Summary
여기서, 마우스 혈액은 항 응고 제의 존재 하에 수집 되었다. 혈소판을 저속 원심 분리를 이용 하 여 iohexol 구배 배지로 정제 하였다. 혈소판은 그들이 가능한 경우 조사 하기 위해 트 롬 빈과 함께 활성화 되었다. 정제 된 혈소판의 품질은 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다.
Abstract
혈소판은 적혈구 (RBC), 백혈구 및 혈장 단백질이 없어야 하는 기능적 성질을 연구 하기 위해 전 혈에서 정제 됩니다. 우리는 여기에서 혈액 샘플 부피에 비해 3 배 더 많은 iohexol 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판을 정제 하 고 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 의 스윙 버킷 회전자에서 원심 분리를 설명 한다. 정제 된 혈소판의 회수/수율은 18.2-38.5%이 고 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있었고,이는 상당한 수의 RBC 및 WBC를 포함 하지 않았다. 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판은 그들의 생존 율을 나타내는 최대 93%의 활성화를 보였다. 우리는 순화 된 혈소판이 유 세포 측정 및 현미경 평가를 사용 하 여 충분히 순수한 것을 확인 했습니다. 이러한 혈소판은 유전자 발현, 활성화,과 립 방출, 응집 및 유착 분석에 사용 될 수 있다. 이 방법은 뿐만 아니라 다른 종의 혈액에서 혈소판의 정제를 위해 사용 될 수 있다.
Introduction
혈소판은 혈관의 손상에 반응 하 여 혈액 응고의 개시 제로 서 기능 하는 혈액의 구성 요소입니다. 그들은 혈관 벽1을 연결 하기 위해 부상 부 위에 모여 있습니다. 혈소판은 thrombopoietin의 영향 하에 골의 거 핵 구 로부터 유래 된 세포질의 anucleate 단편 및 순환2로 진입 한다. 이들은 대 사적으로 활성인 것으로 간주 되며 혈소판 확산, 응집 및 지 혈 플러그 형성을 초래 하는 세포내 신호 전달 캐스케이드를 활성화 하 여 세포 외 환경을 감지할 수 있는1,3. 지 혈/혈전 증 및 상처 치유 외에4, 혈소판은 숙주 염증 반응, 혈관 신생 및 메타 스타 티 스3,6,7 에서 중요 한 역할을 한다 8.
혈소판은 혈액에서 그들의 생화학 적 및 생리 적 특성을 연구 하기 위하여 순화 됩니다, 다른 혈액 성분에서 자유로운 이어야 합니다. 적혈구 (RBC) 및 백혈구 (WBC)는 혈소판 보다 훨씬 더 많은 rna 및 단백질을 포함 하기 때문에10, 이러한 세포의 적은 수의 존재도 rna의 전사체 및 프로테오 믹 분석을 방해할 수 있습니다 및 혈소판에서 유래한 단백질. 우리는 정제 된 혈소판이 항 GPIIb/IIIa (존/A)와 같은 트 롬 빈 바인드 항 체와 함께 활성화 되 고 전 혈 혈소판 보다 더 효율적으로 항 P-selectin을 발견 했습니다.
혈소판이 깨지기 쉽기 때문에 샘플을 가능한 한 약간 치료 하는 것이 중요 합니다. 혈소판이 활성화 되 면, 그들은과 립 내용물을 방출 하 고 궁극적으로 저하. 따라서, 혈소판의 기능적 성질을 온전 하 게 유지 하기 위해, 분리 시에 혈소판을 유지 하는 것이 중요 하다. 여러 프로토콜은 다양 한 방법에 의해 인간, 개, 쥐 및 비 인간 영장류에서 혈소판의 분리를설명 했다. 일부 방법에는 원심 분리에의 한 혈소판 풍부 혈장 수집, 분리 칼럼에의 한 여과, RBC 및 WBC-특이 적 항 체가 자성 비드에 컨 쥬 게이 션 된 혈소판의 부정적인 선택 등 여러 단계가 필요 합니다. 시간이 많이 걸리고 혈소판과 그 내용물을 저하 시킬 수 있습니다.
포드 및 그의 동료는 iohexol 매체11을 사용 하 여 인간의 혈액에서 혈소판 정제를 설명 했다. 이 방법은 정제 중 혈액 샘플 및 배지와 유사한 양을 사용 한다. 인간은 혈액의 높은 볼륨을 양보 하기 때문에, 혈소판을 정화 하는 것이 상대적으로 쉽다.
Iohexol은 물에 자유롭게 용 해 되 고 핵 산, 단백질, 다 당 류 및 nucleoproteins13의 분별에 사용 되는 범용 밀도 구배 불활성 매 질 이다. 그것은 낮은 삼 투 압이 고 무 독성, 따라서 그것을 손상 되지 않은 살아있는 세포의 정제를 위한 이상적인 매체를 만들기11. 미 립 자형 매 질; 따라서, 기울기에서 세포의 분포는 혈액 세포종, 유 세포 계, 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 될 수 있다. 그것은 희석 후 세포 또는 세포 조각의 효소 또는 화학 반응의 대부분을 방해 하지 않습니다.
마우스는 많은 인간 질병에 대 한 중요 한 동물 모델의 역할을 한다15,16,17,18. 마우스 혈소판의 정제를 설명 하는 몇 가지 출판 문서가 있다19,20. 그러나, 마우스는 혈소판을 순화 하기 어렵게 만드는 혈액의 상대적으로 작은 양을 산출 합니다. 동일한 소량의 그라데이션 배지 및 혈액 샘플이 사용 되는 경우, 혈소판 층은 원심 분리 후에 RBC-WBC 층 으로부터 명확 하 게 분리 될 수 없다. 이 기사에서는 혈액 샘플 부피 및 저속 원심 분리에 비해 3 배 더 많은 iohexol 구배 배지를 가진 마우스 혈소판 정제의 빠르고 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리는 또한 트 롬 빈으로 순화 한 혈소판을 활성화 하 고 유 세포 분석 및 현미경 검사 법으로 그들의 질을 조사 했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
마우스 혈액 수집은 적절 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 수행 해야 합니다.
참고: 혈소판 정제 프로토콜은 도 1의 흐름도에 기재 되어 있다.
1. 피의 수집
- 항 응고 제와 0.4 mM의 폴 리 프로필 렌 튜브에 3.2%의 7.2 구 연산 나트륨 µ l)을 첨가 합니다.
-
레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 C57BL/6 마우스에서 혈액의 약 200 µ L를 수집 합니다.
참고: 혈액은 연령과 성별에 관계 없이 모든 종류의 마우스 스트레인에서 수집 될 수 있습니다.- 모든 유형의 챔버에 아이 소 루 레인 2 mL를 사용 하 여 마우스를 마 취 시킵니다.
참고: 마 취의 깊이는 증가 된 호흡과 운동 감소의 징후에 의해 검사 됩니다. 마우스는 마 취 챔버의 움직임에 반응 하거나 처리 되지 않아야 한다. 마우스가 이동 또는 처리에 반응 하는 경우, 그것은 마 취 챔버에 유지 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. - 1.2.2 마우스 오른쪽 또는 왼쪽 눈 꺼 풀을 열고 눈의 혈관 총에 7.5 센티미터 (0.12 지름) 모 세관을 삽입 합니다.
- 모 세관을 한 반 회전 시키면서 모 세관에 압력을가 하 여 혈관을 깨고 혈 류를 시작 합니다. 모 세관 작용으로 채울 수 있도록 수집 유리병 위에 동물을 거꾸로 잡아.
- 적절 한 양의 혈액이 수집 되 면, 모 세관을 제거 하 고 30 초 동안가 제와 함께 눈 꺼 풀에 가벼운 압력을가 하 여 안구를 닫으십시오. 출혈이 멈추면 마우스를 케이지로 돌려 출혈을 모니터링 합니다.
- 레트로-궤도 출혈 후 1-2 일 외상에 대 한 눈을 확인 합니다. 과정의 결과로 눈에 대 한 중요 한 외상의 징후를 보여주는 연구에서 마우스를 제거 하 고 안락사.
참고: 마우스는 혈액 수집 전에 적어도 2 주 동안 혈소판을 억제할 수 있는 어떤 종류의 치료를 받아야 한다. 혈액 샘플은 마우스 출혈의 1 시간 이내에 혈소판 정제를 위해 사용 되어야 합니다.
- 모든 유형의 챔버에 아이 소 루 레인 2 mL를 사용 하 여 마우스를 마 취 시킵니다.
2. 혈소판 정제
참고: 혈소판 정제는 그들의 분해를 방지 하기 위해 실 온에서 수행 되어야 한다. 시 약 및 기구의 온도는 18 ~ 22 ° c 사이에 있는지 확인 하십시오. 혈소판 분해를 방지 하기 위해, 절차 동안 빠른 피 펫 팅과 활발 한 흔들림을 피해 야 한다.
- 600의 iohexol 그라데이션 배지 (12% iohexol 분말을 0.85%의 염화 나트륨, 5mm 트리 신, pH 7.2)에 추가 하 여 1.5 mL 튜브에 µ.
- 200 µ L의 혈액 샘플을 넓은 보어 파이 펫 팁으로 그래디언트 매체의 상단에 있는 튜브의 측면 아래로 천천히 추가 하 여 혈액과 iohexol 매체가 혼합 되지 않도록 하십시오 (그림 2a).
- 느린 가속과 감속을 가진 스윙 버켓로 터에서 20 분 동안 400 x g 의 튜브를 포함 한 시료를 원심 분리 합니다.
- 혈소판이 풍부한 층의 대부분을 수집 하 고 RBC 및 WBC 층을 교란 하지 않고 넓은 보어 피 펫 팁을 사용 하 여 혈소판 불량 층 (총 300 400 µ L)의 작은 분 율을 채취 한다 (도 2b). 새 튜브에 혈소판 샘플을 전송 합니다.
참고: 혈소판 수가 적은 혈액 또는 혈액의 작은 양이 사용 되는 경우, 혈소판 풍부 층 및 혈소판 불량 층은 단일 층으로 서 볼 수 있다. - 혈소판 샘플에 1 mL의 PBS를 첨가 하 고, 반전 하 여 혼합 하 고, 800 x g 에서 원심 분리 하 여 진동 하는 버킷로 터에서 20°c에서 10 분간 섞어 줍니다. 용액을 완전히 버리고 200 µ L의 PBS를 추가 하 여 혈소판을 마일드 파이 펫 팅으로 소생 시킵니다.
참고: 이 단계는 선택 사항으로 서, 그 레이디언 트 매 질 및 혈장 단백질을 제거 하 고 트 롬 빈과 같은 작용 제에 대 한 혈소판의 민감도를 증가 시킨다. 원심 분리기는 서로 다른 프로그램을가지고 있기 때문에 원심 분리기의 사용 설명서를 읽으면 느린 가속도/감속을 결정할 수 있습니다. - 혈소판을 계산 하는 새로운 튜브에이 샘플의 30 µ L을 전송 합니다. 나머지 혈소판은 혈소판 활성화, 응집,과 립 방출 등과 같은 생화학 및 생리 적 분석에 사용 될 수 있습니다.
- RNA 또는 단백질 추출의 경우, 혈소판을 펠 렛에 10 분간 800 x g 의 시료로 원심 분리기. 펠 렛을 교란 하지 않고 상층 액을 완전히 버리십시오. 혈소판을 lyse에 RNA 또는 단백질 용 해 완충 제의 원하는 양을 추가 합니다.
3. 혈소판 계산
- 자동 세포 분석기를 사용 하 여 희석 및 정제 된 혈소판 (PBS로 2 ~ 5 배 희석) 없이 전체 혈액 세포를 셉니다. 계산을 위해 30 ~ 50 µ L 샘플을 사용 합니다.
- 샘플의 부피를 곱하여 혈소판의 총 수를 계산 합니다.
- 정제 혈소판의 수율/회수의 백분율을 계산 한다.
- 정제 된 혈소판 샘플에서 RBC 및 WBC (희석 50을 PBS로 100)를 혈 세포 계와 현미경으로 셉니다.
4. 혈소판 활성화
- 튜브에서 1 ~ 200만 정제 혈소판을 염색 완충 액의 100 µ L에 추가 합니다 (PBS 2% 소 태아 혈 청, FBS).
- 다 수의 샘플에 대해, 다음의 1 µ L (0.5 Mg/ml)의 항 체의 마스터 믹스를 만듭니다 Cy7 쥐 안티 마우스 TER 119, PE 쥐 안티 마우스 CD45, FITC 쥐 항 마우스 CD41 및 APC rat 마우스/인간 CD62P (P-selectin)는 RBC, WBC, 혈소판 및 활성화 된 혈소판, 각각. 세포를 염색 하기 위한 튜브에 마스터 믹스를 추가 합니다. 트 롬 빈을 추가 하지 마십시오.
- 또 다른 관에서, µ의 염색 완충 액, 및 0.4 mM GPRP 펩 티 드의 최대 100의 순화 한 혈소판의 1에 200만를 추가 하십시오. 트 롬 빈을 추가 하 여 혈소판을 활성화 하 고 4.2 단계 다음에 세포를 얼룩.
참고: GPRP 혈소판 활성화를 통해 응집 또는 응고 형성을 방지 하기 위해 트 롬 빈을 추가 하기 전에 샘플에 추가 해야 합니다. 트 롬 빈 농도는 혈소판의 양호한 활성화를 얻기 위해 최적화 되어야 한다. 혈소판 활성화 후, 이벤트 카운트는 유 세포 분석에 의해 샘플을 획득 하는 동안 감소 된다. - 양성 대조 군으로 서 튜브 및 0.4 mM GPRP 펩 티 드에서 100 µ L 염색 완충 액까지 전 혈의 1 µ L을 첨가 한다. 혈소판을 활성화 하기 위해 트 롬 빈을 추가. 음성 대조 군으로, 염색 완충 액의 100 µ L까지 전 혈의 1 µ L을 추가 합니다. 트 롬 빈을 네거티브 컨트롤 샘플에 추가 하지 마십시오. 4.2 단계에 따라 세포를 얼룩.
- 유 세포 분석이 소 타입 컨트롤의 경우, Cy7, pe, fitc 및 APC가 포함 된 5 개의 튜브에 라벨을 부착 합니다. 100 µ L의 염색 완충 액, 1 µ L의 혈액 및 각각의 항 체의 1 µ L을 표지 된 튜브에 추가 하 여 세포를 얼룩 지 게 한다.
- 어두운 곳에서 실 온에서 30 분간 얼룩을 내는 샘플을 배양 한다.
- 각 튜브에 1 mL의 염색 완충 액을 추가 하 여 시료를 세척 합니다. 실 온에서 5 분 동안 800 x g 에서 원심 분리기. 펠 릿을 분리 하지 않고 염색 완충 액을 조심 스럽게 버리십시오.
- 각 튜브에 염색 버퍼의 300 µ L을 추가, 약간 혼합, FACS 튜브로 전송. 염색 된 샘플을 유 세포 측정기로 분석할 때까지 어둠 속에 보관 하십시오.
5. 혈소판의 유 세포 분석기 분석
-
새 실험을 생성 하 고 로그 포워드 분산을 생성 하 고 로그 사이드 분산형 도트 플롯과 Ter119 Cy7), CD45 PE, CD41 FITC 및 CD62P APC (활성 혈소판) 집단에 대해 선택한 게이팅 전략에 따라 게이트를 지정 합니다. FACS 디바 소프트웨어에서 실험.
- 모집단 탭 아래에서 인구 계층 구조 표시 를 선택 하 여 인구 계층 구조를 엽니다. 게이팅 전략을 확인 하 고 게이트의 이름을 올바르게 변경 하 여 인구 계층 구조를 편집 합니다.
- 통계 뷰 만들기를 선택 하 여 통계 보기를 엽니다. 통계 보기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 통계 보기 편집을 선택 하 여 사용자 기본 설정에 따라 통계 보기를 편집 합니다.
- 인구에 해당 하는 상자를 두 번 클릭 하 여 레이아웃의 시각적 측면을 향상 시키는 각 게이트에 대 한 색상을 선택 합니다.
- 사이토 미터 창에서 매개 변수 탭을 클릭 하 고 매개 변수의 전압을 조정 하 여 플롯에 대 한 관심 인구를 시각화 합니다.
- 음의 인구가 양성 인구와 구별 될 수 있도록 각 매개 변수에 대 한 전압을 조정 합니다. 보정 컨트롤에 대 한 샘플을 기록 하기 전에 단일 얼룩진 양수 컨트롤이 눈금에 있는지 확인 합니다 (양수 피크가 오른쪽에 너무 멀리 표시 되는지 확인).
참고: 포지티브 피크가 스케일 오프 인 경우, 전압을 조정 하 여 포지티브 모집단을 확인 해야 합니다. - 보정 컨트롤 (Cy7, pe, FITC 및 APC)에 대 한 단색 스테인드 셀을 기록 합니다.
- 포지티브 제어 게이트가 올바르게 설정 되지 않은 경우 전압을 변경 하 여 조정 합니다.
- 보정 설정 ≫ 실험 >으로 이동 하 여 보상을 계산 합니다. 결과 창에 만 적용 을 선택 합니다.
- 워크시트 창의 왼쪽 위에 있는 토글 단추를 클릭 하 여 전역 워크시트로 전환 합니다.
- 포지티브 컨트롤 샘플을 로드 하 고 충분 한 셀을 확보 하 여 보상과 게이트를 조정 합니다.
- 샘플을 다시 로드 하 고 각 플롯이 불 소 크롬 염색 항 체를 기반으로 예상 되는 세포 집단을 표시 하는지 확인 합니다. 획득 및 기록 10만 정제 혈소판에 대 한 전체 혈액 샘플 및 1만 이벤트에 대 한 이벤트. 수집이 완료 될 때까지 샘플을 하나씩 로드 합니다.
- 적절 한 플롯과 게이트를 사용 하 여 소프트웨어를 사용 하 여 유 세포 분석기 데이터 분석 (그림 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
혈소판 정제의 요약은 흐름도 (도 1)에 기재 되어 있다. 단계는 항 응고 제 존재 하에서의 레트로-궤도 출혈을 사용 하 여 마우스에서 혈액의 수집을 포함, iohexol 그라데이션 매체에 혈액 샘플의 추가, 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 에서 스윙 양동이로 터에서 원심 분리. 정제 된 혈소판의 품질은 임의의 오염 세포 및 활성화 된 혈소판을 검출 하기 위해 항 체로 염색 한 후 현미경 및 유 세포 분석기로 평가 되었다.
상기 iohexol 구배 배지와 혈액 샘플은 혈액이 중간에 서서히 첨가 되는 경우 튜브 내에 2 개의 별개의 층을 형성 하였다 (도 2a). 그러나이 단계에서 지연이 있는 경우, 대부분의 혈액 샘플은 배지로 확산 될 수 있으며 혈소판을 정화 하는 것이 어려울 수 있습니다. 넓은 보어 파이 펫 팁 혈소판의 무결성을 유지 하 고 그들의 분해를 방지 하기 위한 중요 한 혈소판에 물리적 스트레스를 보장. 원심 분리 동안, 느린 가속은 iohexol 배지 및 느린 감속으로 혈액 샘플의 우발적 혼합을 방지 하 여 원심 분리 후 구배를 유지 하도록 도왔습니다. 상기 상부 (빨 대 색) 층은 혈장을 포함 하 고 어떤 종류의 온전한 혈액 세포를 함유 하지 않았으며, 상부 로부터 제 2 층 (희 끄 무 거 웠 다)은 넓은 보어 피 펫 팁을 이용 하 여 수집 된 혈소판의 대부분을 포함 하 고, 상기 제 3 층 (투명)은 저 층 (적색) RBC 및 WBC의 흡 인을 피하기 위해 부분적으로 신중 하 게 수집 된 혈소판 불량 (그림 2b). 혈소판이 풍부한 층 및 혈소판 불량 층은 혈액 샘플에서 혈소판 개수가 낮은 경우 분리 된 것으로 볼 수 없었다. 혈액 양이 작기 때문에 RBC 및 WBC 층은 별도의 층으로 볼 수 없었다. 그러나, WBC는 정제10, 11에 대 한 더 큰 부피의 혈액을 사용 하는 경우 혈소판 불량 층과 RBC 층 사이에 버 코트 라고 불리는 백색 층을 형성 한다. 18 ~ 22 ° c에서 전체 절차를 수행 하는 것이 중요 합니다. 샘플의 더 높은 온도 및 냉장 모두 저하로 인해 낮은 혈소판 카운트를 산출.
우리는 18.2에서 38.5 6.5 27.1%의 정제 된 혈소판의 회복/수율을 발견 했다. 그들의 생존 능력을 조사 하기 위해, 정제 된 혈소판 샘플은 트 롬 빈으로 활성화 되었다. 혈소판 샘플의 유 세포 분석은 혈소판, 활성 혈소판, RBC 및 WBC에 대 한 마커로 염색 한 후에 수행 하였다. 전체 혈액은 대 수 전방 산란 대 측 산 점도 플롯에 대 한 RBC, WBC 및 혈소판의 뚜렷한 인구를 보여 주었다 (그림 3a), 반면 정제 된 혈소판은 무시할 수 있는 RBC와 WBC의 숫자와 뚜렷한 인구를 보였다 (그림 3b ). 전 혈은 적혈구 Ter119 및 항 마우스 CD45 항 체를 염색 한 후 RBC와 WBC를 보여주었다 (도 3c) 반면 정제 된 혈소판은 무시할 수 있는 RBC 및 Wbc (도 3d)를 보였다. 우리는 현미경으로 정제 된 혈소판 샘플을 평가 하 고 온전한 RBC 및 WBC의 상당한 수를 보이지 않았다. 따라서, 도 3d 에 나타난 RBC 및 wbc 이벤트는 각각 TER119 및 CD45를 포함 하는 RBC 및 wbc의 단편 일 수 있다. 트 롬 빈으로 처리 되지 않은 정제 된 혈소판은 그들의 휴식 상태를 나타내는 활성화가 거의 없음을 보여주었다 (도 3e), 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판은 71% 활성을 보였다 반면 (최대 93% 활성화는 일부 샘플에서 관찰 되었다) ( 그림 3f) 그들의 생존 능력을 나타냅니다. 우리는 또한 혈소판 응집을 보여 주지 않은 트 롬 빈으로 처리 되지 않은 정제 된 혈소판 샘플의 현미경 적 평가를 수행 하였다 (도 4a), 그러나, 정제 된 혈소판은 트 롬 빈으로 처리 된 후에 응집 체를 형성 하였다 (도 4b), 더 그들의 생존 능력을 나타냅니다. 유 세포 측정 및 현미경 연구에 기초 하 여, 우리는 우리의 순화 한 혈소판이 좋은 질 이었다는 것을 확인 했습니다.
그림 1: 마우스 혈소판 정제에 대 한 개략도. 마우스 혈액 샘플은 항 응고 제 존재 하에서 수집 됩니다. 혈액 샘플을 Iohexol 구배 배지에 서서히 첨가 하 고 20 ° c에서 20 분 동안 400 x g 에서 원심 분리 하였다. 혈소판 층은 새로운 튜브로 이송 된다. 정제 된 혈소판의 질은 현미경 검사 법과 유 세포 분석기로 검사 됩니다. 혈소판은 즉시 사용 되거나-80 ° c에서 저장 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:. Iohexol 구배 배지로 원심 분리 전후의 마우스 혈액. (A) 혈액 샘플이 신중 하 게 첨가 되는 경우 원심 분리 전에 iohexol과 혈액이 분리 된 2 개의 층을 형성 한다. 왼쪽 패널에는 도식도가 표시 되 고 오른쪽 패널에는 실제 이미지가 표시 됩니다. (B) 4 개의 분리 된 층은 그래디언트 배지로 전 혈을 원심 분리 한 후에 볼 수 있다. 좌측 패널에는 레이어 및 우측 패널의 개략도가 나타나 실제 이미지를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 정제 된 혈소판의 유 세포 분석. (A) 전 혈은 RBC, WBC 및 혈소판 집단을 나타낸다. (B) 정제 된 혈소판은 RBC 및 WBC 이벤트의 사소한 숫자를 표시 합니다. (C) 전 혈은 안티 마우스 Ter119 및 안티 마우스 CD45 염색 후 RBC와 WBC를 보여줍니다. (D) 정제 된 혈소판은 안티 마우스 Ter119 및 안티 마우스 CD45 염색 후에 RBC 및 WBC 이벤트의 무시할 수를 보여준다. (E) 안티 마우스 CD41 및 안티 마우스/인간 P-selectin으로 염색 정제 된 혈소판은 거의 혈소판 활성화를 표시 하지. (F) 트 롬 빈으로 처리 된 정제 된 혈소판과 안티 마우스 CD41 및 안티 마우스/인간 P-selectin이 혈소판의 활성화를 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: 정제 된 혈소판의 현미경 적 평가. (A) 정제 된 혈소판은 어떠한 응집도 보여주지 않는다. (B) 트 롬 빈 쇼 응집으로 처리 된 정제 된 혈소판. 두 수치는 200 배 확대, 안구 렌즈 10x 및 대물 렌즈 20x입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
일반적으로, 혈소판은 혈액 세포, 세포 파편 및 생화학 적 및 생리 학적 분석 및 요구를 방해할 수 있는 혈장 단백질의 상당수를 포함 하는 혈소판 풍부 혈장을 생성 하는 저속 원심 분리에 의해 격리 됩니다 추가 정제21. 따라서, 주요 오염 물질 없이 순수한 혈소판을 얻을 수 있는 빠르고 간단한 방법을 사용 하는 것이 중요 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 저 속도 원심 분리와 그라데이션 배지를 사용 하 여 마우스 혈액에서 혈소판의 정제를 설명 한다. 이 프로토콜에 사용 되는 파라미터는 수율을 최대화 하 고 혈소판의 분해를 최소화 한다. 상기 구배 매 질 및 혈장 단백질은 혈소판의 민감도를 증가 시킬 수 있는 아 고 니스 트 또는 항 체를 수집 한 후 세척 단계를 포함 함으로써 제거 될 수 있다. 가장 중요 한 것은, 정제 된 혈소판은 휴지기 상태에 있지만, 트 롬 빈과 같은 작용 제의 존재 하에 활성화 될 수 있다. 우리는 트 롬 빈 활동이 다른 한 근원에서 변화 한다는 것을 발견 했습니다. 따라서 트 롬 빈 농도는 혈소판의 양호한 활성화를 얻기 위해 경험적으로 최적화 되어야 한다.
마우스 혈액의 작은 부피로 인해, 혈소판을 흡 인 중에 RBC와 백혈구와 혼합 할 수 있기 때문에 혈소판을 정화 하는 것이 불편 합니다. 우리는 혈액 샘플 및 그라데이션 매체의 비율을 최적화 하 여이 문제를 해결 했습니다. 우리는 혈액 부피를 기준으로 하는 3 배 더 많은 그라데이션 매체는 순수한 혈소판의 쉬운 수집을 용이 하 게 하는 혈 청 및 RBC-WBC 층에서 혈소판 층을 명확 하 게 분리할 수 있다는 것을 발견 했습니다.
혈소판 정제는 그들의 분해를 방지 하기 위해 18 내지 22 ° c 사이의 실 온에서 수행 되어야 한다. 이는 냉장고 또는 27 ° c 이상의 온도에서 저장 된 경우 혈소판이 저하 되는 것으로 보고 되었다11. 빠른 피 펫 팅과 활발 한 흔들림은 정제 중 혈소판 분해를 방지 하기 위해 피해 야 합니다. 다른 원심 분리기에는 다른 프로그램이 있기 때문에, 가속도/감속은 그라데이션을 유지 하기 위해 경험적으로 결정 되어야 합니다.
여러 마우스 혈액 샘플이 정제에 사용 되는 경우, 출혈은 1 시간 이내에 이루어져야 하며 정화는 1 시간 내에 완료 되어야 합니다. 혈액 샘플이 2 시간 이상 방치 되 면 혈소판이 분해 되어 정제 될 수 없습니다. 어떤 연구를 위해 더 많은 혈소판이 필요한 경우, 마우스 혈액은 심장 빵 꾸 또는 열 등 한 대 정 맥 출혈과 같은 말단 절차에 의해 수집 될 수 있으며,이는 1000 µ L 혈액에 800을 산출 하 고 혈소판 정제는 다중 관에서 수행 되어야 하며 정제 후 결합.
결론적으로, 우리는 마우스 혈액의 작은 볼륨에서 혈소판 정제를 위한 간단 하 고 빠른 프로토콜을 설명 했다. 이 방법은 또한 다른 종에서 혈소판 정제에도 사용할 수 있습니다. 정제 된 혈소판은 다양 한 작용 제를 사용한 자극 시 유전자 발현, 활성화 및과 립 방출, 응집 및 부착 분석을 위해 사용 될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 신시내티 아동 연구 재단의 신생 기금 및 M.N.에 신시내티 파일럿 번역 보조금의 대학에 의해 지원 되었다 우리는 그들의 서비스에 대 한 신시내티 어린이 병원 연구 흐름 세포 분석 코어 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
