN bindende nettsteder er sammen nødvendig og tilstrekkelig til å lokalisere ikke bare snRNAs men ulike korte ikke-koding RNAs inn i Cajal kroppen. Basert på microinjection så vel som andre bevis, foreslo vi at SM ringen montert på SM bindende området er Cajal kroppen lokalisering signal.
Vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs å bestemme sekvenser viktig for snRNA lokalisering i kjernefysiske Cajal organer. På grunn av rask og ganske enkel utarbeidelse av merket RNAs (utarbeidelse av DNA mal av PCR etterfulgt av in vitro transkripsjon) metoden gir effektiv analyse av hvordan ulike sekvenser bidra til RNA lokalisering. På relativt kort tid var vi i stand til å analysere ti forskjellige slettinger eller erstatninger av U2-snRNA (referanse5 og data ikke vis…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den tsjekkiske Science Foundation (18-10035S), det nasjonale bærekraft programmet I (LO1419), institusjonell støtte (RVO68378050), det europeiske Regional Development Fund (CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775) og Grant Agency of Charles University (GAUK 134516). Vi erkjenner videre Light mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Praha, Tsjekkia (støttet av tilskudd (tsjekkisk-Bioimaging-LM2015062).
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |