Summary
Burada, fare kanı bir anti-koagulan varlığında toplandı. Trombositler, düşük hızlı santrifüjleme kullanılarak iohexol degrade orta tarafından arındırıldı. Trombositler uygulanabilir olup olmadığını araştırmak için Trombin ile aktive edildi. Arıtılmış trombositlerin kalitesi akış sitometri ve mikroskobu ile incelendi.
Abstract
Trombositler, kırmızı kan hücrelerinden (RBC), beyaz kan hücrelerinden (WBC) ve plazma proteinlerinin serbest olması gereken fonksiyonel özelliklerini incelemek için bütün kandan arındırılır. Burada, 20 °C ' de 20 dakika için 400 x g 'de bir sallanan kova rotorunda kan numunesi hacmine ve santrifüje göre üç kat daha fazla iohexol degrade orta kullanarak fare kanından trombositlerin arıtılmasını tarif ediyoruz. Arıtılmış trombositlerin iyileşme/verimi% 18,2-38,5 idi ve saf trombositler, önemli sayıda RBC ve WBC içermeyen bir dinlenme durumudur. Trombin ile tedavi edilen arıtılmış trombositler,% 93 ' e kadar harekete geçirmek için ortaya çıktı. Biz arıtılmış trombositlerin akış cytometrik ve mikroskobik değerlendirme kullanarak yeterince saf olduğunu doğruladı. Bu trombositler gen ifadesi, aktivasyon, granül salınımı, toplama ve yapışma uygulamaları için kullanılabilir. Bu yöntem, diğer türlerin kanından trombositlerin arıtılması için de kullanılabilir.
Introduction
Trombosit kan damarında hasar yanıt olarak kan pıhtılaşma bir başlatıcı olarak işlev kan bileşenidir. Onlar damar duvarı1takmak için yaralanma sitede toplamak. Trombosit, thrombopoetin etkisi altında kemik iliği megakaryanositlerden elde edilen Sitoplazmanın anucleate parçaları ve dolaşım2girin. Onlar metabolik olarak aktif olarak kabul edilir ve hücre içi sinyal şelaleler aktive ederek, trombosit yayma, toplama, ve hemostatik fiş oluşumu ile sonuçlanması ile hücreli dışı çevre algılama yeteneğine1,3. Hemostaz/tromboz ve yara iyileşmesi4' ün yanı sıra trombositler ana inflamatuar tepkiler, anjiyogenezi ve metastis3,5,6,7' de önemli bir rol oynamaktadır. 8' den itibaren.
Trombositler, diğer kan bileşenlerinden özgür olması gereken biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerini incelemek için kandan arındırılır. Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve beyaz kan hücreleri (WBC), trombositlerden9,10' a göre önemli ölçüde daha fazla RNA ve protein içerdiğinden, bu hücrelerin az sayıda varlığı bile RNA 'nın transcriptomik ve proteomik analizlerine engel olabilir ve proteinler trombositlerden türetilmiştir. Anti-GPIIb/ııia (JON/A) ve anti-P-selectin gibi Trombin bağlama antikor ile aktif olan trombositlerin tüm kan trombositinden daha verimli bir şekilde etkinleştirildiği tespit edilmiştir.
Trombosit kırılgan olduğundan, örnekleri mümkün olduğunca hafif tedavi etmek önemlidir. Trombosit aktifleşirse, granül içeriklerini serbest bırakıyorlar ve sonunda zayıflatır. Bu nedenle, trombositlerin fonksiyonel özelliklerini bozulmamış tutmak için yalıtım sırasında trombosit sessizliği korumak önemlidir. Birçok protokol, trombositlerin insan, köpek, sıçan ve insan dışı primat ile çeşitli yöntemlerle yalıtımını1,10,11,12olarak tanımlıyor. Yöntemlerden bazıları, santrifüjleme ile trombosit açısından zengin plazma toplanması, ayırma sütununa göre filtrasyon, RBC ile trombositlerin negatif seçimi ve manyetik boncuklara konjuk edilen WBC 'ye özgü antikor gibi birden fazla adımı gerektirir, ve benzeri, zaman alıcı ve trombositler ve bunların içeriğini düşürebilir.
Ford ve meslektaşları iohexol orta11kullanarak insan kanından trombosit arıtma nitelendirdi. Bu yöntem, arıtma sırasında benzer bir hacim kan örneği ve orta kullanır. İnsanlar kan daha yüksek bir hacim verim beri, nispeten trombosit arındırmak kolaydır.
Iohexol, su içinde serbestçe çözünür ve nüklerik asitler, proteinler, polisakkaritler ve nükroproteinler13,14kesitte kullanılan evrensel yoğunluklu gradyan inert bir ortamdır. Bu düşük osmolalitesi vardır ve toksik olmayan, böylece bozulmamış yaşam hücrelerinin arıtma için ideal bir orta yapma11. Bu bir partikül olmayan ortamdır; Bu nedenle, bir degradedeki hücrelerin dağılımı hemocytometer, Flow cytometer veya spektrofotometre kullanılarak belirlenebilir. Seyreltme işleminden sonra hücrelerin veya hücresel parçaların enzimatik veya kimyasal reaksiyonunun çoğunu engellemez.
Fare birçok insan hastalıkları için önemli bir hayvan modeli olarak hizmet vermektedir15,16,17,18. Fare trombositlerin arıtma açıklayan birkaç Yayınlanan Makaleler vardır19,20. Ancak, fare kan nispeten daha küçük bir hacim verir, bu da zor trombosit arındırmak için yapar. Aynı küçük hacim gradyan orta ve kan numuneleri kullanılırsa, trombosit tabakası Santrifüjden sonra RBC-WBC tabakasından açıkça ayrılamaz. Bu yazıda, kan numunesi hacmi ve düşük hızlı santrifüjleme göreli olarak üç kat daha iohexol degrade orta ile fare trombosit arıtma hızlı ve basit bir yöntem tarif ettik. Ayrıca, arıtılmış trombositleri Trombin ile aktive ettik ve kalitesini akış sitometri ve mikroskobik ile araştırdık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare kan toplama uygun kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi onayı ile yapılmalıdır.
Not: Trombosit arıtma Protokolü Şekil 1' de bir akış diyagramında açıklanmıştır.
1. kan toplanması
- Polipropilen tüpte bir anti-koagulant ve 0,4 mM GLY-Pro-arg-Pro (GPRP) olarak 25 μL 3,2% sodyum sitrat (pH 7,2) ekleyin.
-
C57BL/6 faresi ile Retro orbital kanama kullanarak yaklaşık 200 μL kan toplayın.
Not: kan, Yaş veya cinsiyet ne olursa olsun fare gerinim herhangi bir türde toplanabilir.- Fareyi anestezize etmek için her tür odada 2 mL ısofluran kullanın.
Not: Anestezi derinliği, artan solunum belirtileri ile kontrol edilir ve hareket azalır. Fare, anestezi odasının hareketine veya ele alınması için yanıt vermemelidir. Fare hareket veya işleme yanıt ise, o zaman anestezi odasında tutmak için daha fazla zaman gerektirir. - 1.2.2 farenin sağ veya sol göz kapağı açın ve bir 7,5 cm (0,12 cm çap) kapiller tüp göz vasküler plekbe içine yerleştirin.
- Damarlarını kırmak ve kan akışını başlatmak için kapiller tüpüne basınç uygularken kapiller tüpünü bir buçuk dönüşte çevirin. Kapiller eylem ile doldurulacak toplama şişenin üzerinde baş aşağı hayvan tutun.
- Uygun kan hacmi toplanır sonra, kapiller tüp çıkarın ve gazlı bez ile göz kapağı üzerinde 30 s için hafif basınç uygulayarak göz kapatın. Kanama durdurulduktan sonra, fareyi kafesine dönün ve kanamayı izleyin.
- Eski orbital kanamadan sonra 1-2 gün travmaya göz atın. Prosedür ve ötenize bir sonucu olarak göz önemli travma belirtileri gösteren çalışmada herhangi bir fare çıkarın.
Not: Fare, kan toplamadan önce en az iki hafta trombosit inhibe edebilir tedavi her türlü geçmesi gerekir. Kan örneği, fare kanama bir saat içinde trombosit arıtma için kullanılmalıdır.
- Fareyi anestezize etmek için her tür odada 2 mL ısofluran kullanın.
2. trombosit arıtma
Not: Trombosit arıtma, bozulmalarını önlemek için oda sıcaklığında yapılmalıdır. Reaktiflerin ve araçların sıcaklığının 18 ila 22 °C arasında olduğundan emin olun. Trombosit bozulması önlemek için, hızlı pipetleme ve güçlü sallayarak prosedür sırasında kaçınılmalıdır.
- Ekle 600 μL ıohexol degrade Orta (% 12 iohexol toz içinde 0,85% sodyum klorür, 5 mM Tricine, pH 7,2)11 içine bir 1,5 ml tüp.
- Kan ve iohexol orta karışmaz, böylece geniş bir pipet ucu ile degrade Orta üzerinde tüpün kenarına yavaşça aşağı yavaş kan örneği 200 μL ekleyin (Şekil 2a).
- Yavaş ivme ve yavaşlama ile sallanan kova rotor 20 °C 20 dk için 400 x g at tüp içeren örnek Santrifüjü.
- RBC ve WBC katmanlarını (Şekil 2B) rahatsız etmeden geniş bir pipet ucu kullanarak, trombosit açısından zengin tabakanın çoğunu ve trombosit yetersiz tabakasının küçük bir kısmını (Toplam 300 Ila 400 μL) toplayın. Trombosit örneğini yeni bir tüpe aktarın.
Not: Trombosit sayısı kandaki daha az veya daha küçük bir kan hacmi kullanıldığında, trombosit açısından zengin tabaka ve trombosit-yoksul tabaka tek bir katman olarak görülebilir. - Trombosit örneğine 1 mL PBS ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 800 x g 'lik bir sallanan kova rotorunda 20 °c ' de 10 dakika santrifüj yapın. Solüsyonu tamamen atın ve trombositlerin hafif pipetleme ile pelletini için 200 μL PBS ekleyin.
Not: Gradyan orta ve Plazma proteinleri kaldırır ve trombositlerin Trombin gibi agonistleri duyarlılığı artırır Bu adım isteğe bağlıdır. Farklı santrifüjler farklı programlara sahip olduğundan, yavaş hızlanma/yavaşlama santrifüj kullanım kılavuzunu okuyarak tespit edilebilir. - Bu numunenin 30 μL 'i trombositleri saymak için yeni bir tüpe aktarın. Kalan trombositler, trombosit aktivasyonu, toplama, granül salınımı vb. gibi biyokimyasal ve fizyolojik özetleri için kullanılabilir.
- RNA veya protein ekstraksiyon için, trombosit örneği 10 dakika için 800 x g 'de trombositler Pelet için santrifüjler. Süpernatant tamamen Pellet rahatsız etmeden atın. Trombositler Lyse RNA veya protein liziz tampon istenen hacmi ekleyin.
3. trombosit sayma
- Otomatik bir hücre analizörü kullanarak seyreltme ve arıtılmış trombositler (PBS ile 2 ila 5 kat seyreltilmiş) olmadan tüm kan hücrelerini saymak. Sayma için 30-50 μL örnekleri kullanın.
- Numunenin hacmine göre çarpılarak trombosit toplam sayısını hesaplayın.
- Arıtılmış trombositlerin verim/kurtarma yüzdesini hesaplayın.
- Saflaştırılmış trombosit örnekteki RBC ve WBC 'yi (50, PBS ile 100-katlamalı) hemokytometer ve mikroskop ile sayar.
4. trombosit aktivasyonu
- Bir tüpte, 100 μL 'ye kadar 1 ila 2.000.000 saflaştırılmış trombosit ekleyin (PBS,% 2 fetal sığır serumu, FBS).
- Birden fazla sayıda numune için, aşağıdaki 1 μL (0,5 mg/mL) ile antikorların bir Master karışımı yapmak: PE-Cy7 sıçan Anti-fare TER 119, PE sıçan Anti-fare CD45, FITC sıçan Anti-fare CD41, ve APC sıçan Anti-fare/insan CD62P (P-selectin) RBC algılamak için, WBC, trombosit, ve aktif trombosit, sırasıyla. Hücreleri boyama için tüplere ana karışımı ekleyin. Trombin eklemeyin.
- Başka bir tüpte, 100 μL boyama tamponu ve 0,4 mm gprp peptid gibi% 1 ' 2.000.000 e kadar saf trombosit ekleyin. Trombosit etkinleştirmek ve adım 4,2 aşağıdaki hücreleri leke Trombin ekleyin.
Not: Trombosit aktivasyonu yoluyla toplu veya pıhtı oluşumunu önlemek için Trombin eklemeden önce numune için GPRP eklenmesi gerekir. Trombosit iyi aktivasyonu elde etmek için Trombin konsantrasyonu optimize edilmelidir. Trombosit aktivasyonu sonrasında, Akış sitometrisi ile numunelerin satın alınması sırasında olay sayımı azalır. - Pozitif bir kontrol olarak, bir tüp ve 0,4 mM GPRP peptid 100 μL boyama tampon kadar tüm kan 1 μL ekleyin. Trombosit etkinleştirmek için Trombin ekleyin. Negatif kontrol olarak, 100 μL 'ye kadar tüm kan 1 μL 'i boyama tamponunu ekleyin. Negatif kontrol örneğinde Trombin eklemeyin. 4,2 adım aşağıdaki hücreleri leke.
- Akış sitometri izotip kontrolü için, etiket 5 tüpler ile lekelenmiş, PE-Cy7, PE, fitc, ve APC. Eklemek 100 μL boyama tampon, 1 μL kan, ve 1 μL ilgili antikor etiketli tüpler hücreleri leke.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Lekelenmek için örnekleri inküye.
- Her tüp için 1 mL boyama tamponu ekleyerek örnekleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika 800 x g Santrifüjü. Pellet dislodging olmadan dikkatle boyama tampon atın.
- Her tüp için 300 μL boyama tamponu ekleyin, hafif karıştırın ve bir FACS tüpüne aktarın. Bir akış cytometer ile analiz kadar karanlıkta lekeli örnekleri saklayın.
5. trombositlerin akış Cytometri analizleri
-
Yeni bir deneme oluşturun ve günlük ileri dağılım vs günlük yan dağılım nokta çizimleri oluşturmak ve Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (trombosit) ve CD62P APC (aktif trombositler) nüfusu için seçilen gating stratejisine göre kapılar atamak FACS DIVA yazılımında deney.
- Nüfus hiyerarşisi altında nüfus hiyerarşisini göster 'i seçerek popülasyon hiyerarşisini açın. gating stratejisini kontrol ederek ve kapıları düzgün şekilde yeniden adlandırarak nüfus hiyerarşisini düzenleyin.
- İstatistik görünümü Oluşturseçeneğini belirleyerek istatistik görünümünü açın. İstatistik görünümünü sağ tıklatarak ve Istatistik görünümünü düzenle'yi seçerek, istatistik görünümünü kullanıcı tercihlerine göre düzenleyin.
- Popülasyona karşılık gelen kutuya çift tıklayarak mizanpajın görsel yönünü geliştiren her kapı için bir renk seçin.
- Cytometer penceresinde, Parametreler sekmesine tıklayın ve grafiklerde ilgi nüfusu görselleştirmek için parametreler için voltajları ayarlayın.
- Negatif nüfus pozitif nüfus ayırt edilebilir böylece her parametre için voltajları ayarlayın. Tazminat kontrolü için numuneleri kaydetmeden önce, tek lekeli pozitif kontrollerin ölçeklerde olduğunu kontrol edin (pozitif zirvelerin görünür olduğundan ve sağa çok uzak olmadığından emin olun).
Not: Pozitif dorukların ölçeği kapalı ise, gerilimler pozitif nüfus görmek için ayarlanması gerekir. - Tazminat kontrolleri için tek renkli lekeli hücreleri kaydedin (lekelenmiş, PE-Cy7, PE, FITC ve APC).
- Pozitif kontrol kapıları düzgün ayarlanmamış ise, voltajları değiştirerek bunları ayarlayın.
- Tazminatı hesapla ≫ deneme ≫ tazminat kurulumu'na gidin. Yalnızca elde edilen pencerede Uygula 'yı seçin.
- Çalışma sayfası penceresinin sol üst kısmındaki iki durumlu düğmeye tıklayarak genel çalışma sayfasına geçin.
- Pozitif kontrol örneği yükleyin ve tazminat ve kapıları ayarlamak için yeterli hücre elde.
- Örnek yeniden yükleyin ve her arsa flororokrom lekelenmiş antikor dayalı beklenen hücre popülasyon gösterir kontrol edin. Satın alma ve kayıt 100.000 tüm kan örnekleri için olaylar ve 10.000 saflaştırılmış trombosit için olaylar. Satın alma tamamlanıncaya kadar örnekleri birer birer yükleyin.
- Uygun grafiklerle ve kapılara sahip yazılım ile akış sitometri verilerini analiz edin (Şekil 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trombosit arıtma Özeti bir akış diyagramında açıklanmıştır (Şekil 1). Adımlar bir antikoagülan varlığında Retro-orbital kanama kullanarak fare kan toplama, iohexol degrade orta üzerine kan numunesi eklenmesi, 400 x g bir sallanan kova rotorda santrifüjleme 20 ° at için 20 dakika içinde içerir. Arıtılmış trombositlerin kalitesi, herhangi bir kontamine hücre ve aktif trombositler tespit etmek için antikor ile boyama sonrası mikroskopiye ve Akış sitometrisi ile değerlendirildi.
İohexol gradyan ortamı ve kan örneği, kan yavaşça ortama eklenirse tüpte iki ayrı katman oluşturdu (Şekil 2a). Ancak, bu adımda gecikme varsa, kan örneğinin çoğu orta içine diffüz ve trombosit arındırmak zor olabilir. Geniş çap pipet uçları, trombositlerin bütünlüğünü korumak ve bozulmalarını önlemek için önemli olan trombosit hiçbir fiziksel stres sağladı. Santrifüjleme sırasında, yavaş ivme ıohexol orta ve yavaş yavaşlama ile kan örneğinin yanlışlıkla karıştırılmasını önlemeye yardımcı santrifüjleme sonra Gradyan bakımını yardımcı oldu. Üst (saman rengi) tabaka plazmayı içeriyordu ve herhangi bir tür bozulmamış kan hücresi içermiyor, ikinci tabaka (beyazlık) üst kısmında bulunan ve geniş çap pipet ucu kullanılarak toplanan trombositlerin çoğunluğu, üçüncü katman (şeffaf) alt tabakanın (kırmızı) RBC ve WBC (Şekil 2B) aspirasyonunu önlemek için kısmen dikkatle toplanan trombosit yoksul. Trombosit sayısının düşükse kan numunesi düşük olsaydı, trombosit zengini tabaka ve trombosit zayıf tabakası ayrı görülemedi. Kan hacmi küçük olduğundan RBC ve WBC katmanı ayrı katmanlar olarak görülemedi. Ancak, WBC beyaz bir katman oluşturur, trombosit zayıf tabaka ve RBC tabakası arasında Buffy Coat denilen arıtma için daha büyük bir hacim kan kullanıldığında10, 11. Tüm prosedürü 18 ila 22 °C ' de yürütmek önemlidir. Numunelerin hem yüksek sıcaklık hem de soğutulması, bozulması nedeniyle daha düşük trombosit sayar.
Biz 18,2 bulduk 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) iyileşme/verim arıtılmış trombosit. Kendi canlarını araştırmak için, arıtılmış trombosit örnekleri Trombin ile aktif edildi. Trombosit örneklerinin akış cytometrik analizi, trombositler, aktif trombosit, RBC ve WBC işaretçileri ile boyama sonrası yapıldı. Tüm kan RBC, WBC ve trombositlerin farklı nüfusu gösterdi bir logaritmik ileri Scatter vs yan Scatter nokta Plot (Şekil 3A), ancak arıtılmış TROMBOSIT RBC ve WBC ihmal numaraları ile farklı bir nüfus gösterdi (Şekil 3B ). Tüm kan RBC ve WBC Anti-fare Ter119 ve anti-fare CD45 antikor (Şekil 3c) ile onları boyama sonra gösterdi saf TROMBOSITLER RBC ve WBC (şekil 3D) ihmal edilebilir sayıda gösterdi ise. Biz bir mikroskop ile arıtılmış trombosit örnek değerlendirildi ve bozulmamış RBC ve WBC herhangi bir önemli sayıda görmedim. Bu nedenle, şekil 3D 'de gösterilen RBC ve WBC olayları, sırasıyla TER119 ve CD45 içeren RBC ve WBC parçaları olabilir. Trombin ile tedavi edilmemiş olan saflaştırılmış trombositler, istirahat durumunu gösteren neredeyse hiçbir aktivasyon göstermemiştir (Şekil 3E), Trombin ile tedavi edilen saflaştırılmış trombositler% 71 ' lik bir aktivasyon gösterdi (bazı örneklerde% 93 ' e kadar aktivasyon gözlendi) ( Şekil 3F) onların hayatlarını gösterir. Ayrıca, trombosit toplama (Şekil 4A) gösteren Trombin ile tedavi edilmeyen arıtılmış trombosit numunelerinin mikroskobik değerlendirmesini de gerçekleştirdik, ancak Trombin (Şekil 4b) ile tedavi edildikten sonra saflaştırılmış trombositler oluşur. ki bu da kendi hayatlarını gösterir. Akış cytometrik ve mikroskobik çalışmalara dayanarak, bizim saf trombositlerin kaliteli olduğunu doğruladı.
Şekil 1: fare trombosit arıtma Için şematik diyagram. Fareden kan örneği bir antikoagülan varlığında toplanır. Kan numunesi, ıohexol gradyan ortamına yavaşça eklenir ve 20 °C ' de 400 x g 'de santrifüglü olur. Trombosit tabakası yeni bir tüpe aktarılır. Arıtılmış trombositlerin kalitesi mikroskopi ve Akış sitometrisi ile kontrol edilir. Trombositler hemen kullanılabilir veya-80 °C ' de depolanabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2:. Iohexol degrade orta ile santrifüjleme öncesi ve sonrası fare kanı. (A) kan numunesi dikkatle eklenirse, santrifüjleme öncesinde ıohexol ve kan iki ayrı katman oluşturur. Sol panelde şematik diyagram ve sağ panel gerçek görüntüyü gösterir. (B) gradyan orta ile tüm kanın Santrifüjden sonra dört ayrı katman görülür. Sol panel katmanlar ve sağ panel Şematik diyagramı gösterir gerçek görüntü gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: arıtılmış trombositlerin akış cytometrik analizi. (A) tüm kan RBC, WBC ve trombosit nüfus gösterir. (B) saflaştırılmış TROMBOSITLER RBC ve WBC olaylarını küçük sayılar gösterir. (C) tüm kan Anti-fare Ter119 ve anti-fare CD45 ile boyama sonra RBC ve WBC gösterir. (D) saf trombositler Anti-fare Ter119 ve anti-fare CD45 ile boyama sonra RBC ve WBC olayların ihmal edilebilir sayıda göstermek. (E) Anti-fare CD41 ve anti-fare/insan P-selectin neredeyse hiçbir trombosit aktivasyon gösterisi ile lekelenmiş saflaştırılmış trombositler. (F) Trombin ile tedavi edilen ve anti-fare CD41 ve anti-fare/insan P-selectin trombosit harekete geçirmek ile lekelenmiş saflaştırılmış trombositler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: saflaştırılmış trombositlerin mikroskobik değerlendirilmesi. (A) saflaştırılmış trombositler herhangi bir toplama göstermez. (B) Trombin göstermek toplama ile tedavi edilen saflaştırılmış trombositler. Her iki rakam 200x büyütme, oküler lens 10X ve objektif objektif 20X vardır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaygın olarak, trombositler düşük hızlı santrifüjleme ile yalıtılır, bu da önemli sayıda kan hücresi içeren trombosit açısından zengin plazma verir, hücresel enkaz ve biyokimyasal ve fizyolojik tespit ve ihtiyaçlara engel olabilecek Plazma proteinleri daha fazla arıtma21. Bu nedenle, büyük kirleticiler olmadan saf trombosit verebilecek hızlı ve basit bir yöntem kullanmak önemlidir. Burada sunulan protokol, düşük hızlı santrifüjleme ile degrade bir ortam kullanarak fare kanından trombositlerin arıtılmasını açıklar. Bu protokolde kullanılan parametreler verimi maksimize ve trombosit bozulması en aza indirmek. Gradyan orta ve Plazma proteinleri, trombositlerin agonisti veya antikor duyarlılığı artırabilir trombosit toplama sonra bir yıkama adım dahil edilebilir. En önemlisi, arıtılmış trombositler istirahat durumudur, ancak Trombin gibi bir agonistin varlığında aktif hale getirilebilir. Trombin aktivitesinin bir kaynaktan diğerine değiştiğini bulduk. Bu nedenle, Trombin konsantrasyonu, trombositlerin iyi aktivasyonunu elde etmek için ampirik olarak optimize edilmelidir.
Fare kanı küçük bir hacim nedeniyle, trombositler aspirasyon sırasında RBC ve WBC ile karıştırılabilir çünkü trombosit arındırmak için uygunsuz. Biz kan örneği ve degrade orta oranını optimize ederek bu sorunu çözmüştür. Biz üç kat daha fazla degrade orta kan hacmine göre açıkça serum ve RBC-WBC katmanları saf trombositlerin kolay toplama kolaylaştırır trombosit tabakası ayırabilirsiniz bulduk.
Trombosit arıtma, bozulması önlemek için 18 ila 22 °C arasında oda sıcaklığında yapılmalıdır. Buzdolabında veya 27 °C ' den11' in üzerindeki sıcaklıklarda depolanırsa trombositlerin düşmesine neden olduğu bildirilmiştir. Hızlı pipetleme ve kuvvetli sallayarak arıtma sırasında trombosit bozulması önlemek için kaçınılmalıdır. Farklı santrifüjler farklı programlara sahip olduğundan, ivme/yavaşlama gradyan korumak için ampirik olarak belirlenmelidir.
Birkaç fare kan numuneleri arıtma kullanılırsa, kanama 1 saat daha az yapılmalıdır ve arıtma 1 h içinde sonraki tamamlanmalıdır. Kan numuneleri 2 dakikadan fazla bırakılırsa, trombosit bozulması nedeniyle arındırılamaz. Herhangi bir çalışma için daha fazla trombosit gerekiyorsa, fare kanı, kardiyak delinme veya Vena Cava inferior kanama gibi Terminal prosedürleri ile 800 1.000 μL kanına verim verir ve trombosit arıtma birden fazla tüpte yapılmalıdır ve Arıtma sonra kombine.
Sonuç olarak, küçük bir fare kanı hacminin trombosit arıtma için basit ve hızlı bir protokol tarif ettik. Bu yöntem aynı zamanda diğer türlerin trombosit arıtma için de kullanılabilir. Arıtılmış trombositler gen ifadesi, aktivasyon ve granül salınımı, toplama ve çeşitli agonistleri ile stimülasyon üzerine yapışması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Bu çalışma, Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı 'nın bir başlangıç finansmanı ve mına 'ya Cincinnati pilot translational Grant Üniversitesi tarafından destekleniyordu. Cincinnati çocuk hastanesi araştırma akışı sitometri Çekirdek Hizmetleri için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
