Summary
Her ble mus blod samlet i nærvær av en anti-koagulere. Blodplatene ble renset ved iohexol gradient medium ved hjelp av lav hastighet sentrifugering. Blodplatene ble aktivert med trombin for å undersøke om de var levedyktige. Kvaliteten på de renset blodplatene ble analysert av Flow flowcytometri og mikroskopi.
Abstract
Blodplater er renset fra hele blodet til å studere deres funksjonelle egenskaper, som bør være fri fra røde blodlegemer (RBC), hvite blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av tre-fold mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og sentrifugering i en svingende bøtte rotoren på 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Utvinningen/utbyttet av renset blodplater var 18.2-38.5%, og renset blodplater var i hviletilstand, som ikke inneholder noen betydelig antall RBC og WBC. De renset blodplater behandlet med trombin viste opp til 93% aktivisering, indikerer deres levedyktighet. Vi har bekreftet at de renset blodplatene er tilstrekkelig rene ved bruk av strømnings analytiske og mikroskopisk evaluering. Disse blodplater kan brukes til genuttrykk, aktivisering, granule utgivelse, aggregering, og vedheft analyser. Denne metoden kan brukes for rensing av blodplater fra blodet til andre arter også.
Introduction
Blodplater er en del av blodet som fungerer som en initiativtaker til blodpropp som svar på skade i blodkaret. De samles på stedet av skade for å plugge fartøyet veggen1. Blodplater er anucleate fragmenter som stammer fra megakaryocytter av benmargen under påvirkning av thrombopoietin og angi sirkulasjon2. De regnes som metabolically aktiv og i stand til sensing ekstracellulære miljø ved å aktivere intracellulære signalering kaskader som resulterer i blodplater sprer seg, aggregering, og hemostatic plug formasjon1,3. Foruten hemostase/trombose og sår helbredelse4, blodplater spille en viktig rolle i Host inflammatoriske responser, angiogenese, ogmetastatis 3,5,6,7, 8i den.
Blodplater er renset fra blodet til å studere sine biokjemiske og fysiologiske egenskaper, som skal være fri for andre blodkomponenter. Siden røde blodlegemer (RBC) og hvite blodlegemer (WBC) inneholder betydelig mer RNA og proteiner enn blodplater9,10, kan tilstedeværelsen av selv et lite antall av disse cellene forstyrre transcriptomic og Proteomikk analyser av RNA og proteiner avledet fra blodplater. Vi fant at renset blodplater aktivert med trombin bind antistoff som anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mer effektivt enn hele blodplater.
Siden blodplater er skjøre, er det viktig å behandle prøvene så mildt som mulig. Hvis blodplatene er aktivert, slipper de sitt granule innhold og til slutt brytes ned. Derfor, for å holde blodplater funksjonelle egenskaper intakt, er det viktig å opprettholde blodplate fredfulle omgivelser under isolasjon. Flere protokoller har beskrevet isolering av blodplater fra menneske, hund, rotte, og ikke-menneskelige primater av ulike metoder1,10,11,12. Noen av metodene krever flere trinn som for eksempel innsamling av blodplater-rik plasma av sentrifugering, filtrering av separasjon kolonne, negativt utvalg av blodplater med RBC-og WBC-spesifikke antistoff bøyd til magnetiske perler, og så videre, som er tidkrevende og kan svekke blodplater og deres innhold.
Ford og kollegene hans beskrev blodplate rensing fra humant blod ved hjelp av iohexol medium11. Denne metoden bruker et lignende volum av blodprøve og medium under rensing. Siden mennesker gir et høyere volum av blod, er det relativt lett å rense blodplater.
Iohexol er en Universal Density gradient inert medium som er fritt oppløselig i vann og brukes i fraksjonering av nukleinsyre syrer, proteiner, polysakkarider, og nucleoproteins13,14. Det har lav osmolalitet og er ikke giftig, og dermed gjør det til et ideelt medium for rensing av intakt levende celler11. Det er et ikke-partikkel medium; fordelingen av celler i en gradering kan derfor bestemmes ved hjelp av hemocytometer, flyt flowcytometer eller spektrofotometer. Det forstyrrer ikke det meste av enzymatisk eller kjemisk reaksjon av cellene eller cellulære fragmenter etter fortynning.
Musa fungerer som en viktig dyremodell for mange menneskelige sykdommer15,16,17,18. Det er noen publiserte artikler som beskriver rensing av musen blodplater19,20. Men musen gir et relativt mindre volum av blod, noe som gjør det vanskelig å rense blodplater. Hvis det samme lille volumet av gradient medium og blodprøver er brukt, kan blodplater laget ikke klart skilles fra RBC-WBC lag etter sentrifugering. I denne artikkelen har vi beskrevet en rask og enkel metode for mus blodplater rensing med tre ganger mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og lav hastighet sentrifugering. Vi har også aktivert renset blodplater med trombin og undersøkt deres kvalitet med Flow flowcytometri og mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mouse blod samling bør gjennomføres med riktig institusjonelle dyr omsorg og bruk komité godkjenning.
Merk: Blodplate rense protokollen er beskrevet i et strømnings skjema i figur 1.
1. innsamling av blod
- Tilsett 25 μL av 3,2% natrium citrate (pH 7,2) som en anti-koagulere og 0,4 mM Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) i et polypropylen rør.
-
Samle inn omtrent 200 μL av blod fra C57BL/6-musen ved hjelp av retro-orbital blødning.
Merk: blod kan samles fra alle typer mus belastning uansett alder eller kjønn.- Bruk 2 mL isoflurane i en hvilken som helst type kammer for å bedøve musen.
Merk: Dybde av anestesi er kontrollert av tegn til økt åndedrett og redusert bevegelse. Musen skal ikke svare på bevegelse av anestesi kammeret, eller til å bli håndtert. Hvis musen er mottakelig for bevegelse eller håndtering, så det krever mer tid til å holde i anestesi kammeret. - 1.2.2 åpne enten høyre eller venstre øyelokk av musen og sett inn en 7,5 cm (0,12 cm diameter) kapillærrør i vaskulær plexus i øyet.
- Vri kapillærrøret en halv omdreining mens du påfører Trykk på kapillærrøret for å bryte fartøyene og initiere blodstrøm. Hold dyret opp ned over samle hetteglasset for å bli fylt av kapillær handling.
- Når det aktuelle volumet av blod er samlet, Fjern kapillærrøret og Lukk øyet ved å påføre mildt Trykk for 30 s på øyelokket med gasbind. En gang blø er stanset, retur musa å dens bur og dataskjerm for blø.
- Sjekk øynene for traumer 1-2 dager etter retro-orbital blødning. Fjern enhver mus fra studien som viser tegn på betydelige traumer for øyet som følge av prosedyren og euthanize.
Merk: Musen skal ikke gjennomgå noen form for behandling som kan hemme blodplater i minst to uker før blodoppsamling. Blodprøven må brukes for blodplate rensing innen en time etter blødning musen.
- Bruk 2 mL isoflurane i en hvilken som helst type kammer for å bedøve musen.
2. blodplate rensing
Merk: Blodplate rensing bør utføres ved romtemperatur for å hindre deres degradering. Sørg for at temperaturen på reagensene og instrumentene er mellom 18 og 22 ° c. For å forhindre blodplate forringelse, bør rask pipettering og kraftig risting unngås under prosedyren.
- Tilsett 600 μL av iohexol gradient medium (12% iohexol pulver i 0,85% natriumklorid, 5 mM Tricine, pH 7,2)11 til en 1,5 ml tube.
- Tilsett 200 μL av blodprøve sakte ned på siden av røret på toppen av gradient medium med en bred bore pipette spissen slik at blod og iohexol medium ikke blandes (figur 2a).
- Sentrifuger prøven inneholder rør ved 400 x g i 20 min ved 20 ° c i en svingende bøtte rotor med langsom akselerasjon og retardasjon.
- Samle det meste av det plate rike laget og en liten brøkdel av et lite plate lag (totalt 300 til 400 μL) ved hjelp av et bredt kjede pipette uten å forstyrre RBC-og WBC-lagene (figur 2b). Overfør blodplate prøven til et nytt rør.
Merk: Hvis blodplater er mindre i blodet eller et mindre volum av blod brukes, kan blodplater rike lag og plate-fattig lag bli sett på som et enkelt lag. - Tilsett 1 mL PBS til blodplate prøven, bland med invertere og sentrifuger ved 800 x g i 10 min ved 20 ° c i en svingende skuffe rotor. Kast oppløsningen fullstendig og tilsett 200 μL av PBS for å resuspend blodplatene med milde pipettering.
Merk: Dette trinnet er valgfritt, da det fjerner gradient medium og plasmaproteiner og øker følsomheten av blodplater til agonister som trombin. Siden ulike sentrifuger har forskjellige programmer, langsom akselerasjon/retardasjon kan bestemmes ved å lese brukermanualen for sentrifuger. - Overfør 30 μL av denne prøven til et nytt rør for å telle blodplater. De resterende blodplater kan brukes til biokjemiske og fysiologiske analyser som blodplate aktivering, aggregering, granule Release, etc.
- For RNA eller protein ekstraksjon, sentrifuger blodplate prøven ved 800 x g i 10 min til pellets blodplater. Kast supernatanten helt uten å forstyrre pellet. Legg til ønsket volum av RNA-eller protein lyseringsbuffer for å lyse blodplatene.
3. telle blodplater
- Telle hele blodlegemer uten fortynning og renset blodplater (fortynnet 2 til 5-fold med PBS) ved hjelp av en automatisert celle analysator. Bruk 30 til 50 μL prøver for telling.
- Beregn totalt antall blodplater ved å multiplisere med volumet av prøven.
- Beregn prosentandelen av avkastning/gjenvinning av renset blodplater.
- Telle RBC og WBC i renset blodplater prøven (fortynnet 50 til 100-fold med PBS) med en hemocytometer og mikroskop.
4. blodplate aktivisering
- I et rør, tilsett 1 til 2 000 000 renset blodplater i opptil 100 μL av farge buffer (PBS med 2% fosterets storfe serum, FBS).
- For flere antall prøver, lag en Master miks av antistoffer med 1 μL (0,5 mg/mL) av følgende: PE-Cy7 rotte anti-mus TER 119, PE rotte anti-mus CD45, FITC rotte anti-mus CD41, og APC rotte anti-mus/Human CD62P (P-selectin) for å oppdage RBC, WBC, blodplater, og aktiverte blodplater, henholdsvis. Legg Master Mix til rørene for farging av cellene. Ikke Legg til trombin.
- I et annet rør, tilsett 1 til 2 000 000 av renset blodplater i opptil 100 μL av farge buffer, og 0,4 mM GPRP peptid. Legg trombin å aktivere blodplater og beis cellene følgende trinn 4,2.
Merk: GPRP bør legges til prøven før du legger til trombin for å forhindre dannelse av aggregat eller blodpropp gjennom blodplate aktivering. Trombin konsentrasjon bør optimaliseres for å oppnå god aktivering av blodplater. Etter blodplate aktivering reduseres hendelsesantallet under anskaffelse av prøver ved å strømme flowcytometri. - Som en positiv kontroll, tilsett 1 μL av hele blod i opptil 100 μL farge buffer i et rør og 0,4 mM GPRP peptid. Legg til trombin for å aktivere blodplater. Som en negativ kontroll, tilsett 1 μL av hele blod i opptil 100 μL av farge buffer. Ikke Legg til trombin i eksempel på negativ kontroll. Stain cellene følgende trinn 4,2.
- For flyt flowcytometri isotype kontroll, etikett 5-rør med unstained, PE-Cy7, PE, FITC og APC. Tilsett 100 μL av farge buffer, 1 μL av blod og 1 μL av det respektive antistoff til de merkede rørene for å farge cellene.
- Ruge prøver å flekken i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Vask prøvene ved å tilsette 1 mL farge buffer til hvert rør. Sentrifuger ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur. Kast farge bufferen forsiktig uten å dislodging pellet.
- Tilsett 300 μL av farge buffer i hvert rør, bland mildt og Overfør til et FACS-rør. Oppbevar farget prøvene i mørket til analysert med en Flow flowcytometer.
5. Flow flowcytometri analyser av blodplater
-
Opprett et nytt eksperiment og Generer Logg fremover scatter kontra log side scatter dot tomter og tilordne porter for Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (blodplater), og CD62P APC (aktiverte blodplater) populasjoner i henhold til gating strategi valgt for eksperiment i FACS DIVA programvare.
- Åpne befolknings hierarkiet ved å velge Vis befolknings hierarki under populasjoner -fanen. Rediger befolknings hierarkiet ved å kontrollere gating strategien og gi portene riktig navn.
- Åpne statistikk visning ved å velge Opprett statistikk visning. Rediger statistikk visning i henhold til bruker innstillingene ved å høyreklikke på statistikk visningen og velge Rediger statistikk visning.
- Velg en farge for hver port som forsterker det visuelle aspektet ved layouten ved å dobbeltklikke på boksen som tilsvarer populasjonen.
- I flowcytometer -vinduet klikker du på Parametere -fanen og justerer spenningene for parametere for å visualisere befolkningen av interesse på tomter.
- Juster spenninger for hver av parametrene slik at den negative befolkningen kan skilles fra den positive befolkningen. Før innspillingen av prøvene for kompensasjon kontroll, sjekk at enkelt-farget positive kontroller er på skalaen (sørg for at de positive toppene er synlige og ikke for langt til høyre).
Merk: Hvis de positive toppene er av skalaen, bør spenningene justeres for å se de positive populasjoner. - Spill inn enkelt fargede fargede celler for kompensasjons kontroller (unstained, PE-Cy7, PE, FITC og APC).
- Hvis de positive kontroll portene ikke er riktig konfigurert, justerer du dem ved å endre spenninger.
- Gå til eksperiment ≫ kompensasjonsoppsett ≫ Beregn kompensasjon. Velg bare bruk i det resulterende vinduet.
- Bytt til det globale regnearket ved å klikke på veksleknappen øverst til venstre i regnearkvinduet.
- Last inn den positive kontroll prøven og Skaff nok celler til å justere kompensasjonen og portene.
- Last prøven på nytt, og kontroller at hvert plott viser forventet cellepopulasjon basert på det fluorokromkonjugert flekket antistoff. Tilegne seg og registrere 100 000 hendelser for hele blodprøver og 10 000 hendelser for renset blodplater. Last prøvene en etter en til oppkjøpet er fullført.
- Analysere flyten flowcytometri data med programvaren med passende tomter og porter (Figur 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammendraget av plate rensing er beskrevet i et strømnings skjema (figur 1). Trinn inkluderer innsamling av blod fra mus ved hjelp av retro-orbital blødning i nærvær av en antikoagulerende, tillegg av blodprøve på iohexol gradient medium, sentrifugering i en svingende bøtte rotor på 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Kvaliteten på de renset blodplatene ble evaluert med mikroskopi og Flow flowcytometri etter farging med antistoff for å oppdage eventuelle forurensende celler og aktiverte blodplater.
Den iohexol gradient medium og blodprøve dannet to separate lag i røret Hvis blodet ble langsomt lagt på mediet (figur 2a). Men hvis det er forsinkelser i dette trinnet, kan det meste av Blodprøven diffus i mediet, og det kan være vanskelig å rense blodplater. De brede pipette tipsene sørget ikke for fysisk stress på blodplatene, noe som er viktig for å opprettholde integriteten til blodplater og hindre deres degradering. Under sentrifugering hjalp langsom akselerasjon å hindre utilsiktet blanding av Blodprøven med iohexol medium og langsom retardasjon bidro til å opprettholde graderingen etter sentrifugering. Den øverste (halm farge) laget inneholdt plasma og ikke inneholder noen typer intakt blodlegemer, det andre laget (hvitaktig) fra toppen inneholdt flertallet av blodplater som ble samlet inn ved hjelp av en omfattende pipette spissen, det tredje laget (transparent) var blodplater fattig som ble delvis samlet inn nøye for å unngå aspirasjon av nederste lag (rød) RBC og WBC (figur 2b). Det plate rike laget og plate fattig laget kunne ikke ses separert hvis blodplate antallet var lavt i blodet. Den RBC og WBC laget kunne ikke bli sett på som separate lag siden blod volumet var liten. Men WBC danner et hvitt lag, kalt Buffy coat mellom blodplater dårlig lag og RBC lag hvis et større volum av blod brukes for rensing10, 11. Det er viktig å gjennomføre hele prosedyren ved 18 til 22 ° c. Både høyere temperatur og kjøling av prøvene ga lavere antall blodplater på grunn av degradering.
Vi fant 18,2 til 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) utvinning/utbytte av renset blodplater. For å undersøke deres levedyktighet, ble renset blodplater prøver aktivert med trombin. Flow analytiske analyse av blodplater prøvene ble gjort etter farging med markører for blodplater, aktiverte blodplater, RBC, og WBC. Hele blodet viste distinkte populasjoner av RBC, WBC, og blodplater på en logaritmisk fremover scatter vs side scatter prikk plot (figur 3a), mens renset blodplater viste en distinkt befolkning med UBETYDELIG antall RBC og WBC (figur 3b ). Hele blodet viste RBC og WBC etter farging dem med anti-mus Ter119 og anti-mus CD45 antistoff (figur 3c) mens renset blodplater viste UBETYDELIG antall RBC og WBC (figur 3D). Vi evaluerte renset blodplater prøven med et mikroskop og ikke se noen betydelig antall intakt RBC og WBC. Derfor, RBC og WBC hendelser som ble vist i figur 3D kan være fragmenter av RBC og WBC som inneholder TER119 og CD45, henholdsvis. Renset blodplater som ikke ble behandlet med trombin viste nesten ingen aktivering indikerer hviletilstand (figur 3e), mens renset blodplater behandlet med trombin viste 71% aktivering (opp til 93% aktivering ble observert i noen prøver) ( Figur 3F) indikerer deres levedyktighet. Vi utførte også mikroskopisk evaluering av renset blodplater prøver ikke behandlet med trombin som viste ingen plateaggregering (figur 4a), men renset blodplater dannet aggregater etter å ha blitt behandlet med trombin (figur 4b), som ytterligere indikerer deres levedyktighet. Basert på flyt analytiske og mikroskopiske studier, bekreftet vi at våre renset blodplater var god kvalitet.
Figur 1: skjematisk diagram for musen blodplater rensing. Blodprøve fra mus samles i nærvær av en antikoagulerende. Blodprøven er langsomt lagt inn på Iohexol gradient medium og sentrifugert ved 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Plate laget overføres til et nytt rør. Kvaliteten på renset blodplater er kontrollert med mikroskopi og Flow flowcytometri. Blodplatene kan brukes umiddelbart eller lagres ved-80 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Mouse blod før og etter sentrifugering med Iohexol gradient medium. (A) Iohexol og blod danner to separate lag før sentrifugering hvis Blodprøven tilsettes nøye. Venstre panel viser skjematisk diagram og høyre panel viser selve bildet. (B) fire separate lag er sett etter sentrifugering av hele blod med gradient medium. Venstre panel viser skjematisk diagram av lagene og høyre panel viser selve bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow analytiske analyse av renset blodplater. (A) hele blod viser RBC, WBC, og blodplater populasjoner. (B) renset blodplater viser mindre antall RBC og WBC hendelser. (C) hele BLODET viser RBC og WBC etter farging med anti-mus Ter119 og anti-mus CD45. (D) renset blodplater viser UBETYDELIG antall RBC og WBC hendelser etter farging med anti-mus Ter119 og anti-mus CD45. (E) renset blodplater beiset med anti-mus CD41 og anti-mus/Human P-selectin viser nesten ingen blodplate aktivering. (F) renset blodplater behandlet med trombin og beiset med anti-mus CD41 og anti-mus/Human P-selectin Vis aktivering av blodplater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mikroskopisk evaluering av renset blodplater. (A) renset blodplater viser ikke noen aggregering. (B) renset blodplater behandlet med trombin viser aggregering. Begge tallene er 200x forstørrelse, øye objektiv 10x og objektiv objektiv 20x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanligvis er blodplater isolert med lav hastighet sentrifugering som gir blodplater rik plasma som inneholder et betydelig antall blodlegemer, cellulære rusk, og plasmaproteiner som kan forstyrre de biokjemiske og fysiologiske analyser og behov ytterligere rensing21. Derfor er det viktig å bruke en rask og enkel metode som kan gi rene blodplater uten store forurensninger. Protokollen som presenteres her beskriver rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av en gradient medium med lav hastighet sentrifugering. Parametrene som brukes i denne protokollen maksimere avkastningen og minimere nedbrytning av blodplater. Gradient medium og plasmaproteiner kan fjernes ved å inkludere en vasketrinn etter platesamling som kan øke følsomheten av blodplater til Agonistiske eller antistoff. Viktigst, renset blodplater er i hviletilstand, men de kan aktiveres i nærvær av en Agonistiske, for eksempel trombin. Vi har funnet ut at trombin aktivitet varierer fra en kilde til en annen. Derfor bør trombin konsentrasjon optimaliseres empirisk for å oppnå god aktivering av blodplater.
På grunn av et lite volum av mus blod, er det upraktisk å rense blodplater fordi blodplater kan blandes med RBC og WBC under aspirasjon. Vi har løst dette problemet ved å optimalisere forholdet mellom blodprøve og gradient medium. Vi har funnet at tre ganger mer gradient medium i forhold til blod volumet kan tydelig skille blodplater laget fra serum og RBC-WBC lag som letter enkel samling av rene blodplater.
Blodplate rensing bør utføres ved romtemperatur mellom 18 til 22 ° c for å hindre deres degradering. Det er rapportert at blodplater brytes ned hvis de oppbevares i kjøleskapet eller temperaturer over 27 ° c11. Rask pipettering og kraftig risting bør unngås for å hindre blodplate degradering under rensing. Siden ulike sentrifuger har forskjellige programmer, bør akselerasjon/retardasjon bestemmes empirisk å opprettholde gradient.
Hvis flere mus blodprøver brukes i rensing, bør blødningen gjøres på mindre enn 1 time og rensing skal være ferdig neste innen 1 time. Hvis blodprøvene er igjen i mer enn 2 timer, kan ikke blodplater renses på grunn av degradering. Hvis flere blodplater er nødvendig for noen studie, musen blod kan samles inn av Terminal prosedyrer som hjerte punktering eller dårligere vena cava blødning, som gir 800 til 1 000 μL blod, og blodplate rensing bør utføres i flere rør og kombinert etter rensing.
Avslutningsvis har vi beskrevet en enkel og rask protokoll for blodplate rensing fra et lite volum av mus blod. Denne metoden kan også brukes til plate rensing fra andre arter også. De renset blodplater kan brukes til genuttrykk, aktivisering og granule utgivelse, aggregering, og vedheft analyser ved stimulering med ulike agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en oppstart finansiering av Cincinnati Children ' s Research Foundation og et universitet i Cincinnati pilot translational stipend til M.N. Vi vil gjerne takke Cincinnati Children ' s Hospital Research Flow flowcytometri Core for sine tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
