Summary
Hier wurde in Anwesenheit eines Antikoagulanten Mausblut gesammelt. Die Blutplättchen wurden mit einer niedrigen Drehzahlenzentrifugation durch Iohexol-Gradientenmedium gereinigt. Die Blutplättchen wurden mit Thrombin aktiviert, um zu untersuchen, ob sie lebensfähig sind. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde durch Strömungszytometrie und Mikroskopie analysiert.
Abstract
Die Plateletten werden von Vollblut gereinigt, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die frei sein sollten von roten Blutkörperchen (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma-Proteinen. Wir beschreiben hier die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit dem Dreifach mehr Iohexol-Gradientenmittel im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Erträge der gereinigten Blutungen lagen bei 18,2-38,5%, und die gereinigten Blutplättchen befanden sich in einem ruhenden Zustand, der keine nennenswerte Anzahl von RBC und WBC enthielt. Die gereinigten Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, zeigten bis zu 93% Aktivierung, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Wir haben bestätigt, dass die gereinigten Blutplättchen mit Hilfe von Strömungszytometrie und mikroskopischer Auswertung ausreichend rein sind. Diese Blutplättchen können für die Genexpression, Aktivierung, Granulatfreigabe, Aggregation und Haftungsanalysen verwendet werden. Diese Methode kann zur Reinigung von Blutplättchen aus dem Blut anderer Arten auch verwendet werden.
Introduction
Blutplättchen sind ein Bestandteil des Blutes, der als Initiator der Blutgerinnung als Reaktion auf Schäden im Blutgefäß fungiert. Sie versammeln sich an der Stelle der Verletzung, um die Gefäßwand1zu stopfen. Plattenets sind Zusammenhänge von Zytoplasma, die aus den Megakaryozyten des Knochenmarks unter dem Einfluss von Thrombopoietin abgeleitet werden und in den Kreislauf2gelangen. Sie gelten als metabolisch aktiv und können die extrazelluläre Umgebung durch die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden erkennen, die zu der Ausbreitung, Aggregation und Hämodizatische Steckerbildung 1, 3führen. Neben der Hämostasis/Thrombose und der Wundheilung4spielen die Platten eine wichtige Rolle bei den Entzündungsreaktionen, der Angiogenese und den Metastatis3,5 , 6,7, 8.
Die Plateletten werden aus dem Blut gereinigt, um ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften zu untersuchen, die frei von anderen Blutbestandteilen sein sollten. Da rote Blutkörperchen (RBC) und weiße Blutkörperchen (WBC) deutlich mehr RNAundProteine enthalten als die Blutplättchen 9,10, kann das Vorhandensein von sogar einer kleinen Anzahl dieser Zellen mit transkriptomischen und proteomischen Analysen der RNA stören Und Proteine, die aus Blutplättchen stammen. Wir fanden heraus, dass gereinigte Blutplättchen, die mit Thrombin-Bind-Antikörper wie Anti-GPIIb/IIIa (JON/A) und Anti-P-Selektin aktiviert wurden, effizienter als Vollblutplüten.
Da die Blutplättchen zerbrechlich sind, ist es wichtig, die Proben möglichst milde zu behandeln. Wenn die Platten aktiviert sind, geben sie ihren Granulatgehalt frei und sinken schließlich ab. Um die funktionellen Eigenschaften der Platelette intakt zu halten, ist es daher wichtig, die Ruhe während der Isolation zu erhalten. Mehrere Protokolle haben die Isolierung von Blutplättchen von menschlichem, Hund, Ratte und nicht-menschlichem Primat mit verschiedenen Methoden1,10,11, 12beschrieben. Einige der Methoden erfordern mehrere Schritte wie das Sammeln von platelettreichem Plasma durch Zentrifugation, Filtration durch Trennsäule, negative Auswahl von Blutplättchen mit RBC-und WBC-spezifischen Antikörper, die mit Magnetperlen konjugiert werden, und so weiter, die Zeitaufwendig und kann Blutplättchen und deren Inhalt abbauen.
Ford und seine Kollegen beschrieben die Platelet-Reinigung aus menschlichem Blut mit Iohexol Medium11. Diese Methode verwendet ein ähnliches Volumen der Blutprobe und Medium während der Reinigung. Da der Mensch ein höheres Blutvolumen erweist, ist es relativ einfach, die Blutplättchen zu reinigen.
Iohexol ist ein universelles Dichtegradienten-inertes Medium, das frei im Wasser löslich ist und bei der Fraktionierung von Nukleinsäuren, Proteinen, Polysacchariden und Nukleoproteinen 13,14verwendet wird. Es hat eine geringe Osmolalität und ist ungiftig, so dass es ein ideales Medium für die Reinigung vonintakten lebenden Zellen 11. Es ist ein nicht-partikelfreies Medium; So kann die Verteilung der Zellen in einem Farbverlauf mit Hämozytometer, Strömungszytometer oder Spektrophotometer bestimmt werden. Es stört nicht die meisten enzymatischen oder chemischen Reaktionen der Zellen oder Zellfragmente nach der Verdünnung.
Die Maus dient als wichtiges Tiermodell für viele menschliche Krankheiten15, 16,17,18. Es gibt ein paar veröffentlichte Artikel, die die Reinigung von Maus-Platten 19,20beschreiben. Allerdings liefert die Maus ein relativ geringeres Blutvolumen, was die Reinigung von Blutplättchen erschwert. Wird das gleiche geringe Volumen an GradientenMittel-und Blutproben verwendet, kann die Plattenschicht nach der Zentrifugation nicht eindeutig von der RBC-WBC-Schicht getrennt werden. In diesem Artikel haben wir eine schnelle und einfache Methode der Maus-Plattenreinigung mit dreifach mehr Iohexol-Gradientenmedium im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der niedrigen Geschwindigkeit Zentrifugation beschrieben. Wir haben auch die gereinigten Blutplättchen mit Thrombin aktiviert und ihre Qualität mit Strömungszytometrie und Mikroskopie untersucht.
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Protocol
Die Blutentnahme von Maus sollte mit entsprechender institutioneller Tierpflege und Zustimmung des Ausschusses durchgeführt werden.
NOTE: Das Platelet-Reinigungsprotokoll wird in einem Strömungsdiagramm in Abbildung1 beschrieben.
1. Sammlung von Blut
- 25 μL von 3,2% Natriumcitrat (pH 7,2) als Anti-Gerinnungsmittel und 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in ein Polypropylen-Rohr geben.
-
Sammeln Sie etwa 200 μL Blut aus der C57BL/6-Maus mit Retro-Orbital-Blutungen.
Hinweis: Blut kann von jeder Art von Maus-Stamm gesammelt werden, unabhängig von Alter oder Geschlecht.- Verwenden Sie 2 mL Isoofluran in jeder Art von Kammer, um die Maus zu betäuben.
NOTE: Die Tiefe der Anästhesie wird durch Anzeichen einer erhöhten Atmung und verminderter Bewegung überprüft. Die Maus sollte nicht auf die Bewegung der Anästhesie-Kammer oder auf die Behandlung reagieren. Wenn die Maus auf Bewegung oder Handhabung reagiert, dann braucht es mehr Zeit, um in der Anästhesiekammer zu halten. - 1.2.2 Öffnen Sie entweder das rechte oder das linke Augenlid der Maus und legen Sie ein 7,5 cm großes Kapillarrohr in den Gefäßplexus des Auges.
- Drehen Sie das Kapillarrohr eine halbe Drehung, während Sie Druck auf das Kapillarrohr ausüben, um die Gefäße zu brechen und den Blutfluss zu beginnen. Halten Sie das Tier über die Sammelvial auf den Kopf, um durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden.
- Sobald das entsprechende Blutvolumen gesammelt ist, das Kapillarrohr entfernen und das Auge schließen, indem Sie 30 s auf das Augenlid mit Gaze drücken. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringe die Maus in ihren Käfig zurück und kontrolliere sie für die Blutung.
- Überprüfen Sie die Augen auf Traumata 1-2 Tage nach Retro-Orbital-Blutungen. Entfernen Sie jede Maus aus der Studie, die Anzeichen von signifikanten Traumata auf das Auge als Folge des Eingriffs und Euthanierung.
NOTE: Die Maus sollte sich keiner Behandlung unterziehen, die Blutplättchen für mindestens zwei Wochen vor der Blutentnahme hemmen kann. Die Blutprobe muss für die Blutreinigung innerhalb einer Stunde nach Blutung der Maus verwendet werden.
- Verwenden Sie 2 mL Isoofluran in jeder Art von Kammer, um die Maus zu betäuben.
2. Platelet Purifizierung
NOTE: Die Platelet-Reinigung sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um deren Abbau zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Temperatur der Reagenzien und Instrumente zwischen 18 und 22 ° C liegt. Um einen Platzabbau zu verhindern, sollte während des Eingriffs ein schnelles Pipettieren und kräftiges Schütteln vermieden werden.
- 600 μL Iohexol-Gradientenmittel (12% Iohexol-Pulver in 0,85% Natriumchlorid, 5 mM Tricine, pH 7.2) 11 in ein 1,5 mL Rohr geben.
- 200 μL Blutprobe langsam auf die Seite des Rohres auf dem Gradientenmedium mit einer breiten Bohrpfeifenspitze hinzufügen, damit sich Blut und Iohexol-Medium nicht vermischen (Abbildung 2A).
- Zentrifuge die Probe mit Schlauch bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C in einem schwingenden Eimer-Rotor mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.
- Sammeln Sie den größten Teil der platelettreichen Schicht und einen kleinen Bruchteil der platelet-armen Schicht (insgesamt 300 bis 400 μL) mit einer breiten Bohrpfeifenspitze, ohne die RBC und WBC-Schichten zu stören (Abbildung 2B). Übertragen Sie die Plattenprobe auf ein neues Rohr.
NOTE: Liegt die Plattenzählung weniger im Blut oder wird ein kleineres Blutvolumen verwendet, kann die plateletarreiche Schicht und die platelettarme Schicht als eine einzige Schicht gesehen werden. - In einem schwingenden Eimer-Rotor 1 mL PBS in die Platelet-Probe geben, durch Umkehrung und Zentrifuge bei 800 x g für 10 min bei 20 ° C vermischen. Die Lösung komplett ablegen und 200 μL PBS hinzufügen, um die Platten mit mildem Pipettieren wiederzubeleben.
NOTE: Dieser Schritt ist optional, da er das Gradientenmedium und Plasma-Proteine entfernt und die Empfindlichkeit von Blutplättchen gegenüber Agonisten wie Thrombin erhöht. Da verschiedene Zentrifugen unterschiedliche Programme haben, kann die langsame Beschleunigung/Verlangsamung durch das Lesen der Bedienungsanleitung der Zentrifuge bestimmt werden. - Übertragen Sie 30 μL dieser Probe in ein neues Rohr, um Platten zu zählen. Die restlichen Blutplättchen können für biochemische und physiologische Untersuchungen wie Plateletaktivierung, Aggregation, Granulatfreigabe usw. verwendet werden.
- Für die RNA oder Proteinextraktion die Blutplättprobe bei 800 x g für 10 min zentrifugen, um die Blutplättchen zu pülen. Verfall supernatant ganz, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie das gewünschte Volumen von RNA oder Protein-Lysis Puffer hinzu, um die Blutplättchen zu lysern.
3. Zählung der Platelets
- Zählen Sie die ganzen Blutkörperchen ohne Verdünnung und gereinigten Blutplättchen (verdünnt 2 bis 5-fach mit PBS) mit einem automatisierten Zellanalysator. Verwenden Sie 30 bis 50 μL-Proben zum Zählen.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der Blutplättchen, indem Sie sich mit dem Volumen der Probe multiplizieren.
- Berechnen Sie den Anteil der Erträge von gereinigten Blutplättchen.
- Zählen Sie die RBC und WBC in der gereinigten Plattenprobe (verdünnt 50 bis 100-fach mit PBS) mit einem Hämozytometer und Mikroskop.
4. Platelet-Aktivierung
- In einem Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer (PBS mit 2% fetalem Rinderserum, FBS).
- Für eine mehrfache Anzahl von Proben, machen Sie eine Master-Mischung von Antikörpern mit 1 μL (0,5 mg/mL) der folgenden: PE-Cy7 Ratte Anti-Maus TER 119, PE Ratte Anti-Maus CD45, FITC Ratte Anti-Maus-CD41, und APC Ratte anti-mouse/human CD62P (P-selectin) zu erkennen RBC, WBC, Blutplättchen, und Aktivierte Plateletten. Fügen Sie den Master-Mix in die Rohre, um die Zellen zu färben. Thrombin nicht hinzufügen.
- In einem anderen Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Blutplättchen zu aktivieren und die Zellen nach Schritt 4.2 zu verfärben.
NOTE: GPRP sollte der Probe hinzugefügt werden, bevor Thrombin hinzugefügt wird, um Aggregate oder Kleingebildung durch Plattenaktivierung zu verhindern. Die Thrombin-Konzentration sollte optimiert werden, um eine gute Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen. Nach der Aktivierung des Plattenplatzes werden die Ereigniszahlen bei der Erfassung von Proben durch Strömungszytometrie verringert. - Als positive Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer in einem Rohr und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Platelets zu aktivieren. Als negative Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer hinzufügen. Geben Sie Thrombin nicht in negative Kontrollprobe. Verlassen Sie die Zellen nach Schritt 4.2.
- Für die Strömungszytometrie isotype Steuerung, Etikett 5 Rohre mit unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC, und APC. Fügen Sie 100 μL Färbepuffer, 1 μL Blut und 1 μL des jeweiligen Antikörpers zu den beschrifteten Röhren hinzu, um die Zellen zu verfärben.
- Inkubieren Sie Proben, um bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang zu flecken.
- Waschen Sie die Proben, indem Sie 1 mL Färbepuffer zu jedem Rohr hinzufügen. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Färbepuffer vorsichtig ablegen, ohne das Pellet zu entleeren.
- Fügen Sie jedem Rohr 300 μL Fleckenpuffer hinzu, mischen Sie milde und übertragen Sie auf ein FACS-Rohr. Die gebeizten Proben im Dunkeln aufbewahren, bis sie mit einem Strömungszytometer analysiert sind.
5. Flow Cytometry Analysen von Platelets
-
Erstellen Sie ein neues Experiment und generieren Sie Log-Forward-Streuung vs Log-seitige Streuplots und weisen Sie Tore für Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (Blutungen) und CD62P APC (aktivierte Platelets) Populationen nach der Gating-Strategie für die Experimentieren Sie in der FACS DIVA Software.
- Öffnen Sie die Bevölkerungshierarchie, indem Sie die Bevölkerungshierarchie unter der Registerkarte Populationen wählen. Bearbeiten Sie die Populationshierarchie, indem Sie die Gating-Strategie überprüfen und die Tore richtig umbenennen.
- Öffnen Sie die statistische Ansicht, indem Sie sich für die Ansicht erstellen von Statistikenentscheiden. Bearbeiten Sie die Statistikansicht nach den Benutzereinstellungen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Statistik-Ansicht klicken und die Ansicht Bearbeiten der Statistik auswählen.
- Wählen Sie eine Farbe für jedes Tor, die den visuellen Aspekt des Layouts durch einen Doppelklick auf das Feld entsprechend der Bevölkerung verbessert.
- Klicken Sie im Cytometer-Fenster auf die Registerkarte Parameter und passen Sie die Spannungen für Parameter an, um die Population des Interesses auf den Grundstücken darzustellen.
- Passen Sie die Spannungen für jeden der Parameter so an, dass die negative Population von der positiven Population unterschieden werden kann. Bevor Sie die Proben für die Kompensationskontrolle aufnehmen, überprüfen Sie, ob die eingefärbten positiven Kontrollen in der Größenordnung sind (stellen Sie sicher, dass die positiven Spitzen sichtbar sind und nicht zu weit nach rechts).
NOTE: Wenn die positiven Spitzen abgefallen sind, sollten die Spannungen angepasst werden, um die positiven Populationen zu sehen. - Zeichnen Sie die einfarbig gefärbten Zellen für Kompensationskontrollen (unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC und APC).
- Wenn die positiven Kontrolltore nicht richtig aufgestellt sind, passen Sie sie an, indem Sie Spannungen ändern.
- Gehen Sie zum Experiment > Kompensationseinstellung > Kompensation berechnen. Wählen Sie nur im resultierenden Fenster .
- Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt, indem Sie auf den Knopf "Toggle" oben links im Arbeitsfenster klicken.
- Laden Sie die positive Kontrollprobe und gewinnen Sie genügend Zellen, um die Ausgleichszahlung und die Tore anzupassen.
- Laden Sie die Probe erneut und überprüfen Sie, ob jede Handlung die erwartete Zellpopulation auf der Basis des fluorchromen gefärbten Antikörpers zeigt. Erwerben und erfassen Sie 100.000 Veranstaltungen für Vollblutproben und 10.000 Veranstaltungen für gereinigte Blutplättchen. Laden Sie die Proben einzeln, bis die Akquisition abgeschlossen ist.
- Analysieren Sie die Flow-Zytometrie-Daten mit der Software mit entsprechenden Grundstücken und Toren (Bild 3)
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Representative Results
Die Zusammenfassung der Plattenreinigung wird in einem Strömungsdiagramm beschrieben (Abbildung 1). Zu den Schritten gehören die Blutentnahme von der Maus mit Retro-Orbitalblutungen in Anwesenheit eines Gerinnungshaus, die Zugabe von Blutprobe auf das Iohexol-Gradientenmedium, Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde nach der Färbung mit Antikörper mit Mikroskopie und Strömungszytometrie bewertet, um kontaminierende Zellen und aktivierte Blutungen zu erkennen.
Das Iohexol-Gradientenmedium und die Blutprobe bildeten zwei getrennte Schichten im Rohr, wenn das Blut langsam auf das Medium zugeführt wurde (Abbildung 2A). Sollte es jedoch zu Verzögerungen in diesem Schritt kommen, könnte der Großteil der Blutprobe in das Medium diffundieren und es könnte schwierig sein, die Blutplättchen zu reinigen. Die Breitsorte-Pipette-Tipps sorgten dafür, dass die Platten nicht körperlich belastet wurden, was wichtig ist, um die Integrität der Platten zu erhalten und deren Abbau zu verhindern. Während der Zentrifugation hat die langsame Beschleunigung dazu beigetragen, eine unbeabsichtigte Vermischung der Blutprobe mit Iohexol-Medium zu verhindern, und eine langsame Verzögerung trug dazu bei, den Gefälle nach der Zentrifugation aufrechtzuerhalten. Die obere (Strohfarbe) Schicht enthielt das Plasma und enthielt keine Arten von intakten Blutkörperchen, die zweite Schicht (weißlich) von der Spitze enthielt die Mehrheit der Blutplättchen, die mit einer Breitschleifenpipette-Spitze gesammelt wurden, die dritte Schicht (transparent) war Blutararme, die zum Teil sorgfältig gesammelt wurden, um das Streben der unteren Schicht (rot) RBC und WBCzu vermeiden (Abbildung 2B). Die platelettreiche Schicht und die platelettarme Schicht konnten nicht getrennt gesehen werden, wenn die Plattenzählungen in der Blutprobe niedrig waren. Die RBC und WBC-Schicht konnte nicht als getrennte Schichten angesehen werden, da das Blutvolumen gering war. WBC bildet jedoch eine weiße Schicht, die Puffenschicht zwischen platelet-armer Schicht und RBC-Schicht genannt wird, wenn ein größeres Blutvolumen für die Reinigung10,11 verwendetwird. Es ist wichtig, das gesamte Verfahren bei 18 bis 22 ° C durchzuführen. Sowohl die höhere Temperatur als auch die Kühlung der Proben ergaben aufgrund des Abbaus niedrigere Plattenwerte.
Wir fanden 18,2 bis 38,5% (27,1 ± 6,5%, n=12) Erholungsertrag der gereinigten Blutplättchen. Um ihre Lebensfähigkeit zu untersuchen, wurden gereinigte Plattenproben mit Thrombin aktiviert. Die Strömungszytometete-Analyse der Plattenproben erfolgte nach der Färbung mit den Markern für Platelets, aktivierte Platelets, RBC und WBC. Das ganze Blut zeigte verschiedene Populationen von RBC, WBC und Platelets auf einem logarithmischen Vorwärtsstreuer vs Seitenstreuung Punktdiagramm (Abbildung 3A), während die gereinigten Blutplättchen eine ausgeprägte Population mit vernachlässigbaren Zahlen von RBC und WBC zeigten (Abbildung 3B) ). Das ganze Blut zeigte RBC und WBC, nachdem sie mit Anti-Maus Ter119 und Anti-Maus-CD45-Antikörper (Abbildung 3C) färben, während die gereinigten Blutplättchen eine vernachlässigbare Anzahl von RBC und WBC (Abbildung3D) zeigten. Wir haben die gereinigte Plattenprobe mit einem Mikroskop ausgewertet und keine nennenswerte Anzahl von intakten RBC und WBC gesehen. Daher könnten die Ereignisse von RBC und WBC, die in Abbildung 3D gezeigt wurden, die Fragmente von RBC und WBC sein, die Ter119 bzw. CD45 enthalten. Gereinigte Blutplättchen, die nicht mit Thrombin behandelt wurden, zeigten fast keine Aktivierung,die ihren Ruhezustand anzeigte (Abbildung 3E), während gereinigte Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, 71% Aktivierung zeigten (bei einigen Proben wurde bis zu 93% Aktivierung beobachtet) ( Abbildung 3F) Die Zuverlässigkeit ihrer Lebensfähigkeit. Wir haben auch eine mikroskopische Auswertung von gereinigten Blutplättchen durchgeführt, die nicht mit Thrombin behandelt wurden und keine Plattenaggregation zeigten (Abbildung 4A), aber gereinigte Blutplättchen bildeten sich nach der Behandlung mit Thrombin (Abbildung 4B), Die weiter auf ihre Lebensfähigkeit hinweisen. Auf der Grundlage von Strömungszytometrischen und mikroskopischen Studien bestätigten wir, dass unsere gereinigten Blutplättchen eine gute Qualität aufweisen.
Abbildung 1: Schematische Grafik für die Maus-Plattenreinigung. Die Blutprobe von der Maus wird in Anwesenheit eines Gerinnungsmittels gesammelt. Die Blutprobe wird langsam auf das Iohexol-Gradientenmittel und bei 20 min bei 20 ° C mit 400 x g für 20 min zentrifugiert. Die Plattenschicht wird in ein neues Rohr übertragen. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wird mit Mikroskopie und Strömungszytometrie überprüft. Die Platten können sofort verwendet werden oder bei-80 ° C gelagert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2:. Mausblut vor und nach der Zentrifugation mit Iohexol-Gradientenmittel. (A) Iohexol und Blut bilden zwei getrennte Schichten vor der Zentrifugation, wenn die Blutprobe vorsichtig zugesetzt wird. Die linke Tafel zeigt schematische Diagramme und die rechte Tafel zeigt das eigentliche Bild. (B) Vier getrennte Schichten werden nach der Zentrifugation von Vollblut mit Gradientenmedium gesehen. Die linke Tafel zeigt das schematische Diagramm der Ebenen und die rechte Tafel zeigt das eigentliche Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Strömungszytometrie Analyse von gereinigten Blutplättchen. (A) Vollblut zeigt RBC, WBC und Platelet-Populationen. (B) Die gereinigten Blutungen zeigen die geringen Zahlen von RBC und WBC-Veranstaltungen. (C) Vollblut zeigt RBC und WBC nach Färbung mit Anti-Maus Ter119 und Anti-Maus CD45. D) gereinigte Blutplättchen zeigen eine vernachlässigbare Anzahl von RBC und WBC-Ereignissen nach der Färbung mit Anti-Maus Ter119 und Anti-Mause-CD45. (E) Reinifizierte Platelets, die mit Anti-Mause-CD41 befleckt sind, und Anti-Mausse/Human P-selectin zeigen so gut wie keine Platelet-Aktivierung. F) Purifizierte Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt und mit Anti-Mause-CD41 und Anti-Mause-P-selectin befleckt werden, zeigen die Aktivierung von Blutplättchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Mikroskopische Auswertung von gereinigten Blutplättchen. A) Purifizierte Blutplättchen zeigen keine Aggregation. (B) Purifizierte Blutplättchen, die mit Thrombinen-Show Aggregation. Beide Figuren sind 200-fache Vergrößerung, Augenlinse 10x und Objektiv 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Häufig werden Blutplättchen durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die plateletreichem Plasma liefert, das eine beträchtliche Anzahl von Blutkörperchen, Zellabfall und Plasmaproteinen enthält, die die biochemischen und physiologischen Assays und Bedürfnisse stören können. Weitere Reinigung21. Daher ist es wichtig, eine schnelle und einfache Methode zu verwenden, die reine Blutplättchen ohne größere Verunreinigungen erzeugen kann. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit einem Gradientenmedium mit niedriger Drehzahl. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendet werden, maximieren den Ertrag und minimieren den Abbau von Blutplättchen. Das Gradientenmedium und die Plasmaproteine können entfernt werden, indem ein Waschschritt nach der Plattensammlung aufgenommen wird, der die Empfindlichkeit von Blutplättchen gegenüber Agonisten oder Antikörpern erhöhen kann. Am wichtigsten ist, dass sich die gereinigten Blutplättchen in ruhmem Zustand befinden, aber sie können in Anwesenheit eines Agonisten wie Thrombin aktiviert werden. Wir haben herausgefunden, dass die Thrombin-Aktivität von Quelle zu Quelle variiert. Daher sollte die Thrombin-Konzentration empirisch optimiert werden, um eine gute Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen.
Aufgrund eines geringen Volumens von Mausblut ist es unbequem, Blutplättchen zu reinigen, da die Blutplättchen während der Aspiration mit RBC und WBC gemischt werden können. Wir haben dieses Problem gelöst, indem wir das Verhältnis von Blutprobe und Gradientenmedium optimiert haben. Wir haben herausgefunden, dass das Dreifache des Gradientenmitteles im Verhältnis zum Blutvolumen die Plattenschicht deutlich von den Serum-und RBC-WBC-Schichten trennen kann, was eine einfache Sammlung von reinen Blutplättchen ermöglicht.
Die Platelet-Reinigung sollte bei Raumtemperatur zwischen 18 und 22 ° C durchgeführt werden, um deren Abbau zu verhindern. Es wurde berichtet, dass die Blutplättchen abnehmen, wenn sie im Kühlschrank gelagert werden oder Temperaturen über 27 ° C11 liegen. Schnelles Pipettieren und kräftiges Schütteln sollten vermieden werden, um den Plattenabbau während der Reinigung zu verhindern. Da verschiedene Zentrifugen unterschiedliche Programme haben, sollte die Beschleunigungs-/Verlangsamung empirisch bestimmt werden, um den Gefälle zu erhalten.
Wenn mehrere Mausblutproben in der Reinigung verwendet werden, sollte die Blutung in weniger als 1 Stunde durchgeführt werden und die Reinigung sollte als nächstes innerhalb von 1 h abgeschlossen werden. Wenn Blutproben länger als 2 Stunden bleiben, können Blutplättchen aufgrund ihrer Degradierung nicht gereinigt werden. Wenn für jede Studie mehr Blutplättchen benötigt werden, kann das Mausblut durch einschlägliche Verfahren wie Herzpunktion oder minderwertige Vavena-Cava-Blutungen gesammelt werden, die 800 bis 1.000 μL Blut ergeben, und die Plattenreinigung sollte in mehreren Röhren durchgeführt werden und Nach der Reinigung kombiniert.
Abschließend haben wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Plattenreinigung aus einem kleinen Volumen von Mäuse-Blut beschrieben. Diese Methode kann auch zur Plattenreinigung von anderen Arten verwendet werden. Die gereinigten Blutplättchen können bei Stimulation mit verschiedenen Agonisten für die Genexpression, Aktivierung und Granulatfreisetzung, Aggregation und Haftungsassel verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Start-up-Finanzierung der Cincinnati Children es Research Foundation und ein Stipendium der Universität von Cincinnati Pilot Translational Granate an M.N. Wir danken dem Cincinnati Children es Hospital Research Flow Cytometry Core für seine Dienste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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