Summary

Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

Published: August 06, 2019
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Summary

Biogenese von spliceosomals snRNAs ist ein komplexer Prozess mit verschiedenen Zellkompartimenten. Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend gekennzeichneten snRNAs eingesetzt, um deren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen.

Abstract

Die Biogenese von spliceosomalen snRNAs ist ein komplexer Prozess, der sowohl nukleare als auch zytoplasmatische Phasen einbezieht, und der letzte Schritt findet in einem nuklearen Kompartiment namens Cajal-Körper statt. Sequenzen, die eine direkte snRNA-Lokalisierung in diese subnukleare Struktur direkt machen, sind jedoch bis vor kurzem nicht bekannt. Um Sequenzen zu bestimmen, die für die Akkumulation von snRNAs in Cajal-Körpern wichtig sind, verwendeten wir mikroinjection von fluoreszierend markierten snRNAs, gefolgt von ihrer Lokalisierung in Zellen. Zuerst bereiteten wir snRNA-Deletionsmutanten, synthetisierte DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription und transkribierte SnRNAs in Gegenwart von UTP in Verbindung mit Alexa488. Beschriftete snRNAs wurden mit 70 kDa-Dextran konjugiert mit TRITC gemischt und mikroinjiziert in den Kern oder das Zytoplasma menschlicher HeLa-Zellen. Die Zellen wurden für 1 h inkubiert und fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert, während SnRNAs und Dextran, die als Marker der nuklearen oder zytoplasmatischen Injektion dienen, direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden. Diese Methode ermöglicht effiziente und schnelle Tests, wie verschiedene Sequenzen die RNA-Lokalisierung in Zellen beeinflussen. Hier zeigen wir die Bedeutung der Sm-Bindungssequenz für die effiziente Lokalisierung von snRNAs in den Cajal-Körper.

Introduction

DIE RNA-Spleißung ist einer der entscheidenden Schritte in der Genexpression, der durch einen großen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleceoom genannt wird, katalysiert wird. Insgesamt sind mehr als 150 Proteine und 5 kleine nukleare RNAs (snRNAs) in verschiedenen Stadien des Spleißwegs in das Spleißmittel integriert. U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs beteiligen sich an der Spleißung großer GU-AG-Introns. Diese snRNAs verbinden das Sifasam als vorgeformte kleine kernnukleare Ribonukleoproteinpartikel (snRNPs), die snRNA, sieben Sm-Proteine enthalten, die mit snRNA (oder Like-Sm-Proteinen, die mit der U6 snRNA assoziiert werden) und 1-12 Proteine, die für jeden snRNP spezifisch sind, assoziiert werden.

Die Montage von snRNPs umfasst zytoplasmatische und nukleare Stadien. Neu transkribierte snRNA wird in das Zytoplasma exportiert, wo sie einen Ring erhält, der aus sieben Sm-Proteinen zusammengesetzt ist. Der Sm-Ring dient anschließend als Signal für den snRNA-Re-Import zurück in den Kern. Defekte snRNAs, die sich nicht mit Sm-Proteinen verbinden, werden im Zytoplasma1beibehalten. Neu importierte snRNPs erscheinen zuerst im Cajal-Körper, wo sie auf snRNP-spezifische Proteine treffen und ihre Reifung beenden (in Referenz2,3). Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Hemmung der endgültigen Reifungsschritte zur Sequestrierung unreifer SnRNPs in Cajal-Körpern4,5führt. Wir haben ein Modell vorgeschlagen, bei dem die endgültige snRNP-Reifung unter Qualitätskontrolle steht, die die Zugabe von snRNP-spezifischen Proteinen und die Bildung aktiver snRNPs überwacht. Molekulare Details darüber, wie Zellen zwischen richtig zusammengesetzten reifen und aberranten unreifen Partikeln unterscheiden, bleiben jedoch schwer fassbar.

Um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die für die Ausrichtung und Akkumulation von snRNAs in nuklearen Cajal-Körpern unerlässlich sind, haben wir beschlossen, Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs einzusetzen. Microinjection war eine Methode der Wahl, weil: 1) es erfordert keine zusätzliche Sequenz-Tag, um synthetische snRNAs zu unterscheiden bilden ihre endogenen Gegenstücke, die besonders wichtig für kurze RNAs mit wenig Platz für das Einfügen von zusätzlichen Tag-Sequenz ist; 2) es ermöglicht die Analyse von Sequenzen, die für die Biogenese wichtig sind. Beispielsweise ist die Sm-Sequenz für die Sm-Ringmontage und den erneuten Import in den Kern6unerlässlich. Wenn snRNAs in der Zelle exprimiert werden, werden snRNAs, denen die Sm-Sequenz fehlt, im Zytoplasma abgebaut und erreichen nicht den Kern und die Cajal-Körper7. SnRNAs ohne die Sm-Sequenz können jedoch direkt in den Zellkern injiziert werden und somit eine mögliche Rolle der Sm-Sequenz in der Cajal-Körperlokalisierung sprossiert.

Hier beschreiben wir detailliert eine Mikroinjektionsmethode, die wir angewendet haben, um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die notwendig sind, um snRNAs in den Cajal-Körper5zu zielen. Wir haben gezeigt, dass Sm- und SMN-Bindungsstellen zusammen notwendig und ausreichend sind, um nicht nur snRNAs, sondern auch verschiedene kurze nicht-kodierende RNAs in den Cajal-Körper zu lokalisieren. Basierend auf Mikroinjektionen und anderen Beweisen schlugen wir vor, dass der auf der Sm-Bindungsstelle montierte Sm-Ring das Cajal-Körperlokalisierungssignal ist.

Protocol

1. Herstellung von snRNAs für die Mikroinjektion Erstellen Sie eine DNA-Vorlage mit der abendfüllenden oder abgeschnittenen/mutierten Version von snRNA by PCR unter Verwendung eines folgenden PCR-Setups: 98 °C für 60 s, 98 °C für 15 s, 68 °C für 30 s, 72 °C für 1 min, 98 °C für 15 s für 35x und 72 °C für 5 min. Die Vorwärtsgrundierung muss eine Promotorsequenz für die In-vitro-Transkription vor dem ersten transkribierten Nukleotid enthalten. Verstärken Sie die U2-SnRNA-Sequenz mit de…

Representative Results

Um die SnRNA-Lokalisierung und die Rolle der Sm-Bindungsstelle im Cajal-Körper-Targeting zu überwachen, haben wir eine DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor und entweder der in voller Länge U2-SnRNA oder U2-SnRNA ohne die sieben Nukleotide (AUUUUUG) vorbereitet, die die Sm-Bindungsstelle bilden. snRNAs wurden in vitro transkribiert, isoliert und mit TRITC-gekoppeltem Dextran-70kDa gemischt. Wir haben das In-vitro-Transkribierte snRNA mikroinjiziert in den Zellkern oder das Zytoplasma von HeLa-Zellen. <p class="jove_cont…

Discussion

Wir verwendeten Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs, um Sequenzen zu bestimmen, die für die snRNA-Lokalisierung in nuklearen Cajal-Körpern wichtig sind. Durch die schnelle und recht einfache Vorbereitung von markierten RNAs (Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR gefolgt von In-vitro-Transkription) bietet die Methode eine effektive Analyse, wie verschiedene Sequenzen zur RNA-Lokalisierung beitragen. In relativ kurzer Zeit konnten wir zehn verschiedene Deletionen oder Substitutionen der U2 snRNA analys…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (18-10035S), dem Nationalen Nachhaltigkeitsprogramm I (LO1419), der institutionellen Unterstützung (RVO68378050), dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) und der Karlsuniversität (GAUK 134516). Wir würdigen ferner die Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tschechische Republik (unterstützt durch Stipendien (Czech-Bioimaging – LM2015062).

Materials

ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

References

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Cite This Article
Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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