Analyse af Spliceosomale snRNA-lokalisering i humane Hela-celler ved hjælp af mikroinjektion
Summary
Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer forskellige cellulære rum. Her beskæftigede vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at overvåge deres transport inde i cellen.
Abstract
Biogenesis af Spliceosomal snRNAs er en kompleks proces, der involverer både nukleare og cytoplasmiske faser, og det sidste trin forekommer i et nukleart rum kaldet Cajal-kroppen. Men sekvenser, der direkte snRNA lokalisering i denne subnukleare struktur har ikke været kendt indtil for nylig. For at bestemme sekvenser, som er vigtige for akkumulering af snRNAs i Cajal-kroppe, anvendte vi mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs efterfulgt af deres lokalisering inde i cellerne. Først forberedte vi snRNA sletning mutanter, syntetiseret DNA skabeloner til in vitro transkription og transskriberede snRNAs i nærværelse af UTP kombineret med Alexa488. Mærkede snRNAs blev blandet med 70 kDa-dextran konjugeret med TRITC, og microinjiceres til kernen eller cytoplasmaet af humane HeLa celler. Cellerne blev inkuberet i 1 time og fast, og Cajal Body Marker coilin blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens, mens snRNAs og dextran, som fungerer som markør for nuklear eller cytoplasmisk injektion, blev observeret direkte ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Denne metode giver mulighed for effektiv og hurtig test af, hvordan forskellige sekvenser påvirker RNA lokalisering inde celler. Her viser vi vigtigheden af SM-bindings sekvensen for effektiv lokalisering af snRNAs i Cajal-kroppen.
Introduction
RNA splejsning er et af de afgørende skridt i genekspression, som er katalyseret af en stor ribonucleoprotein kompleks kaldet spliceosome. I alt er mere end 150 proteiner og 5 små nukleare RNAs (snrnas) integreret i spliceosome på forskellige stadier af splejsning pathway. U1, U2, U4, U5 og U6 snrnas deltager i splejsning af Major Gu-AG introns. Disse snRNAs slutte sig til spliceosome som præ-dannet små nukleare ribonucleoprotein partikler (snRNPs), der indeholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller lignende-SM proteiner, der forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner specifikke for hver snRNP.
Montering af snRNPs involverer cytoplasmiske og nukleare stadier. Nyligt transkriberet snRNA eksporteres til cytoplasmaet, hvor det erhverver en ring samlet fra syv SM proteiner. SM ring efterfølgende tjener som et signal for snRNA re-import tilbage til kernen. Defekte snRNAs, der undlader at associere med SM proteiner er bevaret i cytoplasmaet1. Nyligt importerede snrnp’er vises først i Cajal-kroppen, hvor de møder snrnp-specifikke proteiner og afslutter deres modning (gennemgået i reference2,3). Vi har for nylig vist, at hæmning af de endelige modning trin resulterer i binding af umodne snrnps i Cajal organer4,5. Vi foreslog en model, hvor den endelige snRNP modning er under kvalitetskontrol, der overvåger tilsætning af snRNP-specifikke proteiner og dannelsen af aktive snRNPs. Molekylære detaljer om, hvordan celler skelner mellem korrekt monterede modne og afvigende umodne partikler, forbliver dog flygtige.
For at bestemme snRNA-sekvenser, der er afgørende for målretning og akkumulering af snRNAs i nukleare Cajal-organer, besluttede vi at anvende mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs. Mikroinjektion var en metode til valg, fordi: 1) det kræver ikke en ekstra sekvens tag at skelne syntetiske snRNAs danne deres endogene modparter, som er særligt vigtigt for korte RNAs med lidt plads til indsættelse af ekstra tag sekvens; 2) det giver mulighed for analyse af sekvenser, der er vigtige for Biogenesis. For eksempel, SM sekvens er afgørende for SM ring samling og re-import i Nucleus6. Når snRNAs er udtrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvens er forringet i cytoplasmaet og ikke nå kernen og Cajal organer7. Men, snRNAs uden SM sekvens kan være direkte microinjiceres i kernen og dermed en potentiel rolle af SM sekvens i Cajal Body lokalisering assayed.
Her beskriver vi i detaljer en mikroinjektionsmetode, som vi anvendte til at bestemme snRNA-sekvenser, der er nødvendige for at målrette snRNAs ind i Cajal-kroppen5. Vi viste, at SM og SMN bindende sites er sammen nødvendige og tilstrækkelige til at lokalisere ikke kun snRNAs men forskellige korte ikke-kodning RNAs i Cajal kroppen. Baseret på mikroindsprøjtning samt andre beviser, foreslog vi, at SM ring samlet på SM binding site er Cajal Body lokaliserings signal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskæftigede mikroinjektion af fluorescently mærkede snRNAs for at bestemme sekvenser, som er vigtige for snRNA-lokalisering i nukleare Cajal-kroppe. På grund af hurtig og ret simpel tilberedning af mærkede RNAs (udarbejdelse af DNA-skabelon ved PCR efterfulgt af in vitro-transskription) giver metoden en effektiv analyse af, hvordan forskellige sekvenser bidrager til RNA-lokalisering. På relativt kort tid, vi var i stand til at analysere ti forskellige sletninger eller erstatninger af U2 snRNA (reference<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den tjekkiske videnskabs fond (18-10035S), det nationale bæredygtigheds program I (LO1419), institutionel støtte (RVO68378050), den europæiske fond for regional udvikling (CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775) og tilskuds organet for Charles University (GAUK 134516). Vi anerkender endvidere den lette mikroskopi kerne facilitet, IMG CAS, Prag, Tjekkiet (støttet af tilskud (tjekkisk-bioimaging-LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
