Summary

Análisis de la localización de ARNS spliceosomal en células hela humanas con microinyección

Published: August 06, 2019
doi:

Summary

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que involucra varios compartimentos celulares. Aquí, empleamos microinyección de nmRNA etiquetados fluorescentemente con el fin de monitorear su transporte dentro de la célula.

Abstract

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que implica fases nucleares y citoplasmáticas y el último paso se produce en un compartimiento nuclear llamado cuerpo Cajal. Sin embargo, las secuencias que dirigen la localización de ARN SnRNA en esta estructura subnuclear no se han conocido hasta hace poco. Para determinar secuencias importantes para la acumulación de SnRNAs en cuerpos de Cajal, empleamos microinyección de snRNAs etiquetados fluorescentemente seguido de su localización dentro de las células. Primero, preparamos mutantes de eliminación de SnRNA, sintetizamos plantillas de ADN para transcripción in vitro y snRNAs transcritos en presencia de UTP junto con Alexa488. Los snRNA etiquetados se mezclaron con 70 kDa-Dextran conjugados con TRITC, y microinyectados al núcleo o al citoplasma de células HeLa humanas. Las células fueron incubadas durante 1 h y fijas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta, mientras que los snRNA y el dextran, que sirve como marcador de inyección nuclear o citoplasmamática, se observaron directamente utilizando un microscopio de fluorescencia. Este método permite realizar pruebas eficientes y rápidas de cómo varias secuencias influyen en la localización del ARN dentro de las células. Aquí, mostramos la importancia de la secuencia de encuadernación Sm para la localización eficiente de los snRNAs en el cuerpo de Cajal.

Introduction

El empalme de ARN es uno de los pasos cruciales en la expresión génica, que es catalizado por un gran complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma. En total, más de 150 proteínas y 5 pequeños ARN nucleares (snRNA) se integran en el espliceosoma en diferentes etapas de la vía de empalme. Los nmarendes U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el empalme de los principales intrones GU-AG. Estos snRNAs se unen al spliceosoma como pequeñas partículas de ribonucleoproteína sinformato preformados (snRNPs) que contienen snRNA, siete proteínas Sm asociadas con el ARNs (o proteínas Like-Sm, que se asocian con el ARNS U6) y 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.

El montaje de los snRNPs implica etapas citoplasmáticas y nucleares. El ARNN recién transcrito se exporta al citoplasma donde adquiere un anillo ensamblado a partir de siete proteínas Sm. El anillo Sm sirve posteriormente como señal para el ARN SnRNA re-importación de nuevo al núcleo. Los snRNA defectuosos que no se asocian con las proteínas Sm se retienen en el citoplasma1. Los snRNP recién importados aparecen por primera vez en el cuerpo de Cajal, dondese encuentran con proteínas específicas de snRNP y terminan su maduración (revisada en la referencia 2,3). Recientemente mostramos que la inhibición de los pasos finales de maduración resulta en el secuestro de snRNPs inmaduros en cuerpos Cajal4,5. Propusimos un modelo donde la maduración final de snRNP está bajo control de calidad que monitorea la adición de proteínas específicas de snRNP y la formación de snRNPs activos. Sin embargo, los detalles moleculares de cómo las células distinguen entre partículas maduras correctamente ensambladas y aberrantes inmaduras siguen siendo esquivas.

Para determinar las secuencias de ARNQue que son esenciales para la focalización y acumulación de ARNA en cuerpos nucleares de Cajal, decidimos emplear microinyección de snRNA etiquetados fluorescentemente. La microinyección fue un método de elección porque: 1) no requiere una etiqueta de secuencia adicional para distinguir los snRNA sintéticos forman sus homólogos endógenos, lo que es especialmente importante para ARN cortos con poco espacio para la inserción de secuencia de etiquetas adicionales; 2) permite el análisis de secuencias que son importantes para la biogénesis. Por ejemplo, la secuencia Sm es esencial para el montajedel anillo Sm y reimportar en el núcleo 6. Cuando los snRNA se expresan en la célula, los NMNAr que carecen de la secuencia de Sm se degradan en el citoplasma y no alcanzan el núcleo y los cuerpos de Cajal7. Sin embargo, los snRNA sin la secuencia Sm se pueden microinyectar directamente en el núcleo y, por lo tanto, se puede ensayar un papel potencial de la secuencia Sm en la localización del cuerpo de Cajal.

Aquí, describimos en detalle un método de microinyección que aplicamos para determinar las secuencias de ARNS necesarios para apuntar a los NMNm en el cuerpo de Cajal5. Mostramos que los sitios de unión Sm y SMN son juntos necesarios y suficientes para localizar no sólo los ARN de snRNA, sino varios ARN cortos no codificantes en el cuerpo de Cajal. Basándonos en la microinyección, así como en otras pruebas, propusimos que el anillo Sm ensamblado en el sitio de unión Sm sea la señal de localización del cuerpo Cajal.

Protocol

1. Preparación de snRNAs para microinyección Preparar una plantilla de ADN que contenga la versión de longitud completa o truncada/mutada de snRNA por PCR utilizando una siguiente configuración de PCR: 98 oC para 60 s, 98 oC para 15 s, 68 oC para 30 s, 72 oC para 1 min, 98 oC para 15 s para 35x , y 72 oC durante 5 min. La imprimación delantera debe contener una secuencia promotora de la transcripción in vitro justo aguas arriba del primer nucleótido transcrito. Amplifique la secuencia de ARN U2…

Representative Results

Para monitorear la localización de SnRNA y el papel del sitio de unión SM en la segmentación del cuerpo de Cajal, preparamos una plantilla de ADN que contiene el promotor T7 y el snRNA U2 de longitud completa o el snRNA U2 que carece de los siete nucleótidos (AUUUUUU) que forman el sitio de unión SM. los snRN fueron transcritos in vitro, aislados y mezclados con dextran-70kDa acoplado a TRITC. Hemos microinyectado la mezcla que contiene ARNn transcrito in vitro en el núcleo o el citoplasma de las células de HeLa.<…

Discussion

Empleamos microinyección de NMNM con etiqueta fluorescente para determinar secuencias importantes para la localización de ARNEnS en cuerpos nucleares de Cajal. Debido a la preparación rápida y bastante simple de ARN etiquetados (preparación de la plantilla de ADN por PCR seguida de transcripción in vitro), el método ofrece un análisis eficaz de cómo varias secuencias contribuyen a la localización del ARN. En relativamente poco tiempo, pudimos analizar diez eliminaciones o sustituciones diferentes del ARNU U2 (r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Checa de la Ciencia (18-10035S), el Programa Nacional de Sostenibilidad I (LO1419), el apoyo institucional (RVO68378050), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) y la Agencia de Subvenciones de Universidad Charles (GAUK 134516). Además, reconocemos el Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (apoyado por subvenciones (Checo-Bioimagen – LM2015062).

Materials

ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP ThermoFisher C11403 Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796 Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector Eppendorf 5247000013
Femtotips II Eppendorf 930000043 Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glycogen ThermoFisher AM9510 Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips Ibidi 10817 Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator Eppendorf 5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue Jena Bioscience NU-853-1 Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit ThermoFisher AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 Paul Marienfeld GmbH 111520 For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 Paul Marienfeld GmbH 117520 For high resolution images
Microscope DeltaVision GE Healthcare For image acquisition
Microscope DMI6000 Leica For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade EMS 15714 Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1 Sigma-Aldrich P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG,
Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT
Sigma-Aldrich T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase BioLab M0530L
RNasin Plus Promega N2615 Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa Sigma-Aldrich T1162 Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100 Serva 37240 Dissolved in water, stock concentration 10%

References

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Cite This Article
Roithová, A., Staněk, D. Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection. J. Vis. Exp. (150), e59797, doi:10.3791/59797 (2019).

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