Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59803
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine

Summary

هنا ، تم جمع دم الفار في وجود مضاد للتخثر. تم تنقيه الصفائح الدموية من قبل التدرج iohexol المتوسطة باستخدام طرد السرعة المنخفضة. الصفائح الدموية تم تفعيلها مع الفحص للتحقيق إذا كانت قابله للحياة تم تحليل نوعيه الصفائح الدموية المنقية من خلال تدفق الخلوي والمجهر.

Abstract

يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم كله لدراسة خصائصها الوظيفية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) ، وخلايا الدم البيضاء (مكافحه الحرائق) ، وبروتينات البلازما. ونحن وصف هنا تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار باستخدام ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسط نسبه إلى حجم عينه الدم وطرد في دوار دلو يتارجح في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 ° c. وكان الانتعاش/الغلة من الصفائح الدموية المنقية 18.2-38.5 ٪ ، والصفائح الدموية المنقية كانت في حاله راحة ، والتي لم تحتوي علي اي عدد كبير من ار بي سي ومكافحه الحرائق. وأظهرت الصفائح الدموية المنقية المعالجة مع القدرة علي التنشيط بنسبه 93% ، مما يشير إلى جدواها. وأكدنا ان الصفائح الدموية المنقية نقيه بما فيه الكفاية باستخدام تدفق الخلوي والتقييم المجهري. يمكن استخدام هذه الصفائح الدموية للتعبير عن الجينات ، والتنشيط ، والإفراج عن الحبيبية ، والتجميع ، واختبارات التصاق. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتنقيه الصفائح الدموية من الدم من الأنواع الأخرى ، وكذلك.

Introduction

الصفائح الدموية هي أحد مكونات الدم التي تعمل كبادئ لتخثر الدم ردا علي الضرر في الاوعيه الدموية. انهم يتجمعون في موقع الاصابه لسد جدار السفينة1. الصفائح الدموية هي أجزاء من الخلايا الخلوية المشتقة من البويضات الضخمة لنخاع العظم تحت تاثير الجلطات وتدخل الدورة الدموية2. وتعتبر انها نشطه ايضيه وقادره علي استشعار البيئة خارج الخلية عن طريق تنشيط السلاسل الترددية الإشارات داخل الخلايا التي تؤدي إلى انتشار الصفائح الدموية ، والتراكم ، والأرقاء تشكيل المكونات1،3. إلى جانب الأرقاء/تخثر والتئام الجروح4, الصفائح الدموية تلعب دورا هاما في الاستجاباتالتهابيه المضيف, تولد الاوعيه, و ميتاستاتيس3,5,6,7, 8-الآن

يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم لدراسة خصائصها البيوكيميائية والفسيولوجية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من مكونات الدم الأخرى. منذ خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) وخلايا الدم البيضاء (الكريات الحمر) تحتوي علي أكثر بكثير من الحمض الريبي النيبالي والبروتينات من الصفائح الدموية9,10, وجود حتى عدد قليل من هذه الخلايا يمكن ان تتداخل مع التحليلات الناسخة والبروتينية من rna والبروتينات المشتقة من الصفائح الدموية. وجدنا ان الصفائح الدموية المنقية المنشطة مع الأجسام المضادة الربط ، مثل مكافحه GPIIb/IIIa (جون/ا) ومكافحه P-سيلكتين أكثر كفاءه من الصفائح الدموية الكاملة.

وبما ان الصفائح الدموية هشه ، فمن المهم معالجه العينات بأقل ما يمكن. إذا تم تنشيط الصفائح الدموية ، فانها تطلق محتوياتها الحبيبية وتتحلل في نهاية المطاف. لذلك ، للحفاظ علي خصائص الصفائح الدموية الوظيفية سليمه ، من المهم الحفاظ علي الصفيحات الدموية اثناء العزلة. وقد وصفت عده بروتوكولات عزل الصفائح الدموية من الإنسان, الكلبة, الفئران, والرئيسيات غير البشرية بطرق مختلفه1,10,11,12. بعض الطرق تتطلب خطوات متعددة مثل جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد ، والترشيح عن طريق عمود الفصل ، والاختيار السلبي من الصفائح الدموية مع الأجسام المضادة الخاصة بي بي ار-ومكافحه حرائق الآبار مترافق إلى الخرز المغناطيسي ، وهلم جرا ، وهي تستغرق وقتا طويلا وقد تتحلل الصفائح الدموية ومحتوياتها.

ووصف فورد وزملاءه تنقيه الصفائح الدموية من الدم البشري باستخدام iohexol المتوسطة11. يستخدم هذا الأسلوب كميه مماثله من عينه الدم والمتوسطة اثناء تنقيه. وبما ان البشر ينتجون كميه أكبر من الدم ، فمن السهل نسبيا تنقيه الصفائح الدموية.

Iohexol هو التدرج الكثافة العالمية الخاملة المتوسطة القابلة للذوبان بحريه في الماء والمستخدمة في تجزئه الأحماض النووية والبروتينات والسكريات ، والبروتينات النونويه13،14. فقد منخفضه الصبغة وغير سامه ، مما يجعلها وسيله مثاليه لتنقيه الخلايا الحية السليمة11. وهو وسيله غير الجسيمات; ولذلك ، يمكن تحديد توزيع الخلايا في التدرج باستخدام مقياس الكريات الدموية ، وتدفق الخلوي ، أو مقياس الطيف الطيفي. وهو لا يتداخل مع معظم التفاعل الانزيمي أو الكيميائي للخلايا أو الشظايا الخلوية بعد التخفيف.

الفاره بمثابه نموذج الحيوانية الهامه للعديد من الامراض البشرية15،16،17،18. هناك عدد قليل من المقالات المنشورة التي تصف تنقيه الصفائح الدموية الماوس19,20. ومع ذلك ، ينتج الماوس حجما أصغر نسبيا من الدم ، مما يجعل من الصعب تنقيه الصفائح الدموية. إذا تم استخدام نفس الحجم الصغير من التدرج المتوسط وعينات الدم ، لا يمكن فصل طبقه الصفائح الدموية بشكل واضح من طبقه ار بي سي-الكريات البيضاء بعد طرد. في هذه المقالة ، وصفنا طريقه سريعة وبسيطه لتنقيه الصفائح الدموية الماوس مع ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسطة بالنسبة لحجم عينه الدم وانخفاض سرعه طرد. قمنا أيضا بتنشيط الصفائح الدموية المنقية مع الفحص والتحقيق في جودتها مع التدفق الخلوي والمجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وينبغي اجراء جمع الدم الماوس مع الرعاية المؤسسية المناسبة الحيوانية والموافقة علي لجنه الاستخدام.

ملاحظه: يتم وصف بروتوكول تنقيه الصفائح الدموية في رسم تخطيطي للتدفق في الشكل 1.

1. جمع الدم

  1. أضافه 25 μL من 3.2 ٪ سيترات الصوديوم (pH 7.2) كمضاد للتخثر و 0.4 mM من بشكل جلي-برو-الأرجنتين-Pro (GPRP) في أنبوب البولي بروبيلين.
  2. جمع ما يقرب من 200 μL من الدم من الماوس C57BL/6 باستخدام الرجعية المدارية النزيف.
    ملاحظه:     يمكن جمع الدم من اي نوع من سلاله الماوس بغض الانتباه عن العمر أو الجنس.
    1. استخدام 2 مل من ايزوفلوراني في اي نوع من الغرفة لتخدير الماوس.
      ملاحظه: يتم فحص عمق التخدير عن طريق علامات زيادة التنفس وانخفاض الحركة. يجب ان الماوس لا تستجيب لحركه غرفه التخدير ، أو ليتم التعامل معها. إذا كان الماوس يستجيب للحركة أو المناولة ، فانه يتطلب المزيد من الوقت للحفاظ علي غرفه التخدير.
    2. 1-2-2 فتح اما الجفن الأيمن أو الأيسر من الماوس وادراج 7.5 سم (0.12 سم قطر) أنبوب الشعرية في الضفيرة الوعائية للعين.
    3. تويست أنبوب الشعرية نصف بدوره في حين تطبيق الضغط علي أنبوب الشعرية لكسر الاوعيه وبدء تدفق الدم. عقد الحيوانية راسا علي عقب علي قنينة جمع ليتم ملؤها عن طريق العمل الشعرية.
    4. بمجرد ان يتم جمع الحجم المناسب من الدم ، وأزاله أنبوب الشعرية وإغلاق العين عن طريق تطبيق ضغط خفيف لمده 30 ثانيه علي الجفن مع الشاش. مره واحده يتم إيقاف النزيف ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لنزيف.
    5. فحص العينين للصدمة 1-2 أيام بعد النزيف المداري الرجعية. أزاله اي الماوس من الدراسة تظهر علامات صدمه كبيره للعين نتيجة لهذا الاجراء و موت ببطء.
      ملاحظه: يجب ان الماوس لا تخضع لأي نوع من العلاج الذي يمكن ان تمنع الصفائح الدموية لمده أسبوعين علي الأقل قبل جمع الدم. يجب استخدام عينه الدم لتنقيه الصفائح الدموية في غضون ساعة واحده من نزيف الماوس.

2. تنقيه الصفائح الدموية

ملاحظه: وينبغي اجراء تنقيه الصفائح الدموية في درجه حرارة الغرفة لمنع تدهورها. تاكد من ان درجه حرارة الكواشف والاداات بين 18 إلى 22 درجه مئوية. لمنع تدهور الصفائح الدموية ، يجب تجنب التغليف السريع والاهتزاز القوي اثناء العملية.

  1. أضافه 600 μL من التدرج iohexol المتوسطة (12 ٪ مسحوق iohexol في 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم ، 5 مم Tricine ، pH 7.2)11 في أنبوب 1.5 mL.
  2. أضافه 200 μL من عينه الدم ببطء أسفل الجانب من الأنبوب علي راس متوسط التدرج مع طرف ماصه واسعه تتحمل بحيث الدم و iohexol المتوسطة لا تخلط (الشكل 2A).
  3. الطرد المركزي العينة التي تحتوي علي أنبوب في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 °c في دوار دلو يتارجح مع تسارع بطيء والتباطؤ.
  4. جمع معظم الطبقات الغنية بالصفائح الدموية وجزء صغير من طبقه الصفائح الدموية الفقيرة (إجمالي 300 إلى 400 μL) باستخدام طرف ماصه واسعه التجويف دون إزعاج طبقات ار بي سي ومكافحه الحرائق (الشكل 2 ب). نقل عينه الصفائح الدموية إلى أنبوب جديد.
    ملاحظه: إذا كان عدد الصفائح الدموية اقل في الدم أو يتم استخدام حجم أصغر من الدم ، يمكن ان ينظر إلى طبقه الصفائح الدموية الغنية وطبقه الصفيحات الفقيرة علي انها طبقه واحده.
  5. أضافه 1 مل من تلفزيوني إلى عينه الصفائح الدموية ، ومزيج من قبل عكس ، والطرد المركزي في 800 x g لمده 10 دقيقه في 20 درجه مئوية في دوار دلو يتارجح. تجاهل الحل تماما وأضافه 200 μL من تلفزيوني لأعاده تعليق الصفائح الدموية مع الأنابيب الخفيفة.
    ملاحظه: هذه الخطوة اختياريه ، لأنها تزيل بروتينات البلازما المتوسطة واللونية وتزيد من حساسية الصفائح الدموية لناهضات مثل الصفيحة. بما ان أجهزه الطرد المركزي المختلفة لديها برامج مختلفه ، يمكن تحديد التسارع/التباطؤ البطيء عن طريق قراءه دليل المستخدم لجهاز الطرد المركزي.
  6. نقل 30 μL من هذه العينة إلى أنبوب جديد لحساب الصفائح الدموية. ويمكن استخدام الصفائح الدموية المتبقية لاختبارات الكيمياء الحيوية والفسيولوجية مثل تنشيط الصفائح الدموية ، والتجميع ، والإفراج الحبيبية ، الخ.
  7. لاستخراج الحمض الريبي النيبالي أو البروتين ، والطرد المركزي عينه الصفائح الدموية في 800 x g ل 10 دقيقه لبيليه الصفائح الدموية. تجاهل سوبرناتانت تماما دون إزعاج بيليه. أضافه الحجم المطلوب من RNA أو البروتين تحلل العازلة لlyse الصفائح الدموية.

3. عد الصفائح الدموية

  1. عد خلايا الدم بأكملها دون تخفيف وتنقيه الصفائح الدموية (المخفف 2 إلى 5 اضعاف مع تلفزيوني) باستخدام محلل الخلايا الألى. استخدام العينات من 30 إلى 50 μL للعد.
  2. احسب العدد الإجمالي لصفائح الصفيح بالضرب بحجم العينة.
  3. حساب النسبة المئوية لغله/استعاده الصفائح الدموية المنقية.
  4. حساب ار بي سي والكريات البيضاء في عينه الصفائح الدموية المنقية (المخفف 50 إلى 100-اضعاف مع التلفزيونية) مع المجهر.

4. تنشيط الصفائح الدموية

  1. في أنبوب ، أضافه 1 إلى 2,000,000 الصفائح الدموية المنقية في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة (تلفزيوني مع 2 ٪ الجنين البقري المصل ، الدم).
  2. لعدد متعدد من العينات ، وجعل مزيج رئيسي من الأجسام المضادة مع 1 μL (0.5 ملغ/مل) من التالي: PE-Cy7 الفئران المضادة للماوس TER 119 ، PE الفئران المضادة للماوس CD45 ، FITC الفئران المضادة للماوس CD41 ، والفئران APC المضادة للماوس/CD62P الإنسان الصفائح الدموية المنشطة ، علي التوالي. أضافه المزيج الرئيسي إلى أنابيب لتلطيخ الخلايا. لا تقم باضافه البعد.
  3. في أنبوب آخر ، أضافه 1 إلى 2,000,000 من الصفائح الدموية المنقية في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة ، و 0.4 mM GPRP الببتيد. أضافه الانسجه لتنشيط الصفائح الدموية ووصمه عار الخلايا التالية الخطوة 4.2.
    ملاحظه: يجب أضافه GPRP إلى العينة قبل أضافه الشكل لمنع التراكم أو التجلط من خلال تنشيط الصفائح الدموية. يجب تحسين تركيز الصفيحة للحصول علي تنشيط جيد لصفائح الصفيح. بعد تنشيط الصفائح الدموية ، يتم تقليل عدد الاحداث اثناء الحصول علي العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  4. كعنصر تحكم إيجابي ، أضافه 1 μL من الدم كله في ما يصل إلى 100 μL العازلة تلطيخ في أنبوب و 0.4 mM GPRP الببتيد. أضافه الشكل لتنشيط الصفائح الدموية. كعنصر تحكم سلبي ، أضافه 1 μL من الدم كله في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة. لا تقم باضافه الشكل في عينه التحكم السلبية. وصمه عار الخلايا التالية الخطوة 4.2.
  5. للتحكم في النمط الخلوي التدفق ، تسميه 5 أنابيب مع غير ملون ، PE-Cy7 ، PE ، FITC ، و APC. أضافه 100 μL من تلطيخ العازلة ، 1 μL من الدم ، و 1 μL من الأجسام المضادة لكل منها إلى أنابيب المسمي لوصمه عار الخلايا.
  6. احتضان عينات لوصمه عار لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  7. غسل العينات عن طريق أضافه 1 مل من تلطيخ العازلة لكل أنبوب. الطرد المركزي في 800 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة. تجاهل العازلة تلطيخ بعناية دون التخلي عن بيليه.
  8. أضافه 300 μL من تلطيخ العازلة لكل أنبوب ، مزيج اقل ما يقال ، ونقل إلى أنبوب FACS. خزن العينات الملونة في الظلام حتى يتم تحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

5. تحليل تدفق الخلوي الصفائح الدموية

  1. إنشاء تجربه جديده وتوليد سجل مبعثر مقابل الجانب سجل مبعثر المؤامرات نقطه وتعيين بوابات ل Ter119 PE-Cy7 (ربك) ، CD45 PE (الكريات البيضاء) ، CD41 FITC (الصفائح الدموية) ، و CD62P APC (الصفائح الدموية المنشطة) السكان وفقا لاستراتيجية النابضة المختارة لل تجربه في برنامج المغنية FACS.
    1. افتح التسلسل الهرمي للسكان عن طريق اختيار إظهار التسلسل الهرمي للسكان ضمن علامة التبويب السكان. تحرير التسلسل الهرمي للسكان عن طريق التحقق من استراتيجية النابضة وأعاده تسميه البوابات بشكل صحيح.
    2. افتح طريقه عرض الإحصائيات عن طريق اختيار إنشاء عرض إحصائيات. تحرير عرض الإحصائيات وفقا لتفضيلات المستخدم بالنقر بزر الأيمن فوق عرض الإحصاءات وتحديد تحرير عرضالإحصاءات.
    3. اختيار لون لكل بوابه التي تعزز الجانب البصري للتخطيط عن طريق النقر المزدوج علي مربع المقابلة للسكان.
  2. في نافذه المضخم الخلوي ، انقر علي علامة التبويب المعلمات وضبط الفولتية للمعلمات لتصور السكان من الفائدة علي المؤامرات.
  3. ضبط الفولتية لكل من المعلمات بحيث يمكن تمييز السكان السلبية من السكان الايجابيه. قبل تسجيل العينات لمراقبه التعويض ، تاكد من ان الضوابط الايجابيه ذات الصبغة الواحدة علي النطاق (تاكد من ان القمم الموجبة مرئية وليست بعيده إلى اليمين).
    ملاحظه: إذا كانت القمم الايجابيه خارج النطاق ، ينبغي تعديل الفولتية لرؤية السكان الإيجابيين.
  4. تسجيل الخلايا الملونة أحاديه اللون لعناصر التحكم في التعويض (غير ملون ، PE-Cy7 ، PE ، FITC ، APC).
  5. إذا لم يتم اعداد بوابات التحكم الايجابيه بشكل صحيح ، فاضبطها عن طريق تغيير الفولتية.
  6. انتقل إلى التجربة ≫ اعداد التعويض ≫ حساب التعويض. اختر تطبيق فقط في النافذة الناتجة.
  7. قم بالتبديل إلى ورقه العمل العمومية بالنقر فوق زر التبديل في الأعلى ، يسار اطار ورقه العمل.
  8. تحميل عينه التحكم الايجابيه والحصول علي ما يكفي من الخلايا لضبط التعويض والبوابات.
  9. تحميل العينة مره أخرى والتحقق من ان كل مؤامرة يظهر السكان الخلية المتوقعة استنادا إلى الأجسام المضادة الملونة الفلوروكروم. الحصول علي وتسجيل 100,000 الاحداث لعينات الدم الكامل و 10,000 الاحداث الصفائح الدموية المنقية. تحميل العينات واحدا تلو الآخر حتى يكتمل الاستحواذ.
  10. تحليل بيانات التدفق الخلوي مع البرنامج مع المؤامرات والبوابات المناسبة (الشكل 3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم وصف ملخص تنقيه الصفائح الدموية في رسم تخطيطي للتدفق (الشكل 1). وتشمل الخطوات جمع الدم من الماوس باستخدام الرجعية المدارية النزيف في وجود مضاد للتخثر ، أضافه عينه من الدم علي التدرج iohexol ، طرد في دوار دلو يتارجح في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 درجه مئوية. تم تقييم جوده الصفائح الدموية المنقية مع المجهر والتدفق الخلوي بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة للكشف عن اي تلوث الخلايا والصفائح الدموية المنشطة.

شكلت الانحدار iohexol المتوسطة وعينه الدم طبقتين منفصلة في الأنبوب إذا تم أضافه الدم ببطء علي المتوسطة (الشكل 2A). ومع ذلك ، إذا كان هناك تاخير في هذه الخطوة ، فان معظم عينه الدم يمكن ان تنتشر في الوسط وانه قد يكون من الصعب تنقيه الصفائح الدموية. وقد كفلت نصائح الماصة الواسعة النطاق عدم الضغط الجسدي علي الصفائح الدموية التي تعتبر مهمة للحفاظ علي سلامه الصفائح الدموية ومنع تدهورها. خلال الطرد ، ساعد التسارع البطيء علي منع الخلط غير المقصود لعينه الدم مع المتوسطة iohexol والتباطؤ البطيء ساعد علي الحفاظ علي التدرج بعد طرد. الطبقة العليا (لون القش) تحتوي علي البلازما ولم تحتوي علي اي أنواع من خلايا الدم السليمة ، والطبقة الثانية (بيضاء) من اعلي تحتوي علي غالبيه الصفائح الدموية التي تم جمعها باستخدام طرف ماصه واسعه التجويف ، وكانت الطبقة الثالثة (شفافة) الصفائح الدموية الفقراء التي تم جمعها جزئيا بعناية لتجنب الطموح من الطبقة السفلي (الحمراء) ار بي سي ومكافحه الحرائق (الشكل 2B). طبقه الصفيحات الغنية بالصفائح الدموية وطبقه الصفيحات الفقيرة لا يمكن ان ينظر اليها منفصلة إذا كانت الصفائح الدموية منخفضه في عينه الدم. لا يمكن ان ينظر إلى طبقه ار بي سي والكريات البيضاء علي انها طبقات منفصلة لان حجم الدم كان صغيرا. ومع ذلك ، فانها تشكل طبقه بيضاء ، وتسمي معطف بافي بين طبقه الصفيحات الفقيرة وطبقه ار بي سي إذا تم استخدام كميه أكبر من الدم لتنقيه10 ، 11. من المهم تنفيذ الاجراء بأكمله في 18 إلى 22 درجه مئوية. كل من ارتفاع درجه الحرارة والتبريد من العينات أسفرت عن انخفاض عدد الصفائح الدموية بسبب تدهور.

وجدنا 18.2 إلى 38.5 ٪ (27.1 ± 6.5 ٪ ، ن = 12) الانتعاش/الغلة من الصفائح الدموية المنقية. للتحقيق في جدواها ، تم تنشيط عينات الصفائح الدموية المنقية مع الشكل. تم اجراء تحليل التدفق الخلوي للعينات الصفائح الدموية بعد تلطيخ مع علامات لصفائح الصفيح ، والصفائح الدموية المنشطة ، ار بي سي ، ومكافحه الحرائق. وأظهرت الدم كله السكان متميزة من ار بي سي ، الكريات البيضاء ، والصفائح الدموية علي لوغاريتمي إلى الامام مبعثر مقابل الجانب مبعثر نقطه المؤامرة (الشكل 3A) ، في حين ان الصفائح الدموية المنقية أظهرت عددا من السكان متميزة مع عدد لا يستهان به من ار بي سي و ). وأظهرت الدم كله ار بي سي والحرائق الآبار بعد تلطيخ لهم مع المضادة للماوس Ter119 ومكافحه الماوس CD45 الأجسام المضادة (الشكل 3C) في حين ان الصفائح الدموية المنقية أظهرت عددا لا يستهان به من ار بي سي وأبار الدم (الشكل3c). نحن تقييم عينه الصفائح الدموية المنقية مع المجهر ولم ير اي عدد كبير من ار بي سي ومكافحه الحرائق الآبار السليمة. ولذلك ، فان الاحداث ار بي سي وحرائق الآبار التي تم عرضها في الشكل 3D قد تكون شظايا من ار بي سي ومكافحه الحرائق التي تحتوي علي TER119 و CD45 ، علي التوالي. وأظهرت الصفائح الدموية المنقية التي لم يتم التعامل معها مع الشكل تقريبا اي تنشيط يشير إلى حاله الراحة الخاصة بهم (الرقم 3E) ، في حين أظهرت الصفائح الدموية المنقية المعالجة مع التفاعل 71% التنشيط (حتى 93% التنشيط لوحظ في بعض العينات) ( الشكل 3 واو) مما يدل علي صلاحيتها. وأجرينا أيضا تقييما مجهريا لعينات الصفائح الدموية المنقية التي لم تعامل مع الصفيحة التي أظهرت عدم تراكم الصفائح الدموية (الشكل 4A) ، ومع ذلك ، شكلت الصفائح الدموية المنقية المجاميع بعد التعامل مع الشكل (4 ب) ، مما يدل كذلك علي قابليتها للاستمرار. استنادا إلى تدفق الخلوية والدراسات المجهرية ، وأكدنا ان لدينا الصفائح الدموية المنقية كانت ذات نوعيه جيده.

Figure 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي لتنقيه الصفائح الدموية الماوس. يتم جمع عينه من الدم من الماوس في وجود مضاد للتخثر. يتم أضافه عينه الدم ببطء علي التدرج Iohexol المتوسطة وطرد في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 ° c. يتم نقل طبقه الصفائح الدموية إلى أنبوب جديد. يتم فحص جوده الصفائح الدموية المنقية مع المجهر والتدفق الخلوي. ويمكن استخدام الصفائح الدموية علي الفور أو تخزينها في-80 درجه مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:. الفار الدم قبل وبعد طرد مع التدرج Iohexol المتوسطة. (ا) iohexol والدم شكل طبقتين منفصلة قبل طرد إذا تمت أضافه عينه الدم بعناية. تظهر اللوحة اليسرى الرسم التخطيطي واللوحة اليمني تظهر الصورة الفعلية. (ب) وينظر أربع طبقات منفصلة بعد طرد من الدم كله مع التدرج المتوسطة. تظهر اللوحة اليسرى الرسم التخطيطي للطبقات وتظهر اللوحة اليمني الصورة الفعلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل تدفق الصفيحات الخلوية المنقية. (ا) الدم الكامل يظهر الكريات البيضاء ، وحرائق الآبار ، والصفائح الدموية السكان. (ب) تظهر الصفائح الدموية المنقية عددا صغيرا من احداث الكريات البيضاء وحرائق الآبار. (ج) الدم كله يظهر الكريات والآبار بعد تلطيخ مع المضادة للماوس Ter119 والمضادة للماوس CD45. (د) الصفائح الدموية المنقية تظهر عددا لا يستهان به من الاحداث ار بي سي وحرائق الآبار بعد تلطيخ مع المضادة للماوس Ter119 والمضادة للماوس CD45. (ه) الصفائح الدموية المنقية الملطخة المضادة للماوس CD41 والمضادة للماوس/الإنسان P-سيلكتين تظهر تقريبا اي تنشيط الصفائح الدموية. (و) الصفائح الدموية المنقية تعامل مع الملطخة والملون مع المضادة للماوس CD41 ومكافحه الماوس/الإنسان P-سيلكتين إظهار تفعيل الصفائح الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التقييم المجهري لصفائح الصفيح المنقية. (ا) الصفائح الدموية المنقية لا تظهر اي تجميع. (ب) الصفائح الدموية المنقية المعالجة بتجميع العرض. كلا الأرقام هي 200x التكبير ، عدسه العين 10x والهدف 20x عدسه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عاده ، يتم عزل الصفائح الدموية بواسطة طرد منخفضه السرعة التي تعطي البلازما الغنية بالصفائح الدموية التي تحتوي علي عدد كبير من خلايا الدم ، والحطام الخلوي ، وبروتينات البلازما التي يمكن ان تتداخل مع الاختبارات البيوكيميائية والفسيولوجية والاحتياجات بعيده تنقيه21. ولذلك ، من المهم استخدام طريقه سريعة وبسيطه التي يمكن ان تسفر عن الصفائح الدموية النقية دون الملوثات الرئيسية. يصف البروتوكول المعروض هنا تنقيه الصفائح الدموية من دم الفار باستخدام وسيطه متدرجة مع طرد منخفضه السرعة. المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول تعظيم العائد وتقليل تدهور الصفائح الدموية. يمكن أزاله البروتينات المتوسطة والبلازما المتدرجة بما في ذلك خطوه الغسيل بعد جمع الصفائح الدموية التي يمكن ان تزيد من حساسية الصفائح الدموية لناهض أو الأجسام المضادة. الأهم من ذلك ، الصفائح الدموية المنقية في حاله الراحة ، ولكن يمكن تنشيطها في وجود ناهض ، مثل الشكل. لقد وجدنا ان النشاط الذي يتم الكشف عنه يختلف من مصدر إلى آخر. لذلك ، ينبغي ان يكون الأمثل التركيز التجريبي للحصول علي تنشيط جيده من الصفائح الدموية.

نظرا لحجم صغير من الدم الفار ، فمن غير مريح لتنقيه الصفائح الدموية لأنه يمكن خلط الصفائح الدموية مع ار بي سي وحرائق الآبار اثناء الطموح. لقد قمنا بحل هذه المشكلة عن طريق تحسين نسبه عينه الدم ومتوسط التدرج. لقد وجدنا ان ثلاثه اضعاف أكثر التدرج المتوسطة بالنسبة لحجم الدم يمكن ان تفصل بوضوح طبقه الصفائح الدموية من المصل وطبقات ار بي سي التي تسهل جمع سهله من الصفائح الدموية النقية.

وينبغي اجراء تنقيه الصفائح الدموية في درجه حرارة الغرفة بين 18 إلى 22 درجه مئوية لمنع تدهورها. وقد أفيد ان الصفائح الدموية تتحلل إذا كانت مخزنه في الثلاجة أو درجات الحرارة فوق 27 درجه مئوية11. وينبغي تجنب التنضيد السريع والاهتزاز القوي لمنع تدهور الصفائح الدموية اثناء التنقية. بما ان أجهزه الطرد المركزي المختلفة لديها برامج مختلفه ، يجب تحديد التسارع/التباطؤ تجريبيا للحفاظ علي التدرج.

إذا تم استخدام عده عينات من دم الفار في التنقية ، يجب ان يتم النزيف في اقل من 1 ساعة ويجب ان تكتمل التنقية بعد 1 ساعة. إذا تركت عينات الدم لأكثر من 2 ساعة ، لا يمكن تنقيه الصفائح الدموية بسبب تدهورها. إذا كانت هناك حاجه إلى المزيد من الصفائح الدموية لأي دراسة ، يمكن جمع دم الفار من خلال إجراءات المحطة الطرفية مثل ثقب القلب أو نزيف الوريد الأجوف السفلي ، والتي تسفر عن 800 إلى 1,000 μL الدم ، وينبغي ان يتم تنقيه الصفائح الدموية في أنابيب متعددة مجتمعه بعد تنقيه.

في الختام ، لقد وصفنا بروتوكول بسيط وسريع لتنقيه الصفائح الدموية من حجم صغير من الدم الفار. ويمكن أيضا ان تستخدم هذه الطريقة لتنقيه الصفائح الدموية من الأنواع الأخرى ، وكذلك. ويمكن استخدام الصفائح الدموية المنقية للتعبير الجيني ، والتنشيط والإفراج الحبيبية ، والتجميع ، واختبارات التصاق علي التحفيز مع منبات مختلفه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الاولي لمؤسسه سينسيناتي لبحوث الأطفال ومنحه جامعه سينسيناتي التجريبية الانتقالية إلى محمد ناظم ونود ان نشكر الدراسات الخلوية في مستشفي الأطفال سينسيناتي لتدفق البحوث الاساسيه لخدماتهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) Thermoscientific 17-0626-82 Platelets activation marker
Eppendorf tube Fisher Scientific 14-222-166 Tube for centifuge
FACS DIVA software BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FACS tube Fisher Scientific 352008 Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079 Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41 BD Biosciences 553848 Platelets marker
Flow cytometer BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software FlowJo, Inc. Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) EMD Millipore 03-34-0001 Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube Fisher Scientific 22-362566 Blood collection capillary tube
Hemavet Drew Scientific Non-catalog item Blood cell analyzer
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 Cell counting chamber
Isoflurane Baxter 1001936040 Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz) Sigma-Aldrich D2158 Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45 BD Biosciences 561087 WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 BD Biosciences 557853 RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-1A Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-2C Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14040-117 Buffer for washing and dilution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Physiological saline
Sodium citrate Fisher Scientific 02-688-26 Anti-coagulant
Staining buffer In-house Non-catalog item Wash and dilution buffer
Steile water In-house Non-catalog item Solvent
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin Enzyme Research Laboratoty HT 1002a Platelet activation agonist
Tricine Sigma-Aldrich T0377 Buffer for Nycodenz medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
  2. Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
  3. Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
  4. Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
  5. Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
  6. Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
  7. Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
  8. Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
  9. Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
  10. Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
  11. Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
  12. Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
  13. Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
  14. Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
  15. Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
  16. Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
  17. Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
  18. Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
  19. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
  20. Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
  21. Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).

Tags

علم الاحياء إصدار 147 الصفائح الدموية تنقيه الماوس تنشيط الصفائح الدموية Iohexol الدم
تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M.… More

Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of Platelets from Mouse Blood. J. Vis. Exp. (147), e59803, doi:10.3791/59803 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter