Summary
Här, mus blod samlades i närvaro av en antikoagulantia. Trombocyterna renades av Johexol gradient medium med lågfart centrifugering. Trombocyterna aktiverades med trombin för att undersöka om de var livskraftiga. Kvaliteten på de renade trombocyterna analyserades genom flödescytometri och mikroskopi.
Abstract
Trombocyter renas från helblod för att studera deras funktionella egenskaper, som bör vara fria från röda blod kroppar (RBC), vita blod kroppar (WBC), och plasma proteiner. Vi beskriver här rening av blodplättar från mus blod med tre gånger mer Johexol gradient medium i förhållande till blod prov volym och centrifugering i en sväng ande hink rotor på 400 x g för 20 min vid 20 ° c. Återhämtningen/avkastningen av de renade trombocyter var 18,2-38,5%, och de renade trombocyter var i ett vilo tillstånd, som inte innehöll något betydande antal RBC och WBC. De renade trombocyter som behandlades med trombin visade upp till 93% aktivering, vilket indikerar deras lönsamhet. Vi bekräftade att de renade trombocyterna är tillräckligt rena med flödescytometrisk och mikroskopisk utvärdering. Dessa trombocyter kan användas för gen uttryck, aktivering, granule release, agg regering, och vidhäftning analyser. Denna metod kan användas för rening av blodplättar från blodet av andra arter samt.
Introduction
Trombocyter är en del av blod som fungerar som en initiativtagare till blodkoagulering som svar på skador i blod kärlet. De samlas på platsen för skada för att ansluta fartygs väggen1. Trombocyter är anucleate fragment av cytoplasman härrör från megakaryocyter i benmärgen under påverkan av trombopoietin och in i cirkulationen2. De anses vara metaboliskt aktiva och kan känna av extracellulär miljö genom att aktivera intracellulära signalering kaskader som resulterar i trombocyt spridning, agg regering, och hemostatiska plugg formation1,3. Förutom hemostas/trombos och sårläkning4, trombocyter spelar en viktig roll i värd inflammatoriska reaktioner, angiogenes, och metastatis3,5,6,7, och 8.
Trombocyter renas från blod för att studera deras biokemiska och fysiologiska egenskaper, som bör vara fria från andra blod komponenter. Eftersom röda blod kroppar (RBC) och vita blod kroppar (WBC) innehåller signifikant mer RNA och proteiner än trombocyter9,10, närvaron av även ett litet antal av dessa celler kan störa transkriptomiska och proteomiska analyser av RNA och proteiner som härrör från trombocyter. Vi fann att renade trombocyter aktive ras med trombin bind anti kropp som anti-GPIIb/IIIa (JON/A) och anti-P-selektin mer effektivt än hela blodplättar.
Eftersom trombocyter är bräckliga är det viktigt att behandla proverna så milt som möjligt. Om trombocyterna aktive ras, släpper de sina granule innehåll och i ändan försämras. För att hålla Trombocyternas funktionella egenskaper intakt är det därför viktigt att bibehålla trombocyt aggregation under isolering. Flera protokoll har beskrivit isolering av trombocyter från människa, hund, råtta, och icke-mänskliga primater av olika metoder1,10,11,12. Några av metoderna kräver flera steg såsom insamling av trombocytrik plasma genom centrifugering, filtrering av separations kolonnen, negativt urval av blodplättar med RBC-och WBC-specifik anti kropp konjugerad till magnetiska pärlor, och så vidare, som är tids krävande och kan försämra antalet blodplättar och deras innehåll.
Ford och hans kollegor beskrev trombocyt rening från humant blod med hjälp av Johexol medium11. Denna metod använder en liknande volym blod prov och medium under rening. Eftersom människor ger en högre volym av blod, är det relativt lätt att rena trombocyterna.
Iohexol är en universell densitet gradient inert medium som är fritt lösligt i vatten och används i fraktionering av nukleinsyror, proteiner, polysackarider, och nukleoproteiner13,14. Den har låg osmolalitet och är giftfri, vilket gör det till ett idealiskt medium för rening av intakt levande celler11. Det är ett icke-partikelformigt medel; Därför kan fördelningen av celler i en gradient bestämmas med hjälp av hemocytometer, flödescytometern eller spektrofotometer. Det stör inte de flesta av de enzymatiska eller kemiska reaktionen av cellerna eller cellulära fragment efter spädning.
Musen fungerar som en viktig djur modell för många mänskliga sjukdomar15,16,17,18. Det finns några publicerade artiklar som beskriver rening av muplättarna19,20. Men musen ger en relativt mindre mängd blod, vilket gör det svårt att rena trombocyter. Om samma lilla volym av gradientsubstrat och blod prov används, kan inte trombocyt skiktet tydligt separeras från RBC-WBC-skiktet efter centrifugering. I denna artikel, vi har beskrivit en snabb och enkel metod för musens trombocyt rening med tre gånger mer Johexol gradient medium i förhållande till blod prov volym och lågfart centrifugering. Vi har också aktiverat de renade trombocyter med trombin och undersökt deras kvalitet med flödescytometri och mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blod insamling bör genomföras med lämplig institutionell djur vård och användning kommitté godkännande.
Anmärkning: Trombocyt renings protokollet beskrivs i ett flödes diagram i figur 1.
1. insamling av blod
- Tillsätt 25 μL 3,2 natriumcitrat (pH 7,2) som antikoagulantia och 0,4 mM Gly-Pro-arg-Pro (GPRP) i ett polypropylenrör.
-
Samla in cirka 200 μL blod från C57BL/6-musen med hjälp av retroorbital blödning.
Obs: blod kan samlas in från någon typ av mus stam oavsett ålder eller kön.- Använd 2 mL isofluran i alla typer av kammare för att bedöva musen.
Anmärkning: Anestesi djupet kontrol leras av tecken på ökad andning och minskad rörelse. Musen bör inte reagera på förflyttning av anestesi kammaren, eller att hanteras. Om musen är lyhörd för förflyttning eller hantering, då det kräver mer tid att hålla i anestesi kammaren. - 1.2.2 öppna antingen höger eller vänster ögonlocket på musen och sätt in en 7,5 cm (0,12 cm diameter) kapillärrör i vaskulär plexus i ögat.
- Vrid kapillärröret en halv sväng medan du applicerar tryck på kapillärröret för att bryta kärlen och initiera blod flödet. Håll djuret upp och ner över uppsamlings flaskan för att fyllas med kapillärverkan.
- När lämplig volym av blod samlas in, ta bort kapillärröret och stäng ögat genom att tillämpa milt tryck för 30 s på ögonlocket med gasväv. När blödningen är stoppad, tillbaka musen till sin bur och övervaka för blödning.
- Kontrol lera ögon för trauma 1-2 dagar efter retroorbital blödning. Ta bort någon mus från studien visar tecken på betydande trauma för ögat som ett resultat av förfarandet och euthanize.
Anmärkning: Musen bör inte genomgå någon form av behandling som kan hämma trombocyter under minst två veckor före blod insamling. Blod provet måste användas för trombocyt rening inom en timme efter att du blöder med musen.
- Använd 2 mL isofluran i alla typer av kammare för att bedöva musen.
2. trombocyt rening
Anmärkning: Trombocyt rening bör utföras i rums temperatur för att förhindra deras nedbrytning. Kontrol lera att REAGENSERNAS och instrumentens temperatur är mellan 18 och 22 ° c. För att förhindra trombocyt nedbrytning bör snabb pipettering och kraftig skakning undvikas under ingreppet.
- Tillsätt 600 μl Johexol gradient medium (12% Johexol pulver i 0,85% natriumklorid, 5 mm tricin, pH 7,2)11 i en 1,5 ml tub.
- Tillsätt 200 μl blod prov långsamt längs med den sida av röret som finns ovanpå övertoningsmediet med en bredbar pipettspets så att blod och Johexol inte blandas (figur 2A).
- Centrifugera provet med tub vid 400 x g i 20 min vid 20 ° c i en sväng ande skoprotor med långsam acceleration och retardation.
- Samla de flesta av de blodplättar-rika lagret och en liten bråkdel av blodplättar-fattigt lager (totalt 300 till 400 μL) med en bred bar pipettspets utan att störa RBC och WBC lager (figur 2b). Överför trombocyt provet till ett nytt rör.
Anmärkning: Om trombocyt antalet är mindre i blodet eller en mindre mängd blod används, det trombocyt rika skiktet och trombocytfattiga lager kan ses som ett enda lager. - Tillsätt 1 mL PBS till trombocyt provet, blanda genom att Invertera och centrifugera vid 800 x g i 10 min vid 20 ° c i en sväng ande skoprotor. Kassera lösningen helt och tillsätt 200 μL PBS för att återuppta trombocyterna med mild pipettering.
Anmärkning: Detta steg är valfritt, eftersom det tar bort gradienten medium och plasma proteiner och ökar känsligheten hos trombocyter till agonister såsom trombin. Eftersom olika centrifuger har olika program kan den långsamma accelerationen/retardation bestämmas genom att läsa av centrifugernas bruksanvisning. - Överför 30 μL av provet till ett nytt rör för att räkna antalet blodplättar. De återstående trombocyterna kan användas för biokemiska och fysiologiska analyser såsom trombocyt aktivering, agg regering, granule release, etc.
- För RNA-eller proteinextraktion, Centrifugera trombocyt provet vid 800 x g i 10 min för att pelletera trombocyterna. Kassera supernatanten helt utan att störa pelleten. Tillsätt den önskade volymen RNA eller proteinlysbufferten för att lysera trombocyterna.
3. räkna trombocyter
- Räkna hela blod kropparna utan spädning och renade blodplättar (utspätt 2 till 5-faldigt med PBS) med hjälp av en automatiserad cell analysator. Använd 30 till 50 μL prov för att räkna.
- Beräkna det totala antalet blodplättar genom att multiplicera med volymen av provet.
- Beräkna procent andelen av avkastningen/återhämtning av renade blodplättar.
- Räkna RBC och WBC i det renade trombocyt provet (utspädd 50 till 100-faldigt med PBS) med en hemocytometern och Mikroskop.
4. aktivering av trombocyt aggregation
- I ett rör, tillsätt 1 till 2 000 000 renade trombocyter i upp till 100 μL färgbuffert (PBS med 2% Foster bovint serum, FBS).
- För flera antal prover, gör en masterblandning av anti kroppar med 1 μL (0,5 mg/mL) av följande: PE-Cy7 råtta mot-mus TER 119, PE råtta mot-mus CD45, FITC råtta mot-mus CD41, och APC råtta mot-mus/mänsklig CD62P (P-selectin) till upptäcka RBC, WBC, trombocyter, och respektive aktiva trombocyter. Lägg till huvud mixen i rören för färgning av cellerna. Tillsätt inte trombin.
- I ett annat rör, tillsätt 1 till 2 000 000 av renade blodplättar i upp till 100 μL färgbuffert, och 0,4 mM GPRP peptid. Tillsätt trombin för att aktivera trombocyterna och färga cellerna efter steg 4,2.
Anmärkning: GPRP ska läggas till i provet innan trombin tillsätts för att förhindra agg regering eller koagelbildning genom trombocyt aktivering. Trombinkoncentrationen bör optimeras för att erhålla god aktivering av trombocyter. Efter trombocyt aktivering minskar antalet händelser vid förvärv av prover med flödescytometri. - Som en positiv kontroll, tillsätt 1 μL helblod i upp till 100 μL färgbuffert i ett rör och 0,4 mM GPRP peptid. Tillsätt trombin för att aktivera trombocyter. Som en negativ kontroll, tillsätt 1 μL helblod i upp till 100 μL färgbuffert. Tillsätt inte trombin i negativt kontroll prov. Färga cellerna efter steg 4,2.
- För flödescytometri isotypen kontroll, etikett 5 rör med obefläckade, PE-Cy7, PE, FITC, och APC. Tillsätt 100 μL färgbuffert, 1 μL blod och 1 μL av respektive anti kropp till de märkta rören för att färga cellerna.
- Inkubera proverna för att färga i 30 min vid rums temperatur i mörker.
- Tvätta proverna genom att tillsätta 1 mL färgbuffert i varje tub. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid rums temperatur. Kassera färgbufferten omsorgsfullt utan att ta bort pelleten.
- Tillsätt 300 μL färgbuffert i varje tub, blanda milt och överför till ett FACS-rör. Förvara de färgade proverna i mörkret tills analyseras med en flödescytometer.
5. Flow Cytometri analyser av trombocyter
-
Skapa ett nytt experiment och generera log Forward scatter vs log sida scatter dot tomter och tilldela grindar för Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (trombocyter), och CD62P APC (aktiverat trombocyter) populationer enligt den gating strategi som valts för experiment i program varan FACS DIVA.
- Öppna befolkningshierarkin genom att välja Visa befolkningshierarki under fliken populationer . Redigera befolkningshierarkin genom att kontrol lera den gating strategi och korrekt döpa om portarna.
- Öppna statistikvyn genom att välja skapa statistikvy. Redigera statistikvyn enligt användar inställningarna genom att högerklicka på statistikens vy och välja Redigera statistikvy.
- Välj en färg för varje grind som förstärker den visuella aspekten av layouten genom att dubbelklicka på rutan som motsvarar populationen.
- I Cytometer fönstret, klicka på fliken parametrar och justera spänningar för parametrar för att visualisera befolkningen av intresse på tomterna.
- Justera spänningar för var och en av parametrarna så att den negativa populationen kan särskiljas från den positiva populationen. Innan du registrerar proverna för kompensations kontroll, kontrol lera att de enfärgade positiva kontrollerna är i skala (se till att de positiva topparna är synliga och inte för långt åt höger).
Anmärkning: Om de positiva topparna är av skala, bör spänningarna justeras för att se de positiva populationerna. - Spela in enfärgad färgade celler för kompensation kontroller (obefläckade, PE-Cy7, PE, FITC, och APC).
- Om de positiva kontroll grindarna inte är korrekt inställda, justera dem genom att ändra spänningar.
- Gå till Experiment ≫ kompensations inställningar ≫ beräkna kompensation. Välj Använd endast i det resulterande fönstret.
- Växla till det globala kalkyl bladet genom att klicka på växlings knappen i det övre vänstra hörnet av kalkyl blads fönstret.
- Fyll på det positiva kontroll provet och skaffa tillräckligt med celler för att justera kompensationen och grindarna.
- Läs in provet igen och kontrol lera att varje observations område visar den förväntade cell populationen baserat på den färgade anti kroppen av fluorkrom. Förvärva och registrera 100 000 händelser för helblod prover och 10 000 händelser för renade blodplättar. Ladda proverna en efter en tills förvärvet är slutfört.
- Analysera flödescytometri-data med program varan med lämpliga tomter och grindar (figur 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammanfattningen av trombocyt rening beskrivs i ett flödes diagram (figur 1). Stegen omfattar insamling av blod från musen med hjälp av retroorbital blödning i närvaro av en antikoagulantia, tillsats av blod prov på Johexol gradient medium, centrifugering i en sväng ande hink rotor på 400 x g för 20 min vid 20 ° c. Kvaliteten på de renade trombocyterna utvärderades med Mikroskopi och flödescytometri efter färgning med anti kroppar för att detektera eventuella kontaminerande celler och aktiverade blodplättar.
Iohexolgradientmediet och blod provet bildade två separata lager i röret om blodet långsamt lades på mediet (figur 2A). Men om det finns förseningar i detta steg, kan de flesta av blod provet diffusa in i mediet och det kan vara svårt att rena trombocyterna. De vida-Bore pipettspetsarna säkerställde ingen fysisk stress till trombocyter som är viktigt för att upprätthålla integriteten av trombocyter och förhindra deras nedbrytning. Under centrifugering bidrog långsam acceleration till att förhindra oavsiktlig blandning av blod provet med Johexol medium och långsam retardation bidrog till att bibehålla lutningen efter centrifugering. Den övre (halm färg) skiktet innehöll plasma och inte innehöll några typer av intakt blod kroppar, det andra skiktet (vitaktig) från toppen innehöll majoriteten av de blodplättar som samlades in med hjälp av en bred-bar pipettspetsen, det tredje skiktet (transparent) var som delvis samlats in noggrant för att undvika aspiration av botten skiktet (röd) RBC och WBC (figur 2b). Det blodplättar-rika skiktet och blodplättar fattiga lager kunde inte ses separerade om trombocyt antalet var låg i blod provet. RBC och WBC skiktet kunde inte ses som separata lager eftersom blod volymen var liten. Men WBC bildar ett vitt lager, som kallas Buffy Coat mellan blodplättar fattiga lager och RBC lager om en större mängd blod används för rening10, 11. Det är viktigt att utföra hela proceduren vid 18 till 22 ° c. Både högre temperatur och kylning av proverna gav lägre trombocyt antal på grund av nedbrytning.
Vi hittade 18,2 till 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) återhämtning/avkastning av de renade trombocyter. För att undersöka deras lönsamhet aktiverades renade trombocyt prov med trombin. Flödescytometrisk analys av trombocyter prover gjordes efter färgning med markörer för trombocyter, aktiverade trombocyter, RBC, och WBC. Hela blodet visade distinkta populationer av RBC, WBC, och blodplättar på en logaritmisk framåt scatter vs sida scatter dot Plot (figur 3a), medan de renade trombocyter visade en distinkt population med försumbara antal RBC och WBC (figur 3b ). Hela blodet visade RBC och WBC efter färgning dem med anti-mus Ter119 och anti-mus CD45 anti kropp (figur 3c) medan de renade trombocyter visade försumbar antal RBC och WBC (figur 3D). Vi utvärderade det renade trombocyt provet med Mikroskop och såg inte något betydande antal intakt RBC och WBC. Därför kan RBC och WBC händelser som visades i figur 3D vara fragment av RBC och WBC innehåller TER119 och CD45, respektive. Renade blodplättar som inte behandlades med trombin visade nästan ingen aktivering som indikerade deras vilo tillstånd (figur 3e), medan renade trombocyter som behandlades med trombin uppvisade 71% aktivering (upp till 93% aktivering observerades i vissa prover) ( Figur 3F) som visar deras lönsamhet. Vi utförde också mikroskopisk utvärdering av renade trombocyt prov som inte behandlats med trombin, vilket inte visade någon trombocyt aggregation (figur 4a), men renade trombocyter bildade aggregat efter att ha behandlats med trombin (figur 4b), vilket ytterligare indikerar deras lönsamhet. Baserat på flödescytometriska och mikroskopiska studier bekräftade vi att våra renade blodplättar var av god kvalitet.
Figur 1: Schematiskt diagram för trombocyt rening av mus. Blod prov från musen samlas in i närvaro av en antikoagulantia. Blod provet tillsätts långsamt på Iohexol-gradientmediet och centrifugeras vid 400 x g i 20 min vid 20 ° c. Trombocyt skiktet överförs till ett nytt rör. Kvaliteten på renade blodplättar kontrol leras med Mikroskopi och flödescytometri. Trombocyterna kan användas omedelbart eller förvaras vid-80 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Mus blod före och efter centrifugering med Iohexol gradient medium. Aiohexol och blod bildar två separata skikt före centrifugering om blod provet tillsätts noggrant. Vänstra panelen visar Schematiskt diagram och höger panel visar den faktiska bilden. B) fyra separata lager ses efter centrifugering av helblod med gradient medium. Vänstra panelen visar Schematiskt diagram över lagren och den högra panelen visar den faktiska bilden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flödescytometrisk analys av renade blodplättar. (A) helblod visar RBC, WBC, och trombocyter populationer. (B) renade blodplättar uppvisar ett mindre antal RBC-och WBC-händelser. (C) helblod visar RBC och WBC efter färgning med anti-mus Ter119 och anti-mus CD45. (D) renade blodplättar visar försumbara antal RBC och WBC händelser efter färgning med anti-mus Ter119 och anti-mus CD45. (E) renade blodplättar färgade med anti-mus CD41 och anti-mus/människa P-selektin visar nästan ingen trombocyt aktivering. (F) renade trombocyter som behandlats med trombin och färgas med anti-mus CD41 och anti-mus/människa P-selektin visar aktivering av trombocyter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mikroskopisk utvärdering av renade blodplättar. A) renade blodplättar uppvisar inga agg regeringar. B) renade trombocyter som behandlats med agg regering av trombin. Båda siffrorna är 200x förstoring, okulär lins 10x och objektiv lins 20x. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanligt vis, trombocyter isoleras genom låg hastighet centrifugering som ger trombocyt rik plasma som innehåller ett stort antal blod kroppar, cellulära skräp, och plasma proteiner som kan störa den biokemiska och fysiologiska analyser och behov ytterligare rening21. Därför är det viktigt att använda en snabb och enkel metod som kan ge rena blodplättar utan större föroreningar. Det protokoll som presenteras här beskriver rening av blodplättar från mus blod med hjälp av ett gradient medium med låg hastighet centrifugering. Parametrarna som används i detta protokoll maximerar avkastningen och minimerar nedbrytningen av trombocyter. Gradienten medium och plasma proteiner kan avlägsnas genom att inkludera en tvätt steg efter trombocyt samling som kan öka känsligheten hos trombocyter till agonist eller anti kropp. Viktigast är att de renade trombocyter är i vilo tillstånd, men de kan aktive ras i närvaro av en agonist, såsom trombin. Vi har funnit att trombinaktiviteten varierar från en källa till en annan. Därför bör trombinkoncentrationen optimeras empiriskt för att erhålla god aktivering av trombocyter.
På grund av en liten volym av mus blod, det är obekvämt att rena trombocyter eftersom trombocyter kan blandas med RBC och WBC under aspiration. Vi har löst detta problem genom att optimera förhållandet mellan blod prov och gradient medium. Vi har funnit att tre gånger mer gradient medium i förhållande till blod volymen kan tydligt separera trombocyt skiktet från serum och RBC-WBC lager som underlättar enkel insamling av rena blodplättar.
Trombocyt rening bör utföras i rums temperatur mellan 18 till 22 ° c för att förhindra att de förstörs. Det har rapporter ATS att trombocyter försämras om de förvaras i kyl skåp eller temperaturer över 27 ° c11. Snabb pipettering och kraftig skakning bör undvikas för att förhindra trombocyt nedbrytning under rening. Eftersom olika centrifuger har olika program, bör accelerationen/retardation bestämmas empiriskt för att bibehålla lutningen.
Om flera mus blod prov används i reningen, bör blödningen göras på mindre än 1 h och rening bör slutföras nästa inom 1 h. Om blodprover lämnas för mer än 2 h, kan trombocyter inte renas på grund av deras nedbrytning. Om fler blodplättar behövs för någon studie, kan mus blodet samlas in genom Terminal procedurer såsom hjärt punktering eller sämre Vena Cava blödning, som ger 800 till 1 000 μL blod, och trombocyt rening bör utföras i flera rör och kombineras efter rening.
Sammanfattnings vis har vi beskrivit ett enkelt och snabbt protokoll för trombocyt rening från en liten volym av mus blod. Denna metod kan också användas för trombocyt rening från andra arter samt. De renade trombocyter kan användas för gen uttryck, aktivering och granule release, agg regering, och vidhäftning analyser vid stimulering med olika agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar ingen intresse konflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en start-up finansiering av Cincinnati Children ' s Research Foundation och ett University of Cincinnati pilot translational bidrag till M.N. Vi vill tacka Cincinnati Children ' s Hospital forskning Flow Cytometry Core för sina tjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
