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Biology

माउस रक्त से प्लेटलेट्स की शुद्धि

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59803
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine

Summary

यहां, माउस रक्त एक विरोधी स्कंधी की उपस्थिति में एकत्र किया गया था । कम गति के अपकेंद्रण का उपयोग करके प्लेटलेट्स को आयोहेक्सॉल ग्रैडिएंट माध्यम से शुद्ध किया गया । प्लेटलेट्स थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय अगर वे व्यवहार्य थे की जांच कर रहे थे । शुद्घ प्लेटलेट्स की गुणवत्ता का विश्लेषण फ्लो सायटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया ।

Abstract

प्लेटलेट्स पूरे रक्त से शुद्ध कर रहे हैं उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, जो लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) से मुक्त होना चाहिए, सफेद रक्त कोशिकाओं (WBC), और प्लाज्मा प्रोटीन. हम यहां माउस रक्त से प्लेटलेट्स की शुद्धि का उपयोग तीन गुना अधिक iohexol ढाल माध्यम रक्त नमूना मात्रा और एक झूलते बाल्टी रोटर में ४०० x g पर 20 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर में अपकेंद्रण के सापेक्ष । शुद्घ प्लेटलेट्स की रिकवरी 18.2-385% थी, और शुद्ध किए गए प्लेटलेट्स एक विश्राम अवस्था में थे, जिसमें आरबीसी और WBC की कोई महत्वपूर्ण संख्या शामिल नहीं थी । थ्रोम्बिन के साथ इलाज किया शुद्ध प्लेटलेट्स ९३% सक्रियण तक दिखाया, उनकी व्यवहार्यता का संकेत है । हम पुष्टि की है कि शुद्ध प्लेटलेट्स पर्याप्त प्रवाह cytometric और सूक्ष्म मूल्यांकन का उपयोग कर शुद्ध कर रहे हैं । इन प्लेटलेट्स जीन अभिव्यक्ति, सक्रियण, ग्रेन्युल रिहाई, एकत्रीकरण, और आसंजन assays हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग अन्य प्रजातियों के रक्त से भी प्लेटलेट्स की शुद्धि के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

प्लेटलेट्स रक्त का एक घटक है कि रक्त वाहिका में नुकसान के जवाब में रक्त के थक्के के एक प्रारंभकर्ता के रूप में कार्य कर रहे हैं । वे चोट के स्थल पर बर्तन दीवार1प्लग करने के लिए इकट्ठा । प्लेटलेट्स thrombopoietin के प्रभाव के तहत अस्थि मज्जा के megakaryocytes से व्युत्पंन कोशिका द्रव्य के anucleate टुकड़े कर रहे हैं और परिसंचरण2दर्ज करें । वे metabolically सक्रिय और intracellular संकेतन cascades है कि प्लेटलेट प्रसार, एकत्रीकरण, और hemostatic प्लग गठन1,3में परिणाम को सक्रिय करने से extracellular वातावरण संवेदन के रूप में माना जाता है । Hemostasis/थ्रोम्बोसिस और घाव भरने के अलावा4, प्लेटलेट्स मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और मेटास्टैटिस3,5,6,7, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ८।

प्लेटलेट्स रक्त से शुद्ध करने के लिए अपने जैव रासायनिक और शारीरिक गुण है, जो अंय रक्त घटकों से मुक्त होना चाहिए अध्ययन कर रहे हैं । के बाद से लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और सफेद रक्त कोशिकाओं (wbc) काफी अधिक शाही सेना और प्रोटीन प्लेटलेट्स9,10की तुलना में होते हैं, इन कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की उपस्थिति भी आरएनए के transcriptomic और proteomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और प्लेटलेट्स से प्राप्त प्रोटीन । हमने पाया है कि इस तरह के विरोधी के रूप में थ्रोम्बिन बांध एंटीबॉडी के साथ सक्रिय शुद्ध प्लेटलेट्स-gpiib/

के बाद से प्लेटलेट्स नाजुक हैं, यह संभव के रूप में हल्का के रूप में नमूनों का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि प्लेटलेट्स सक्रिय कर रहे हैं, वे अपने कणिका सामग्री जारी है और अंततः नीचा । इसलिए, प्लेटलेट्स के कार्यात्मक गुणों को बरकरार रखने के लिए, अलगाव के दौरान प्लेटलेट की निष्क्रियता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है । कई प्रोटोकॉल से प्लेटलेट्स की अलगाव मानव, कुत्ता, चूहा, और गैर मानव रहनुमा विभिंन तरीकों1,10,11,12द्वारा वर्णित है । कुछ विधियों में से कई चरणों की आवश्यकता होती है जैसे प्लेटलेट-रिच प्लाज्मा का एकत्रीकरण, पृथक्करण स्तंभ द्वारा निस्पंदन, आरबीसी के साथ प्लेटलेट्स का नकारात्मक चयन-और WBC-विशिष्ट एंटीबॉडी चुंबकीय मोतियों को संयुग्मित, और इतने पर, जो समय लेने वाली और प्लेटलेट्स और उनकी सामग्री को नीचा कर सकते हैं ।

फोर्ड और उनके सहयोगियों ने iohexol माध्यम11का उपयोग करते हुए मानव रक्त से प्लेटलेट शुद्धि का वर्णन किया । इस विधि को शुद्धि के दौरान रक्त के नमूने और माध्यम का एक समान मात्रा का उपयोग करता है । चूंकि मनुष्य अधिक मात्रा में रक्त प्राप्त करते हैं, इसलिए प्लेटलेट्स को शुद्ध करना अपेक्षाकृत आसान होता है ।

Iohexol एक सार्वभौमिक घनत्व ढाल अक्रिय माध्यम है कि स्वतंत्र रूप से पानी में घुलनशील है और न्यूक्लीय एसिड, प्रोटीन, पॉलीसैकेराइड, और न्यूकोप्रोटीन13,14के प्रभाजन में प्रयोग किया जाता है । यह कम परासरणीयता है और गैर विषैले है, इस प्रकार यह बरकरार रहने वाले कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक आदर्श माध्यम बना11. यह एक गैर-पर्टिकुलेट माध्यम है; इसलिए, एक ढाल में कोशिकाओं के वितरण hemocytometer, फ्लो cytometer, या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । यह कमजोर पड़ने के बाद कोशिकाओं या सेलुलर टुकड़ों के एंजाइमेटिक या रासायनिक प्रतिक्रिया के अधिकांश के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।

चूहा कई मानव रोगों15,16,17,18के लिए एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है । वहां कुछ प्रकाशित लेख है कि माउस प्लेटलेट्स19,20की शुद्धि का वर्णन कर रहे हैं । हालांकि, चूहे रक्त की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा है, जो यह मुश्किल प्लेटलेट्स शुद्ध करने के लिए बनाता है पैदावार । यदि ग्रैडिएंट माध्यम और रक्त नमूनों की समान छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो अपकेंद्रण के बाद प्लेटलेट परत को आरबीसी-डब्ल्यूबीसी परत से स्पष्ट रूप से अलग नहीं किया जा सकता । इस अनुच्छेद में, हम तीन गुना अधिक iohexol ढाल मध्यम रक्त नमूना मात्रा और कम गति के अपकेंद्रण के सापेक्ष माध्यम के साथ माउस प्लेटलेट शुद्धि की एक त्वरित और सरल विधि का वर्णन किया है । हम भी थ्रोम्बिन के साथ शुद्ध प्लेटलेट्स सक्रिय है और प्रवाह कोशिका मिति और microscopy के साथ उनकी गुणवत्ता की जांच की ।

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Protocol

माउस रक्त संग्रह उचित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति की मंजूरी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए ।

नोट: प्लेटलेट शुद्धीकरण प्रोटोकॉल चित्रा 1में एक प्रवाह आरेख में वर्णित है ।

1. रक्त का संग्रह

  1. एक polypropylene ट्यूब में ३.२% सोडियम साइट्रेट (पीएच ७.२) के 25 μL एक विरोधी स्कंदक और ०.४ के रूप में Gly समर्थक Arg-प्रो (GPRP) जोड़ें ।
  2. C57BL/6 माउस से लगभग २०० μL रक्त ले लीजिए रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव का उपयोग कर ।
    नोट:     रक्त उम्र या लिंग की परवाह किए बिना माउस तनाव के किसी भी प्रकार से एकत्र किया जा सकता है ।
    1. माउस संवेदनीकरण के लिए चैंबर के किसी भी प्रकार में isoflurane के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
      नोट: संज्ञाहरण की गहराई में वृद्धि की श्वसन और कम आंदोलन के संकेत से जांच की है । माउस संज्ञाहरण चैंबर के आंदोलन के लिए प्रतिक्रिया नहीं करनी चाहिए, या संभाला जा रहा है । यदि माउस आंदोलन या हैंडलिंग के लिए उत्तरदायी है, तो यह संज्ञाहरण कक्ष में रखने के लिए और अधिक समय की आवश्यकता है ।
    2. 1.2.2 माउस के दाएं या बाएं पलक खोलें और आंख के संवहनी जाल में ७.५ सेमी (०.१२ सेमी व्यास) केशिका ट्यूब डालें ।
    3. केशिका ट्यूब एक आधा बारी मोड़ जबकि कैशिका नली के लिए दबाव लागू करने के लिए जहाजों को तोड़ने के लिए और रक्त प्रवाह शुरू. पशु संग्रह की शीशी पर उल्टा नीचे पकड़ो केशिका कार्रवाई से भरा जाएगा ।
    4. एक बार रक्त की उचित मात्रा एकत्र की है, केशिका ट्यूब निकालें और धुंध के साथ पलक पर 30 एस के लिए हल्के दबाव लागू करने के द्वारा आंख बंद करो । एक बार खून बह रहा बंद कर दिया है, उसके पिंजरे के लिए माउस वापस और खून बह रहा है के लिए मॉनिटर ।
    5. आघात के लिए आंखों की जांच करें 1-2 दिनों के बाद रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव । अध्ययन से किसी भी माउस को हटाने की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में आंख को महत्वपूर्ण आघात के लक्षण दिखा रहा है और euthanize ।
      नोट: चूहे को किसी भी तरह के उपचार से नहीं गुजरना चाहिए जो रक्त संग्रह से पहले कम से दो सप्ताह तक प्लेटलेट्स को बाधित कर सकता है । रक्त के नमूने के लिए माउस खून बह रहा है की एक घंटे के भीतर प्लेटलेट शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

2. प्लेटलेट शुद्धि

नोट: प्लेटलेट शुद्धि उनके क्षरण को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए । सुनिश्चित करें कि अभिकर्मकों और वाद्ययंत्रों का ताप 18 से 22 ° ब् के बीच हो । प्लेटलेट अवक्रमण को रोकने के लिए, प्रक्रिया के दौरान तेजी से pipetting और जोरदार मिलाते से बचना चाहिए ।

  1. Iohexol ग्रेडिएंट मीडियम का ६०० μL जोड़ें (०.८५% सोडियम क्लोराइड में 12% iohexol पाउडर, 5 एमएम ट्राइसिन, पीएच ७.२)11 को १.५ मिलीलीटर ट्यूब में डालें ।
  2. रक्त और iohexol माध्यम के मिश्रण नहीं है, ताकि एक विस्तृत बोर पिपेट टिप के साथ ढाल माध्यम के शीर्ष पर ट्यूब के ऊपर धीरे से नीचे की ओर से नीचे खून के नमूने के २०० μL जोड़ें (चित्र 2a) ।
  3. अपकेंद्रित्र ४०० x g पर 20 मिनट के लिए 20 कम से कम त्वरण और मंदी के साथ एक झूल बाल्टी रोटर में ट्यूब का नमूना ।
  4. प्लेटलेट-रिच परत के अधिकांश और प्लेटलेट-गरीब परत का एक छोटा सा अंश (कुल ३०० से ४०० μl) आरबीसी और wbc परतों परेशान बिना एक व्यापक बोर पिपेट टिप का उपयोग कर लीजिए (चित्र 2b) । एक नई ट्यूब के लिए प्लेटलेट नमूना स्थानांतरण ।
    नोट: यदि प्लेटलेट काउंट रक्त में कम है या रक्त की एक छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो प्लेटलेट-रिच लेयर और प्लेटलेट-खराब लेयर को एकल परत के रूप में देखा जा सकता है ।
  5. प्लेटलेट नमूने के लिए PBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें, उलटा द्वारा मिश्रण है, और 10 मिनट के लिए ८०० x g पर एक झूल बाल्टी रोटर में 20 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र । समाधान पूरी तरह से छोड़ें और PBS के २०० μL जोड़ने के लिए हल्के pipetting के साथ प्लेटलेट्स resuspend ।
    नोट: यह कदम वैकल्पिक है, के रूप में यह ढाल मध्यम और प्लाज्मा प्रोटीन निकालता है और प्लेटलेट्स की संवेदनशीलता को एगोनिस्ट के लिए इस तरह के thrombin के रूप में बढ़ जाती है । चूंकि विभिन्न अपकेंद्रित्र में विभिन्न कार्यक्रम होते हैं, इसलिए धीमी गति/मंदी का निर्धारण सेंटअपज के उपयोगकर्ता मैनुअल को पढ़कर किया जा सकता है ।
  6. प्लेटलेट्स की गणना करने के लिए एक नई ट्यूब में इस नमूने के 30 μL स्थानांतरण । बचे हुए प्लेटलेट्स का इस्तेमाल बायोकेमिकल और शारीरिक अकहते हैं जैसे प्लेटलेट एक्टिवेशन, एग्रीगेशन, ग्रेन्युल रिलीज आदि के लिए किया जा सकता है ।
  7. आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, ८०० x जी में प्लेटलेट नमूना 10 मिनट के लिए गोली प्लेटलेट्स के लिए केंद्राचंक । Supernatant पूरी तरह से गोली परेशान बिना छोड़ें । प्लेटलेट्स को lyse करने के लिए आरएनए या प्रोटीन lysis बफर की वांछित मात्रा जोड़ें ।

3. प्लेटलेट्स गिनती

  1. कमजोर पड़ने के बिना पूरे रक्त कोशिकाओं गिनती और प्लेटलेट्स शुद्ध (2 से 5-PBS के साथ गुना पतला) एक स्वचालित सेल विश्लेषक का उपयोग कर । गिनती के लिए 30 से ५० μL नमूनों का उपयोग करें ।
  2. नमूना की मात्रा से गुणा करके प्लेटलेट्स की कुल संख्या की गणना.
  3. शुद्ध प्लेटलेट्स की प्राप्ति/रिकवरी के प्रतिशत की गणना करें ।
  4. शुद्ध प्लेटलेट नमूने में आरबीसी और WBC गणना (५० के लिए पतला १००-PBS के साथ गुना) एक hemocytometer और माइक्रोस्कोप के साथ ।

4. प्लेटलेट सक्रियण

  1. एक ट्यूब में, 1 से २,०००,००० शुद्ध प्लेटलेट्स अप करने के लिए १०० μL धुंधला बफर (2% भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS के साथ PBS) जोड़ें ।
  2. नमूनों की एक से अधिक संख्या के लिए, एक मास्टर मिक्स एंटीबॉडी के साथ 1 μL (०.५ मिलीग्राम/एमएल) निम्न: PE-Cy7 चूहा विरोधी माउस TER ११९, पीई चूहा विरोधी माउस CD45, FITC चूहा विरोधी CD41, और APC चूहा विरोधी माउस/ क्रमशः सक्रिय प्लेटलेट्स । कोशिकाओं धुंधला के लिए ट्यूबों के लिए मास्टर मिश्रण जोड़ें । थ्रोम्बिन न जोड़ें ।
  3. एक और ट्यूब में, २,०००,००० में शुद्ध प्लेटलेट्स के लिए 1 जोड़ने के लिए १०० μL धुंधला बफर की, और ०.४ मिमी GPRP पेप्टाइड. प्लेटलेट्स को सक्रिय करने के लिए थ्रोम्बिन जोड़ें और चरण ४.२ के बाद कोशिकाओं दाग.
    नोट: प्लेटलेट सक्रियण के माध्यम से सकल या थक्का गठन को रोकने के लिए थ्रोम्बिन जोड़ने से पहले जीपीआरपी को नमूने में जोड़ा जाना चाहिए । थ्रोम्बिन एकाग्रता प्लेटलेट्स की अच्छी सक्रियण प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । प्लेटलेट सक्रियण के बाद, प्रवाह कोशिका मिति द्वारा नमूनों के अधिग्रहण के दौरान घटना के मायने कम हो जाते हैं ।
  4. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक ट्यूब और ०.४ मिमी GPRP पेप्टाइड में १०० μL धुंधला बफर अप करने के लिए में पूरे रक्त के 1 μL जोड़ें । प्लेटलेट्स को सक्रिय करने के लिए थ्रोम्बिन जोड़ें. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, १०० μL करने के लिए धुंधला बफर के ऊपर में पूरे रक्त की 1 μL जोड़ें । नेगेटिव कंट्रोल सैंपल में थ्रोम्बिन न जोड़ें । चरण ४.२ निंन कक्षों पर दाग ।
  5. प्रवाह कोशिका मिति के लिए समप्ररूप नियंत्रण, लेबल के साथ 5 ट्यूबों बिना दाग, पीई-Cy7, पीई, fitc, और APC । कोशिकाओं को दाग करने के लिए लेबल ट्यूबों के लिए संबंधित एंटीबॉडी की 1 μl, और धुंधला बफर के १०० μL जोड़ें ।
  6. इनक्यूबेट के नमूने अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए दागते हैं ।
  7. प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर जोड़कर नमूनों को धो लें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर अपकेंद्रित्र । गुटिका को डिलॉकिंग किए बिना अभिरंजक बफर को सावधानीपूर्वक त्यागें ।
  8. प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला बफर के ३०० μL जोड़ें, mildly मिश्रण, और एक FACS ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । अंधेरे में दाग नमूनों की दुकान जब तक एक प्रवाह cytometer के साथ विश्लेषण किया ।

5. फ्लो की Cytometry प्लेटलेट्स का विश्लेषण

  1. एक नया प्रयोग बनाएं और लॉग आगे उत्पंन तितर बितर बनाम लॉग साइड तितर बितर डॉट भूखंडों और Ter119 PE-Cy7 (आरबीसी), CD45 पीई (WBC), CD41 FITC (प्लेटलेट्स), और CD62P APC (सक्रिय प्लेटलेट्स) के लिए चुना रणनीति के अनुसार के लिए गेट्स निरुपित FACS दिवा सॉफ्टवेयर में प्रयोग.
    1. जनसंख्या पदानुक्रम दिखाएं जनसंख्या टैब के अंतर्गत का चयन करके खोलें जनसंख्या पदानुक्रम गेटिंग रणनीति की जाँच और सही ढंग से फाटकों का नाम बदलने के द्वारा संपादित करें ।
    2. आंकड़े दृश्य बनाएंचुनकर खोलें आंकड़े देखें । सांख्यिकी दृश्य को राइट क्लिक करके और आंकड़े संपादित करेंका चयन करके उपयोगकर्ता की प्राथमिकताओं के अनुसार आंकड़े देखें को संपादित करें ।
    3. प्रत्येक गेट के लिए एक रंग चुनें जो जनसंख्या के अनुरूप बॉक्स पर डबल क्लिक करके लेआउट के दृश्य पहलू को बढ़ाता है ।
  2. Cytometer खिड़की में, पैरामीटर टैब पर क्लिक करें और मापदंडों के लिए voltages समायोजित करने के लिए भूखंडों पर ब्याज की जनसंख्या कल्पना ।
  3. प्रत्येक पैरामीटर के लिए voltages समायोजित करें ताकि नकारात्मक आबादी सकारात्मक आबादी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । मुआवजा नियंत्रण के लिए नमूनों की रिकॉर्डिंग से पहले, जांच लें कि एकल दाग सकारात्मक नियंत्रण पैमाने पर कर रहे है (यह सुनिश्चित करें कि सकारात्मक चोटियों दिखाई और सही करने के लिए बहुत दूर नहीं कर रहे हैं) ।
    नोट: अगर सकारात्मक चोटियों से पैमाने पर कर रहे हैं, voltages सकारात्मक आबादी को देखने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  4. मुआवजा नियंत्रण (बिना दाग, पीई-Cy7, पीई, FITC, और APC) के लिए एकल रंग सना हुआ कोशिकाओं रिकॉर्ड.
  5. यदि सकारात्मक नियंत्रण द्वार ठीक से स्थापित नहीं कर रहे हैं, उंहें voltages बदल कर समायोजित करें ।
  6. मुआवजे की गणना > के लिए प्रयोग ≫ मुआवजा सेटअपपर जाएं । केवल परिणामी विंडो में लागू करें चुनें ।
  7. कार्यपत्रक विंडो के ऊपर, बाईं ओर टॉगल करें बटन पर क्लिक करके वैश्विक कार्यपत्रक पर जाएं ।
  8. सकारात्मक नियंत्रण नमूना लोड और मुआवजे और फाटकों को समायोजित करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का अधिग्रहण ।
  9. फिर से नमूना लोड और जांच करें कि प्रत्येक भूखंड fluorochrome दाग एंटीबॉडी के आधार पर अपेक्षित सेल आबादी से पता चलता है । अधिग्रहण और रिकॉर्ड पूरे रक्त के नमूनों और शुद्ध प्लेटलेट्स के लिए १०,००० घटनाओं के लिए १००,००० घटनाओं । अधिग्रहण पूरा हो गया है जब तक एक के बाद एक नमूने लोड.
  10. उपयुक्त भूखंडों और फाटकों के साथ सॉफ्टवेयर के साथ प्रवाह कोशिका मिति डेटा का विश्लेषण (चित्रा 3)

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Representative Results

प्लेटलेट शुद्धि का सारांश एक प्रवाह आरेख में वर्णित है (चित्रा 1). कदम एक थक्का की उपस्थिति में रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव का उपयोग कर माउस से रक्त का संग्रह शामिल हैं, iohexol ढाल माध्यम पर रक्त के नमूने के अलावा, एक झूलते बाल्टी रोटर में ४०० x g पर 20 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर । किसी भी दूषित कोशिकाओं का पता लगाने और प्लेटलेट्स को सक्रिय करने के लिए एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद माइक्रोस्कोपी और फ्लो कोशिमिति के साथ शुद्घ प्लेटलेट्स की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया ।

आयोहेक्सॉल ढाल माध्यम और रक्त के नमूने ने नली में दो अलग परतों का गठन किया, यदि रक्त को धीरे से मध्यम पर जोड़ा गया (चित्र 2a). हालांकि, यदि इस चरण में देरी होती है, तो अधिकांश रक्त नमूने माध्यम में विसरित हो सकते हैं और प्लेटलेट्स को शुद्ध करना मुश्किल हो सकता है । वाइड-बोर पिपेट युक्तियों ने प्लेटलेट्स के लिए कोई शारीरिक तनाव सुनिश्चित किया है जो प्लेटलेट्स की अखंडता को बनाए रखने और उनके क्षरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । अपकेंद्रण के दौरान धीमी गति से त्वरण ने iohexol माध्यम के साथ रक्त के नमूने के अनजाने मिश्रण को रोकने में मदद की और धीमी गति से होने वाली गिरावट को अपकेंद्रीकरण के बाद ढाल बनाए रखने में मदद की । शीर्ष (पुआल का रंग) परत प्लाज्मा निहित है और बरकरार रक्त कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के शामिल नहीं किया था, दूसरी परत (श्वेताभ) ऊपर से प्लेटलेट्स जो एक व्यापक बोर पिपेट टिप का उपयोग कर एकत्र किया गया था के बहुमत, तीसरी परत (पारदर्शी) था प्लेटलेट गरीब जो आंशिक रूप से नीचे परत (लाल) आरबीसी और WBC (चित्रा 2b) की आकांक्षा से बचने के लिए ध्यान से एकत्र किया गया था । प्लेटलेट-रिच लेयर और प्लेटलेट खराब लेयर को अगर ब्लड सैंपल में प्लेटलेट काउंट कम हुआ तो उसे अलग नहीं देखा जा सकता था । रक्त की मात्रा छोटी होने के बाद से आरबीसी और डब्ल्यूबीसी लेयर को अलग परतों के रूप में नहीं देखा जा सका । हालांकि, WBC एक सफेद परत रूपों, प्लेटलेट गरीब परत और आरबीसी परत के बीच buffy कोट कहा जाता है अगर रक्त की एक बड़ी मात्रा में शुद्धि के लिए प्रयोग किया जाता है10, 11. यह पूरी प्रक्रिया को 18 से 22 डिग्री सेल्सियस पर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है । उच्च तापमान और नमूनों की प्रशीतन दोनों गिरावट के कारण कम प्लेटलेट गिना गया ।

हमने पाया १८.२ को ३८.५% (२७.१ ± ६.५%, n = 12) वसूली/ उनकी व्यवहार्यता की जांच करने के लिए, शुद्ध प्लेटलेट नमूनों थ्रोम्बिन के साथ सक्रिय थे । उत्प्लाव-प्लेटलेट की जांच के बाद प्लेटलेट्स, सक्रिय प्लेटलेट्स, आरबीसी और WBC के लिए मार्कर के साथ धुंधला के बाद किया गया । पूरे रक्त में आरबीसी, डब्ल्यूबीसी, और प्लेटलेट्स के एक लघुगणकीय आगे बिखराव बनाम साइड स्कैटर डॉट प्लॉट (चित्र3 क) की अलग आबादी दिखाई दी, जबकि शुद्घ प्लेटलेट्स में आरबीसी और डब्ल्यूबीसी की नगण्य संख्याओं के साथ एक अलग जनसंख्या दिखाई दी (चित्र 3बी ). पूरे रक्त आरबीसी और WBC उन्हें विरोधी माउस Ter119 और विरोधी माउस CD45 एंटीबॉडी के साथ धुंधला के बाद दिखाया (चित्रा 3C) जबकि शुद्ध प्लेटलेट्स आरबीसी और wbc की नगण्य संख्या दिखाया (चित्रा 3 डी). हम एक खुर्दबीन के साथ शुद्ध प्लेटलेट नमूना मूल्यांकन और बरकरार आरबीसी और WBC की कोई महत्वपूर्ण संख्या नहीं देखा । इसलिए, RBC और WBC घटनाओं जो चित्र 3d में दिखाए गए थे RBC और wbc के टुकड़े क्रमशः TER119 और CD45, युक्त हो सकता है । शुद्ध प्लेटलेट्स जो थ्रोम्बिन के साथ इलाज नहीं किया गया लगभग कोई सक्रियण अपने आराम राज्य का संकेत दिखाया (चित्रा 3e), जबकि शुद्ध थ्रोम्बिन के साथ इलाज प्लेटलेट्स दिखाया ७१% सक्रियण (अप करने के लिए ९३% सक्रियण कुछ नमूनों में मनाया गया था) ( चित्रा 3F) उनकी व्यवहार्यता का संकेत है । हमने शुद्घ प्लेटलेट के नमूनों का सूक्ष्म मूल्यांकन भी किया जो थ्रोम्बिन के साथ उपचारित नहीं हुआ, जिसमें प्लेटलेट एकत्रीकरण (चित्र 4a) नहीं दिखाया गया, तथापि, थ्रोम्बिनके साथ उपचारित प्लेटलेट्स का गठन जो आगे उनकी व्यावहारिकता को दर्शाते हैं । प्रवाह cytometric और सूक्ष्म अध्ययन के आधार पर, हम पुष्टि की कि हमारे शुद्ध प्लेटलेट्स अच्छी गुणवत्ता थे ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस प्लेटलेट शुद्धि के लिए योजनाबद्ध आरेख. माउस से रक्त का नमूना एक एंटीकोकुलेन्ट की उपस्थिति में एकत्र किया जाता है । रक्त के नमूने को धीरे से Iohexol ग्रेडिएंट माध्यम पर जोड़ा जाता है और 20 मिनट के लिए 20 ° c पर ४०० x g पर अपकेंद्री किया जाता है । प्लेटलेट लेयर को नई नली में ट्रांसफर कर दिया जाता है । शुद्घ प्लेटलेट्स की गुणवत्ता माइक्रोस्कोपी और फ्लो सायटोमेट्री से चेक की जाती है । प्लेटलेट्स तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या पर संग्रहीत-८० ° c । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: । ओषहेक्सॉल प्रवणता माध्यम से अपकेंद्रण के पहले और बाद में माउस का रक्त । (क) आयोहेक्सॉल और रक्त के रूप में यदि रक्त के नमूने को सावधानीपूर्वक जोड़ा जाता है तो अपकेंद्रण से पहले दो पृथक परतें होती हैं । वाम पैनल योजनाबद्ध आरेख दिखाता है और सही पैनल वास्तविक छवि दिखाता है. (ख) चार पृथक परतों को ढाल माध्यम के साथ पूरे रक्त के अपकेंद्रण के बाद देखा जाता है । बाईं पैनल परतों की योजनाबद्ध आरेख से पता चलता है और सही पैनल वास्तविक छवि से पता चलता है. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: शुद्ध प्लेटलेट्स का प्रवाह cytometric विश्लेषण । (क) संपूर्ण रक्त आरबीसी, डब्ल्यूबीसी तथा प्लेटलेट आबादियों को दर्शाता है । (ख) शुद्धीकरण प्लेटलेट्स आरबीसी और डब्ल्यूबीसी घटनाओं के छोटे नंबरों को दर्शाते हैं । (ग) संपूर्ण रक् त आरबीसी तथा डब् ल् यूबीसी को एंटी-माउस Ter119 और एंटी-माउस CD45 से धुंधला होने के बाद प्रदर्शित करता है (घ) शुद्ध प्लेटलेट्स, एंटी-माउस Ter119 और एंटी-माउस CD45 के साथ धुंधला होने के बाद आरबीसी और डब्ल्यूबीसी की घटनाओं की नगण्य संख्या दर्शाती है । (ङ) एंटी-माउस CD41 और एंटी-माउस/ह्यूमन पी-selectin से सना हुआ शुद्ध प्लेटलेट्स लगभग प्लेटलेट एक्टिवेशन नहीं दर्शाते हैं । (च) शुद्धक प्लेटलेट्स को थ्रोम्बिन से उपचारित किया जाता है और इसे एंटी-माउस CD41 और एंटी-माउस/ह्यूमन पी-सेलेटिन के साथ प्लेटलेट्स के सक्रियण के साथ दाग दिया जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: शुद्ध प्लेटलेट्स का सूक्ष्म मूल्यांकन । (क) शुद्ध प्लेटलेट्स में कोई एकत्रीकरण नहीं दिखाया जाता है । (ख) शुद्ध प्लेटलेट्स थ्रोम्बिन शो एकत्रीकरण के साथ इलाज किया । दोनों आंकड़े 200x आवर्धन, नेत्र लेंस 10x और उद्देश्य लेंस 20x हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आमतौर पर, प्लेटलेट्स कम गति के अपकेंद्रण जो पैदावार प्लेटलेट-अमीर प्लाज्मा कि रक्त कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या, सेलुलर मलबे, और प्लाज्मा प्रोटीन जो जैव रासायनिक और शारीरिक assays हैं और जरूरतों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के द्वारा अलग कर रहे हैं आगे शुद्धि21। इसलिए, यह एक तेजी से और सरल विधि है जो बड़े contaminants के बिना शुद्ध प्लेटलेट्स उपज सकते है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कम गति के अपकेंद्रण के साथ ढाल माध्यम का उपयोग कर माउस रक्त से प्लेटलेट्स की शुद्धि का वर्णन किया गया है । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर उपज को अधिकतम करते हैं और प्लेटलेट्स के ह्रास को कम करते हैं । ग्रैडिएंट मीडियम और प्लाज्मा प्रोटीन्स को प्लेटलेट कलेक्शन के बाद वॉशिंग स्टेप शामिल करके हटाया जा सकता है जिससे एगोनिस्ट या एंटीबॉडी को प्लेटलेट्स की संवेदनशीलता बढ़ सकती है । सबसे महत्वपूर्ण, शुद्ध प्लेटलेट्स आराम राज्य में हैं, लेकिन वे एक agonist, जैसे थ्रोम्बिन की उपस्थिति में सक्रिय किया जा सकता है । हमने पाया है कि थ्रोम्बिन गतिविधि एक स्रोत से दूसरे में बदलती है । इसलिए, थ्रोम्बिन एकाग्रता को प्लेटलेट्स का अच्छा सक्रियण प्राप्त करने के लिए अनुभवसे अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

माउस रक्त की एक छोटी मात्रा के कारण, यह प्लेटलेट्स शुद्ध करने के लिए असुविधाजनक है क्योंकि आकांक्षा के दौरान प्लेटलेट्स आरबीसी और WBC के साथ मिलाया जा सकता है । हमने इस समस्या का समाधान रक्त के नमूने और ढाल माध्यम के अनुपात को अनुकूलित करके किया है । हमने पाया है कि रक्त की मात्रा के सापेक्ष तीन गुना अधिक ढाल माध्यम स्पष्ट रूप से सीरम और आरबीसी-डब्ल्यूबीसी परतों से प्लेटलेट परत को अलग कर सकता है जो शुद्ध प्लेटलेट्स के आसान संग्रह की सुविधा प्रदान करते हैं ।

प्लेटलेट शुद्धि 18 से 22 डिग्री सेल्सियस के बीच कमरे के तापमान पर बाहर किया जाना चाहिए उनके पतन को रोकने के लिए. यह बताया गया है कि यदि फ्रिज में रखा जाए तो प्लेटलेट्स नीचा हो जाता है या 27 ° c11से ऊपर तापमान । शुद्धि के दौरान प्लेटलेट डिग्रेडेशन को रोकने के लिए फास्ट पिपीटिंग और जोरदार झटकों से बचना चाहिए । चूँकि विभिन्न अपकेंद्रक में विभिन्न कार्यक्रम होते हैं, अतः प्रवणता को बनाए रखने के लिए त्वरण/

कई माउस रक्त के नमूनों शुद्धि में उपयोग किया जाता है, तो खून बह रहा है से कम 1 एच और शुद्धि में किया जाना चाहिए अगले 1 ज के भीतर पूरा किया जाना चाहिए. अगर ब्लड सैंपल 2 एच से ज्यादा के लिए छोड़ दिया जाए तो उनकी दुर्गति के कारण प्लेटलेट्स शुद्ध नहीं हो सकतीं । अधिक प्लेटलेट्स किसी भी अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, तो माउस रक्त, हृदय पंचर या अवर वेना कावा रक्तस्राव, जो ८०० उपज १,००० μl रक्त के रूप में टर्मिनल प्रक्रियाओं द्वारा एकत्र किया जा सकता है, और प्लेटलेट शुद्धि कई ट्यूबों में किया जाना चाहिए और शुद्धि के बाद संयुक्त ।

अंत में, हम माउस रक्त की एक छोटी मात्रा से प्लेटलेट शुद्धि के लिए एक सरल और तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । इस विधि के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रजातियों से प्लेटलेट शुद्धि के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । शुद्ध प्लेटलेट्स जीन अभिव्यक्ति, सक्रियण और ग्रेन्युल रिहाई, एकत्रीकरण, और आसंजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न agonists के साथ उत्तेजना पर assays हैं.

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Disclosures

लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने की घोषणा की ।

Acknowledgments

इस काम के एक स्टार्ट-अप फंडिंग सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन और सिनसिनाटी पायलट के एक विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया था । हम सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल अनुसंधान प्रवाह Cytometry कोर उनकी सेवाओं के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) Thermoscientific 17-0626-82 Platelets activation marker
Eppendorf tube Fisher Scientific 14-222-166 Tube for centifuge
FACS DIVA software BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FACS tube Fisher Scientific 352008 Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079 Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41 BD Biosciences 553848 Platelets marker
Flow cytometer BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software FlowJo, Inc. Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) EMD Millipore 03-34-0001 Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube Fisher Scientific 22-362566 Blood collection capillary tube
Hemavet Drew Scientific Non-catalog item Blood cell analyzer
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 Cell counting chamber
Isoflurane Baxter 1001936040 Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz) Sigma-Aldrich D2158 Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45 BD Biosciences 561087 WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 BD Biosciences 557853 RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-1A Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-2C Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14040-117 Buffer for washing and dilution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Physiological saline
Sodium citrate Fisher Scientific 02-688-26 Anti-coagulant
Staining buffer In-house Non-catalog item Wash and dilution buffer
Steile water In-house Non-catalog item Solvent
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin Enzyme Research Laboratoty HT 1002a Platelet activation agonist
Tricine Sigma-Aldrich T0377 Buffer for Nycodenz medium

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References

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जीवविज्ञान अंक १४७ प्लेटलेट्स शुद्धि माउस प्लेटलेट सक्रियण Iohexol रक्त
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Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M.… More

Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of Platelets from Mouse Blood. J. Vis. Exp. (147), e59803, doi:10.3791/59803 (2019).

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