Transskription start side tilknytning ved hjælp af super-low input Carrier-CAGE

Summary

Cap analyse af gene Expression (CAGE) er en metode til genomdækkende kvantitativ kortlægning af mRNA 5 ' ender til at indfange RNA polymerase II transskription startsteder på en enkelt-nukleotid opløsning. Dette arbejde beskriver en low-input (SLIC-CAGE) protokol til generering af høj kvalitet biblioteker ved hjælp af nanogram-mængder af total RNA.

Abstract

Cap analyse af genekspression (CAGE) er en metode, der anvendes til single-nucleotid opløsning påvisning af RNA polymerase II transkription start sites (TSSs). Nøjagtig detektering af Tss'er øger identifikationen og opdagelsen af kerne promotorer. Desuden kan aktive smagsforstærkere påvises gennem signaturer af tovejs transkription initiering. Beskrevet her er en protokol til udførelse af super-lav input Carrier-bur (SLIC-bur). Denne SLIC-tilpasning af CAGE-protokollen minimerer RNA-tab ved kunstigt at øge RNA-mængden ved hjælp af et in vitro-transskriberet RNA-bæremix, der føjes til stikprøven af interesse, hvilket muliggør Biblioteks klargøring fra nanogram-mængder af total RNA (dvs. tusinder af celler). Bæreren efterligner den forventede fordeling af fragment længden i DNA-biblioteket og eliminerer dermed de skævheder, der kan forårsages af den overflod af en homogen bærer. I de sidste stadier af protokollen, er bæreren fjernes gennem nedbrydning med homing endonukleaser og målbiblioteket forstærkes. Målprøve biblioteket er beskyttet mod nedbrydning, da de homing endonukleasegenkendelses steder er lange (mellem 18 og 27 BP), hvilket gør sandsynligheden for deres eksistens i den eukaryotiske genomer meget lav. Slutresultatet er et DNA-bibliotek, der er klar til næste generations sekvensering. Alle trin i protokollen, op til sekventering, kan fuldføres inden for 6 dage. Bære præparatet kræver en fuld arbejdsdag; Det kan dog tilberedes i store mængder og holdes frosset ved-80 °C. Når den er sekvenseret, kan aflæsninger behandles for at opnå genom-dækkende single-nukleotid-opløsning Tsss. Tsss kan bruges til Core Promoter eller forstærker opdagelse, giver indsigt i gen regulering. Når dataene er aggregeret til initiativtagerne, kan de også bruges til 5 '-centreret udtryks profilering.

Introduction

Cap analyse af genekspression (CAGE) er en metode, der anvendes til single-nucleotid opløsning genom-dækkende kortlægning af RNA polymerase II transkription start sites (TSSs)¹. Dens kvantitative karakter giver også 5 '-end centreret udtryks profilering. Regioner omkring Tsss (ca. 40 BP upstream og downstream) er kerne promotorer og repræsenterer den fysiske placering, hvor RNA polymerase II og generelle transkription faktorer binder (revideret tidligere^2,3). Oplysninger om de nøjagtige placeringer af TSSs kan bruges til Core Promoter opdagelse og til overvågning af promotor dynamik. Desuden, som aktive smagsforstærkere udviser underskrifter af tovejs transskription, Cage data kan også bruges til at øge opdagelsen og overvågning af forstærker dynamik⁴. CAGE metode er for nylig steget i popularitet på grund af sin brede anvendelse og brug i højt profilerede forskningsprojekter såsom ENCODE⁵, modencode⁶, og fantom projekter⁷. Desuden viser TSS-oplysninger sig også at være vigtige for at skelne sundt og sygt væv, da sygdomsspecifikke Tss'er kan anvendes til diagnostiske formål⁸.

Selv om flere metoder til TSS kortlægning er tilgængelige (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), vi og andre har for nylig vist, at bur er den mest upartisk metode til at indfange sande TSSs med det mindste antal falske positiver^{9 , 10}. den nylige Cage-protokol, NAnT-icage¹¹, er den mest objektive protokol for TSS-profilering, da den undgår at skære fragmenter til korte mærker ved hjælp af begrænsnings enzymer og ikke bruger PCR-forstærkning. En begrænsning af nAnT-iCAGE-protokollen er kravet om en stor mængde udgangsmateriale (f. eks. 5 μg total RNA for hver prøve). For at besvare specifikke, biologisk relevante spørgsmål er det ofte umuligt at opnå så store mængder af udgangsmateriale (f. eks. til FACS-sorterede celler eller tidlige embryonale stadier). Endelig, hvis nAnT-iCAGE er en succes, kun 1-2 ng af DNA-bibliotek materiale er tilgængelig fra hver prøve, hvilket begrænser den opnåelige sekvensering dybde.

For at aktivere TSS profilering ved hjælp af kun nanogram af total RNA, har vi for nylig udviklet super-low input Carrier-CAGE¹⁰ (SLIC-Cage, figur 1). SLIC-CAGE kræver kun 10 ng af total RNA for at opnå høj kompleksitet biblioteker. Vores protokol er afhængig af det omhyggeligt designede syntetiske RNA-luftfartsselskab, der er føjet til RNA af interesse for at opnå i alt 5 μg RNA-materiale. Det syntetiske luftfartsselskab efterligner målet DNA-bibliotek i længde fordeling for at undgå potentielle bias, der kunne være forårsaget af homogene molekyler i overskud. Sekvensen af bæreren er baseret på sekvensen af Escherichia coli leucyl-tRNA syntetase genet (tabel 1) af to årsager. For det første vil eventuelle rester af bæreren i det endelige bibliotek, selv om sekvenseret, ikke knyttes til et eukaryotisk genom. For det andet, da E. coli er en mesofile art, er dens husholdnings gener optimeret til det temperaturområde, der passer til SLIC-Cage. Bære sekvensen er også indlejret med homing endonukleasegenkendelses steder for at tillade specifik nedbrydning af DNA afledt af bære-RNA-molekyler. Det mål, prøve afledte bibliotek forbliver intakt, da de homing endonuklease anerkendelse steder er lange (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) og statistisk usandsynligt at blive fundet i eukaryotisk genomer. Efter specifik nedbrydning af bæreren og fjernelse af fragmenter efter størrelses udelukkelse, er målbiblioteket PCR forstærket og klar til næste generations sekvensering. Afhængigt af start RNA-mængden (1-100 ng) forventes der mellem 13-18 PCR-forstærknings cyklusser. Den endelige mængde DNA pr. prøve spænder mellem 5-50 ng, hvilket giver tilstrækkeligt materiale til meget dyb sekvensering. Når der kun bruges 1-2 ng af det totale RNA, kan der påvises ægte TSSs; bibliotekerne forventes dog at være af mindre kompleksitet. Da SLIC-CAGE er baseret på nAnT-iCAGE-protokol¹¹, giver den mulighed for multiplexing af op til otte prøver før sekventering.

Protocol

1. klargøring af Flyselskabet

1. Udarbejdelse af DNA-skabeloner til in vitro-transskription
   1. Der tilberedes PCR-mix for hver PCR-skabelon ved at kombinere 41 μL vand, 20 μL 5x HF-buffer, 8 μL 2,5 mM dNTPs, 10 μL 10 μM unik Forlæng primer (PCR_GN5_f1, tabel 2, primere opløses og fortyndes i vand) , 10 μL 2 ng/μL skabelon plasmid indeholdende det syntetiske bærer-gen og 1 μL Phusion-polymerase. Bland PCR-blandingen ved at pipette. En Master Mix for alle 10 skabeloner kan forberedes på én gang (Forbered 11 reaktioner).
   2. Der tilsættes 90 μL af PCR-blandingen til 10 μL af hver 10 μM reverse primer (PCR_N6_r1-R10, tabel 2). Bland ved pipettering.
   3. PCR forstærker skabelonerne ved hjælp af følgende program: 98 °C for 60 s, (98 °C for 10 s, 50 °C for 30 s, 72 °C for 30 s) 35 cyklusser, 72 °C i 10 minutter, hold ved 4 °C.
   4. Gel rensning af PCR-forstærkede DNA-skabeloner
      1. Forbered en 1% agopstået gel (lav-smeltende agopstået anbefales).
      2. For at nedsætte lydstyrken skal du koncentrere PCR-reaktions blandingerne fra 100 μL til 20 μL total volumen ved hjælp af vakuum koncentratoren ved lav-medium temperatur (30 – 40 °C).
      3. Tilsæt 6 μL af 6x belastnings farvestoffet, bland godt, og læg på gelen. Kør elektroforese i 30 minutter i 1x TAE-buffer ved den spænding, der passer til den anvendte elektroforese tank (5-10 V/cm). Parallelt køre en 100 BP eller 1.000 BP DNA stigen.
      4. Ved hjælp af en ren skalpel, punktafgifter gel skiver, der indeholder Target PCR produkt. Undgå overskydende agopstået gel. Rense PCR-produkterne ved hjælp af et gel ekstraktions Kit (ifølge producentens anvisninger).
         Bemærk: A260/A230 ratio af DNA isoleret fra agrose geler er typisk lav (0,1 – 0,3). Forventet målprodukt og side produkter er vist i figur 2a. Forventede udbytter fra 100 μL PCR reaktioner er 1,2 – 3 μg. reaktionerne kan skaleres op for at få et højere udbytte.
2. In vitro transskription af bære molekyler
   1. Transskribere Carrier RNA in vitro ved hjælp af T7 RNA-polymerase i henhold til producentens anvisninger. Indstil 10 – 20 μL reaktioner (det anbefalede kit er i tabel over materialer).
   2. Rens in vitro transskriberet RNA ved hjælp af et RNA-rensningsudstyr. Indstil DNA-fordøjelsen i opløsning ved hjælp af DNase jeg følger producentens standard instruktioner, og elueres RNA i 50 μl vand. For at øge elutions udbyttet skal du lade vandet i kolonnen være 5 minutter før centrifugeringen.
      Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at overskride den maksimale binding kapacitet af kolonnerne (i sættet er nævnt i tabellen af materialer, kapacitet er op til 100 μg). Det forventede udbytte fra PCR-skabeloner 1 – 10 (1 KBP til 200 BP i længden) er 25 – 50 μg fra 10 μL in vitro-transkription reaktioner. Reaktioner kan skaleres op til at få en større bestand af Carrier molekyler.
3. Capping af in vitro transskriberet bære-RNA-molekyler
   1. Der tilberedes en capping blanding ved at kombinere 2 μL 10x capping buffer, 1 μL 10 mM GTP, 1 μL 2 mM SAM (frisk fortyndet) og 1 μL vaccinia-capping enzym pr. bære-RNA.
   2. Der blandes op til 10 μg af hvert bære molekyle i 15 μL total volumen og denaturering i 10 min ved 65 °C. Anbring på isen med det samme for at forhindre sekundær struktur dannelse.
   3. Bland det denaturerede bære-RNA med 5 μL capping-mix, og inkube i 1 time ved 37 °C.
   4. Rense udjævnede RNA-molekyler ved hjælp af et RNA-rensningsudstyr – Følg producentens oprydnings protokol. Elute-RNA i 30 μL vand. For at øge elutions udbyttet skal du lade vandet i kolonnen være 5 minutter før centrifugeringen.
      Bemærk: Måle koncentration ved hjælp af mikroskopet Spektrofotometer. Det forventede A260/A280-forhold er > 2, og A260/A230 er > 2. Bemærk, at for nogle RNA-prøver A260/A230 kan være mellem 1,3 – 2. Forventet udbytte ved brug af 10 μg ikke-ondet RNA er 9 – 10 μg udjævnet RNA.
4. Blandingen af det reducerede og ikke-reducerede luftfartsselskab forberedes ved at kombinere de i tabel 3beskrevne mængder. Bland godt ved at svige røret og måle koncentrationen ved hjælp af mikrovolumen Spektrofotometer.
   Bemærk: Hvis en højere koncentration af bæreren er nødvendig for at passe i omvendt transkription reaktion (se nedenfor), kan bære blandingen koncentreres ved hjælp af vakuum koncentratoren ved lav-medium temperatur (30-35 °C) indtil den ønskede endelige koncentration. Trin 2 – 14 er ændret fra den standard nAnT-iCAGE-protokol, der rapporteres af Murata et al.¹¹

2. omvendt transskription

1. Der kombineres 1 μL af RT-primer (2,5 mM TCT-N6 opløst i vand, for sekvens Se supplerende tabel 1), 10 ng af det totale RNA af interesse og 4.990 ng af bære blandingen (tabel 3) i 10 μl total volumen i en lav-bindende PCR-plade. Bland ved at svige røret.
   Bemærk: Hvis prøve-RNA er for fortyndet til omvendt transkription (se nedenfor), kombineres det med den passende mængde af bæreren, koncentrat ved hjælp af vakuum koncentratoren til 9 μL total volumen, og tilsæt 1 μL af RT primer. Tilføjelse af Carrier Earl, for at nå 5 μg RNA i alt forhindrer prøve tab.
2. Blandingen opvarmes fra trin 2,1 ved 65 °C i 5 minutter, og der anbringes straks på isen for at forhindre renaturering.
3. Forbered den omvendte transkription (RT) mix.
   1. For hver prøve kombineres 6,1 μL vand (RNase-og DNase-fri), 7,6 μL af 5x første strengs buffer, 1,9 μL af 0,1 M DTT, 1 μL 10 mM dNTPs, 7,6 μL trehalose/sorbitol mix (Se opskriften i Murata et al.¹¹) og 3,8 μl af den anbefalede omvendte transkriptase (Se < c 6 > tabel over materialer). Bland godt ved at flimke røret.
4. Der tilsættes 28 μL af RT-blandingen til PCR-røret med 10 μL RNA, bærer og RT-primer (total volumen 38 μL). Bland godt ved pipettering.
   Bemærk: Blandingen er meget viskøs på grund af trehalose/sorbitol. Blandes, indtil det er synligt homøst.
5. Der inkubeeres i en termisk variator ved hjælp af følgende program: 25 °c i 30 s, 50 °c i 60 min, og hold ved 4 °c.
6. Rensning af cDNA: RNA-hybrider med SPRI-magnetiske perler
   1. Der tilsættes 68,4 μL af de anbefalede RNAse-og DNase-frie SPRI-perler (Se tabel over materialer) til 38 ΜL af rt-blandingen (perler til prøveforhold 1,8:1). Bland godt ved pipettering og inkube i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
   2. Adskil perlerne på en magnetisk stander i 5 min. kassér supernatanten og vask perlerne to gange med 200 μL af 70% ethanol (frisk tilberedt).
      Bemærk: Ethanol tilsættes til perlerne uden at blande og mens røret er på den magnetiske stativ. Den tilføjede ethanol fjernes straks. Man bør være omhyggelig med ikke at tabe perler under vask, da det kan føre til tab af prøver.
   3. Mens røret stadig er på den magnetiske stativ, fjerne alle spor af ethanol. Dråber af ethanol kan fjernes og skubbes ud af røret ved hjælp af en P10 pipette. Lad ikke perlerne tørre.
   4. Der tilsættes 42 μL vand, der forvarmes ved 37 °C, til perlerne og eluere prøven ved at pipette op og ned 60x.
      Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at forårsage skumdannelse ved pipettering, da det kan medføre tab af perler (dvs. bundet prøve) i skummet.
   5. Der inkubeeres ved 37 °C i 5 min uden låget for at tillade fordampning af spormængder af ethanol.
   6. Adskil perlerne på en magnetisk stander i 5 min og Overfør supernatanten til en ny plade.
      Bemærk: Prøv at hente alle supernatanten for at forhindre prøve tab og samtidig undgå perle fremførsler. Brug P10 pipette til at få de sidste prøve dråber.

3. oxidation af

1. Der tilsættes 2 μL 1 M NaOAc (pH 4,5) til den rensede RT-reaktion. Bland ved pipettering tilsættes 2 μL 250 mM NaIO₄ og blandes igen.
2. Inkuieres på is i 45 min. dæk pladen med aluminiumsfolie for at undgå lys.
3. Der tilsættes 16 μL Tris-HCl (pH 8,5) til oxidations blandingen for at neutralisere pH-værdien.
4. Rense oxideret cDNA: RNA hybrider ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 108 μL af SPRI-perler til 60 μL af oxidations blandingen (1,8:1 perler til prøveforhold). Gentag rensningen som beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. Elueret med 42 μL vand forvarmet til 37 °C.
   Bemærk: Frisk tilberedning 250 mM NaIO₄ ved tilsætning af 18,7 μl vand pr. 1 mg naio₄. NaIO₄ er lysfølsom; Opbevar derfor opløsningen i et rør, der er dækket af aluminiumsfolie eller i et lysresistent rør.

4. biotinylering

1. Der tilsættes 4 μL 1 M NaOAc (pH 6,0) i røret, som indeholder den rensede oxiderede prøve, og blandes ved pipettering.
2. Der tilsættes 4 μl 10 mm biotin opløsning, blandes ved pipettering og inkurueres i 2 timer ved 23 °c i en termisk variator for at undgå lys.
   Bemærk: Tilbered biotin opløsningen ved at blande 50 mg biotin med 13,5 mL DMSO. Foretag engangs aliquoter og fryse ved-80 °C.
3. Rense biotinyleret cDNA: RNA hybrider ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 12 μL 2-propanol og blandes ved pipettering. Tilsæt 108 μL af SPRI-perler (1,8:1 perler til prøveforhold) og Gentag rensningen som beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. Elute med 42 μL vand forvarmet ved 37 °C.
   Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her, og prøver frosset ved-80 °C.

5. RNase I Dfordøjelse

1. Der tilberedes RNase I-blanding ved at blande 4,5 μL 10x RNase I-buffer med 0,5 μL RNase I (10 e/μL) pr. prøve. Bland ved pipettering.
2. Der tilsættes 5 μL af blandingen til hver renset prøve (45 μL i alt). Blandes ved pipettering og inkube i 30 min ved 37 °C.

6. fremstilling af Streptavidin perler

1. For hver prøve blandes 30 μL af streptavidin-perler gylle med 0,38 μL 20 mg/mL tRNA. Inkube på is i 30 min og bland hver 5 min ved at flimere røret.
   Bemærk: Opslæmning af streptavidin-perler godt før pipettering ved at flimle flasken. TRNA opløsningen skal tilberedes i henhold til Murata et al.¹¹
2. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 minutter. Fjern supernatanten.
3. Vask perlerne ved at resuspension i 15 μL buffer A. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 min. og Fjern supernatanten. Gentag vaskemaskinen og Fjern supernatanten.
4. Perlerne resuspenderes i 105 μL buffer A, og der tilsættes 0,19 μL 20 mg/mL tRNA. Bland godt ved pipettering.
   Bemærk: Perlerne skal tilberedes frisk før brug. Begynd forberedelsen af perlerne under RNase I fordøjelsen. For flere prøver forberede perlerne sammen i et enkelt rør.

7. cap-fældefangst

1. Prøve binding
   1. Der tilsættes 105 μL tilberedte streptavidin perler til 45 μL af den RNase I-behandlede prøve. Blandes godt ved pipettering og inkube ved 37 °C i 30 min. Bland ved pipettering hver 10 min.
   2. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 minutter. Fjern supernatanten.
2. Vask perler
   1. Tilsæt 150 μL vaskebuffer A, og resuspender perlerne ved at pipette. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 min. og Fjern supernatanten.
   2. Der tilsættes 150 μL af vaskebuffer B, og perlerne resuspenderes ved pipettering. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 min. og Fjern supernatanten.
   3. Der tilsættes 150 μL af vaskebuffer C, og perlerne resuspenderes ved pipettering. Adskil perlerne på magnet stativet i 2 – 3 min. og Fjern supernatanten.
      Bemærk: Buffere B og C skal forvarmes til 37 °C. Opskrifter til vaske buffere A, B og C er som beskrevet i Murata et al.¹¹
3. cDNA-frigivelse
   1. Forbered 1x RNase I buffer ved at blande 58,5 μL vand med 6,5 μL 10x RNase I buffer.
   2. Perlerne resuspenderes i 35 μL 1x RNase I-buffer. Der inkube ved 95 °C i 5 min og overføres direkte på is i 2 minutter for at forhindre gentilslutning af cDNA. Hold lågene under overførsel til is, da de kan affyre-off på grund af tryk ophobning.
   3. Adskil perlerne i 2 – 3 min på en magnetisk stander og Overfør supernatanten til en ny plade.
   4. Perlerne resuspenderes i 30 μL 1x RNase I-buffer. Perlerne adskilles på magnet stativet i 2 – 3 minutter, og supernatanten overføres til den tidligere indsamlede supernatanten (det totale volumen af elueret cDNA skal være ca. 65 μL).

8. RNA fjernelse af RNase H og RNase I fordøjelsen

1. Pr. prøve kombineres 2,4 μL vand, 0,5 μL 10x RNase I-buffer, 0,1 μL RNase H og 2 μL RNase I.
2. Der tilsættes 5 μL af blandingen til 65 μL af den frigivne cDNA-prøve og blandes ved pipettering. Der inkubeeres ved 37 °C i 15 min og holdes ved 4 °C.
3. Rense cDNA fra RNase fordøjelsesmix ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 126 μL af SPRI-perler til 70 μL nedbrydnings reaktion, og blandingen blandes ved pipettering. Følg rensningstrin som beskrevet for SPRI-perler rensning i 2.6.1 – 2.6.6. Elueret med 42 μL vand forvarmes ved 37 °C som beskrevet.
4. Klargør RNase I mix ved at kombinere 4,5 μL 10x RNase I-buffer og 0,5 μL RNase i.
5. Der tilsættes 5 μL RNase-mix til 40 μL af den oprensede cDNA-prøve. Blandes ved pipettering og inkube ved 37 °C i 30 min. hold ved 4 °C.
6. Rense prøven ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 81 μL af SPRI-perler til 45 μL nedbrydnings reaktion, og blandingen blandes ved pipettering. Følg rensningstrin som beskrevet for SPRI-perler rensning i 2.6.1 – 2.6.6. Elueret med 42 μL vand som beskrevet.

9. ligation af 5 ' linker

1. Koncentrer den rensede cDNA-prøve til 4 μL ved hjælp af vakuum koncentratoren. Hold temperaturen ved 30 – 35 °C. Test lydstyrken med en pipette. Hvis prøven er tørret til fuldstændighed, opløses ved tilsætning af 4 μL vand.
   Bemærk: Det er bedre at undgå tørring til fuldstændighed for at forhindre prøve tab.
2. Den koncentrerede prøve inkurueres ved 95 °C i 5 minutter og anbringes straks på is i 2 minutter for at forhindre renaturering. Hold lågene, mens du overfører rørene, da Lågene kan blive pop-off på grund af tryk ophobning.
3. Der inkurueres 4 μL af 2,5 μM 5 '-linkeren ved 55 °C i 5 minutter og anbringes straks på is i 2 minutter for at forhindre renaturering.
4. Der blandes 4 μL af 2,5 μM 5 '-linker med 4 μL af prøven.
   Bemærk: 5-linkeren skal forberedes i henhold til supplerende tabel 2, supplerende tabel 3, supplerende tabel 4og supplerende tabel 5. Fortynd 10 μM 5 '-linkeren til en 2,5 μM-koncentration ved hjælp af 100 mM NaCl før brug.
5. Der tilsættes 16 μL af ligations premix (Se tabel over materialer) til den blandede 5 ' linker og prøven og blandes godt ved pipettering. Der inkubeeres ved 16 °C i 16 timer.
6. Rense ligation mix ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Tilsæt 43,2 μL af SPRI-perler, og følg trin 2.6.1 – 2.6.6. Elute som beskrevet ved brug af 42 μL vand forvarmet ved 37 °C.
7. Rensning udført i trin 9,6 gentages ved tilsætning af 72 μL af SPRI-perler til den overførte supernatanten (1,8:1 perler til prøveforhold).
   Bemærk: 5 ' linkere indeholder stregkoder, som gør det muligt at samle op til otte prøver før sekventering (otte trinucleotid stregkoder er tilgængelige, som beskrevet i Murata et al.¹¹ og supplerende tabel 1).

10. ligation af 3 ' linker

1. Den rensede prøve koncentreres på 4 μL ved hjælp af vakuum koncentratoren som beskrevet i trin 9,1.
2. Den koncentrerede prøve inkurueres ved 95 °C i 5 minutter og anbringes straks på is i 2 minutter for at forhindre renaturering. Hold låg, mens du overfører rørene, da Lågene kan poppe ud på grund af tryk ophobning.
3. Der inkube 4 μL af 2,5 μM 3 '-linkeren ved 65 °C i 5 min og straks anbringes på is i 2 minutter for at forhindre renaturering.
4. Der tilsættes 4 μL af 2,5 μM 3 '-linkeren til 4 μL af den koncentrerede prøve.
5. Der tilsættes 16 μL af ligationpremix og blandes godt ved pipettering. Der inkubeeres ved 16 °C i 16 timer.
6. Rense ligation mix ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Tilsæt 43,2 μL af SPRI-perler, og følg trin 2.6.1 – 2.6.6. Elute som beskrevet ved brug af 42 μL vand forvarmet til 37 °C.
   Bemærk: Den 3 ' linker skal forberedes i henhold til supplerende tabel 6 og supplerende skema 7. Fortynd 10 μM 3 '-linkeren til en 2,5 μM-koncentration ved hjælp af 100 mM NaCl.

11. dephosphorylering

1. Klargør SAP-mixet ved at kombinere 4 μL vand, 5 μL 10x SAP-buffer og 1 μL SAP-enzym.
2. Der tilsættes 10 μL SAP-mix til den rensede ligerede prøve (total volumen 50 μL), og der inkueres i termocycleren ved hjælp af følgende program: 37 °C i 30 min, 65 °C i 15 minutter og hold ved 4 °C.

12. nedbrydning af 3 ' linker øvre strand ved hjælp af uracil specifikke excision enzym

1. Der tilsættes 2 μL uracil-specifikt excisions enzym (Se tabel over materialer) til den dephosphorylerede prøve, blandes ved pipettering og inkupieres i termo cycleren ved hjælp af følgende program: 37 °c i 30 min., 95 °c i 5 minutter og straks anbringes på is i 2 minutter til forhindre, at den fragmenterede øvre streng genudgløder.
2. Reaktionsblandingen renses ved tilsætning af 93,6 μL af SPRI-magnet perler til 52 μl-blandingen og blandes godt ved pipettering. Gentag rensningstrin 2.6.1 – 2.6.6. Elueret med 42 μL vand forvarmes ved 37 °C som beskrevet.

13. anden linje syntese

1. Forbered den anden streng syntese blanding (mængder udtrykkes pr. prøve) ved at kombinere 5 μL 10x DNA-polymerasereaktions buffer, 2 μL vand, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 50 μM nAnT-iCAGE anden streng primer (sekvens er i supplerende tabel 1) og 1 μl D NA exonuklease-mangelfuld polymerase (Se anbefalet polymerase i tabel over materialer).
2. Der tilsættes 10 μL af blandingen til den rensede prøve, og blandingen blandes godt ved pipettering (total volumen er 50 μL). Der inkubeeres i den termiske variator ved hjælp af følgende program: 95 °c i 5 min, 55 °c i 5 min, 72 °c i 30 minutter og hold ved 4 °c.

14. nedbrydning af anden strand syntese primer ved hjælp af Exonuklease I

1. Der tilsættes 1 μL Exonuklease I til den anden streng syntese blanding. Blandes godt ved pipettering og inkube ved 37 °C i 30 minutter efterfulgt af en bedrift ved 4 °C.
2. Rense dobbeltstrenget DNA ved at tilføje 91,8 μL af SPRI magnetiske perler til 51 μL af den Exonuklease I-behandlede prøve. Gentag rensnings trinene beskrevet i 2.6.1 – 2.6.6. og elueret med 42 μL vand forvarmet til 37 °C som beskrevet.
3. Prøven koncentreres ved hjælp af vakuum koncentratoren til 15 μL som beskrevet i trin 9,1.

15. kvalitets-og Kvantitetskontrol

1. Brug 1 μL af de koncentrerede prøver, og Kør en høj sensitivitets-DNA-chip på en DNA-kvalitets analysator. Forventet profil/mængde er vist i figur 3.

16. første runde af Carrier nedbrydning

1. Nedbrydnings blandingen tilberedes ved at kombinere 2 μL vand, 2 μL 10x begrænsnings enzym buffer, 1 μL i-SceI og 1 μL i-CeuI.
2. Der tilsættes 6 μL af nedbrydnings blandingen til 14 μL af den koncentrerede prøve, og blandingen blandes ved pipettering. Der inkubeeres ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af 20 minutters deaktivering ved 65 °C og hold ved 4 °C.
3. Rense nedbrydnings mix ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 5 μL vand for at forøge volumenet af nedbrydnings blandingen og tilsættes 45 μL af SPRI-perler (1,8:1 perler til prøveforhold). Gentagen rensning som beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. og elueret med 42 μL vand forvarmet til 37 °C.
4. Den eluede prøve koncentreres fra 42 μL til 20 μL af totalvolumenet som beskrevet i trin 9,1.

17. kontrol af nedbrydningsniveau og bestemmelse af antallet af PCR-Amplifikationscyklusser

1. Forbered qPCR mix til forstærkning af hele biblioteker (adapter mix). Kombiner 3,8 μL vand, 5 μL qPCR premix (2x), 0,1 μL af 10 μM adaptor_f1 primer (5 '-AATGATACGGCGACCACCGA-3 ') og 0,1 μL af 10 μM adaptor_r1 primer (5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ') for hver prøve (Se tabel over materialer til anbefalet qPCR premix).
2. Kombiner 9 μL qPCR-adapter blanding med 1 μL prøve fra trin 16,4, og bland godt ved pipettering.
3. Forbered qPCR mix til forstærkende DNA afledt af bæreren (Carrier mix). Kombiner 3,8 μL vand, 5 μL qPCR premix (2x), 0,1 μl 10 μM carrier_f1 primer (5 '-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3 ') og 0,1 μL 10 μM adaptor_r1 primer for hver prøve
4. Der kombineres 9 μL qPCR-bæremix med 1 μL af prøven fra trin 16,4 og blandes godt ved pipettering.
5. Indstil qPCR-program: 95 °C i 3 min (95 °C for 20 s, 60 °C for 20 s, 72 °C i 2 min) gentages 40x, efterfulgt af instrument specifik Denaturerings kurve (65 – 95 °C), og hold ved 4 °C.
   Bemærk: Forbered en negativ kontrol ved at udskifte prøven med vand.

18. PCR-forstærkning af målbiblioteket

1. Der tilberedes PCR-amplifikationsmix ved at kombinere 6 μL vand, 0,5 μL 10 μM adaptor_f1 primer, 0,5 μL 10 μM adaptor_r1 primer og 25 μL PCR-premix (2x). Blandes ved pipettering (Se tabel over materialer for den anbefalede PCR-premix).
2. Der tilsættes 32 μL af PCR-blandingen til 18 μL af prøven fra trin 16,4. Bland grundigt ved pipettering.
3. Indstil PCR-amplificeringen: 95 °C i 3 min, (98 °C for 20 s, 60 °C i 15 s, 72 °C i 2 min) 12-18 cyklusser, 72 °C i 2 min og hold ved 4 °C.
   Bemærk: Det nøjagtige antal PCR-cyklusser bestemmes af qPCR-resultater og svarer til den CT-værdi, der opnås med adapter primer-blandingen (antallet af PCR-cyklusser er lig med CT-værdien).
4. Den forstærkede prøve renses ved tilsætning af 90 μL af SPRI-magnet perler til 50 μL af den forstærkede prøve og blandes grundigt ved pipettering. Gentag de rensningstrin, der er beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. og elueres prøven med 42 μl vand som beskrevet.

19. anden runde af Carrier nedbrydning

1. Gentag trin 16.1 – 16.3.
2. Rense nedbrydnings mix ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Der tilsættes 10 μL vand til prøven for at øge volumen og blandes med 30 μL SPRI perler (1:1 perler til prøveforhold). Gentagen rensning som beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. og elueret med 42 μL vand forvarmes ved 37 °C som beskrevet.
3. Den eluede prøve koncentreres fra 42 μL til 30 μL total volumen.

20. valg af Biblioteks størrelse

1. 24 μL af SPRI-magnet perler blandes med 30 μL af prøven fra trin 19,3. (0,8:1 perler til prøveforhold). Gentag rensnings trinnene som beskrevet i trin 2.6.1 – 2.6.6. og elueres prøven i 42 μl vand som beskrevet.
2. Prøven koncentreres på ca. 14 μL som beskrevet i trin 9,1.

21. kvalitetskontrol

1. Vurdering af størrelsesfordeling
   1. Kør 1 μL af prøven på den højfølsomme DNA-chip. De forventede resultater fremgår af figur 4.
      Bemærk: Hvis fragmenter, der er kortere end 200 BP, er synlige (se eksempel i figur 4a, C), skal størrelses valget (trin 20.1 – 20.2) gentages, indtil de korte fragmenter fjernes (figur 4b, D). Normalt en ekstra runde af størrelse udvælgelse er nok. Hvis mængden af korte fragmenter er svær (som i figur 4c), skal forholdet mellem perler og prøve reduceres til 0,6:1.
2. Kvalitetskontrol af bære forringelser
   1. Gentag trin 17.1 – 17,5.
      Bemærk: Afhængigt af den koncentration af bibliotekerne, der anslås i HS DNA-chip Run (region analyse), skal prøverne fortyndes før qPCR. Der anvendes 0,5 μL af prøven for at undgå prøve tabet, og 100 – 500x fortyndes i vand (fortyndes til 1 – 20 PG/μL slutkoncentration). Forventet forskel mellem CT-værdier opnået med adapter og carrier mix er 5 – 10.
3. Kvantificering af bibliotek
   1. Forbered den arbejdende fortynding af lambda-DNA-standarden ved at blande 20 μL 100 mg/mL lambda DNA-standard med 980 μL 1x TE (Forbered ved fortynding af 20x TE i DNA-kvantificerings sættet). Fortynding af lambda-DNA kan opbevares ved-20 °C.
   2. Forbered lambda DNA-standard seriefortyndinger ved at blande den fortyndede lambda-standard og 1x TE i henhold til supplerende tabel 8.
      Bemærk: For højere nøjagtighed, anbefales det at tilføje 100 μL 1x TE buffer til alle rør og fjerne 1x TE volumen som krævet pr volumen af fortyndet lambda, der skal tilsættes. Brug ikke mere end 1 μL af biblioteket; Brug af 384 brønd plader til denne måling anbefales.

Representative Results

I denne rapport beskrives den komplette SLIC-CAGE-protokol til indhentning af sekvensklare biblioteker fra nanogram af udgangs totalt RNA-materiale (figur 1). For at opnå det syntetiske RNA-bæremix skal PCR-bære skabelonerne først forberedes og gel renses for at eliminere PCR-side produkter (figur 2a). Hver PCR skabelon (ti i alt) er produceret ved hjælp af en fælles fremad, men en anden reverse primer (tabel 2), hvilket fører til forskellige LÆNGDER af PCR skabelon for at muliggøre Størrelsesvariation af syntetiske RNA-bærere. Når de er renset, anvendes PCR-skabeloner til in vitro-transkription af bære molekyler. Der forventes et enkelt RNA-bære produkt, hvis skabelonerne er gel-renset (Se repræsentativ gel-analyse i figur 2b). Klargøring af bæreren kan opskaleres afhængigt af behovet, og når de tilberedes, blandes og fryses ved-80 °C til fremtidig brug.

Ved hjælp af den anbefalede minimale mængde af prøve total RNA (10 ng) kombineret med 16-18 cyklusser af PCR-forstærkning, kan der opnås høj kompleksitet SLIC-CAGE biblioteker. Antal PCR-cyklusser, der er nødvendige for at forstærke det endelige bibliotek, afhænger meget af mængden af det samlede input-RNA, der anvendes (det forventede antal cyklusser er vist i tabel 4).

Efter den første runde af nedbrydning, i qPCR resultater (trin 17), den forventede forskel mellem CT værdier opnået ved hjælp af adaptor_f1 eller carrier_f1 primer er 1-2, med CT-værdier opnået med adaptor_f1 lavere end med carrier_f1.

Fordelingen af fragment længder i det endelige bibliotek er mellem 200-2000 BP med den gennemsnitlige fragment størrelse af 700-900 BP (baseret på regionen analyse ved hjælp af Bioanalyzer software, figur 4b, D). Kortere fragmenter, som præsenteret i figur 4a, C, skal fjernes ved yderligere runder af størrelse-udelukkelse (trin 20-21). Disse korte fragmenter er PCR-forstærknings artefakter og ikke målbiblioteket. Bemærk, at kortere fragmenter klynge bedre på sekvensering flow celler og kan forårsage sekvensering problemer.

Den forventede mængde biblioteksmateriale, der er opnået pr. prøve, er mellem 5-50 ng. Betydeligt lavere beløb er vejledende for stikprøve tabet i løbet af protokollen. Hvis den opnåede lave mængde er tilstrækkelig til sekventering (2-3 ng af de poolede biblioteker er nødvendig), kan bibliotekerne være af mindre kompleksitet (se nedenfor).

Afhængigt af sekvente Rings maskinen skal mængden af det bibliotek, der indlæses på flowcellen, muligvis optimeres. Ved hjælp af en Illumina HiSeq 2500, lastning 8-12 pM SLIC-CAGE biblioteker giver i gennemsnit 150-200 millioner læser, med > 80% af læser passerer kvalitet score Q30 som tærskel.

De opnåede læsninger er derefter knyttet til reference genomet [for 50 BP læser, Bowtie2¹² kan bruges med standardparametre, der tillader nul mismatch per frø sekvens (22 BP)]. Forventet kortlægnings effektivitet afhænger af det totale RNA-input beløb og er vist i tabel 5. Den unikt kortlagte læser kan derefter indlæses i R grafisk og statistisk computing miljø¹³ og behandles ved hjælp af cager (bioconductor pakke¹⁴). Pakke vignetten er nem at følge og forklarer arbejdsprocessen og behandlingen af de tilknyttede data i detaljer. En nem visuel kontrol af bibliotekets kompleksitet er distributionen af promotor bredde, da biblioteker med lav kompleksitet vil have kunstigt smalle promotorer (figur 5a, SLIC-Cage-bibliotek afledt af 1 ng af det totale RNA, for detaljer se tidligere publikation¹⁰). Men selv den lave kompleksitet SLIC-CAGE biblioteker tillader identifikation af sande CTSSs, med større præcision end alternative metoder til lav/mellem-input TSS kortlægning (figur 5b, C).

Figur 1: Trin i SLIC-Cage-protokollen. Prøve-RNA blandes med RNA-bære blandingen for at opnå 5 μg total RNA-materiale. cDNA synteseres gennem omvendt transkription og hætten oxideres ved hjælp af natrium periodate. Oxidation tillader fastgørelse af biotin til hætten ved hjælp af biotin hydrazid. Biotin bliver knyttet til Mrna's 3 ′ ende, da det også oxideres ved hjælp af natrium periodate. For at eliminere biotin fra mRNA: cDNA-hybrider med ufuldstændigt syntetiseret cDNA og fra de 3 ′ ender af mRNA, er prøverne behandlet med RNase I. cDNA, der nåede 5 ′ enden af mRNA vælges derefter ved affinitet rensning på streptavidin magnetiske perler ( Cap-fældefangst). Efter frigivelse af cDNA, 5 ′-og 3 ′-linkers er ligeret. Bibliotekets molekyler, der stammer fra bæreren nedbrydes ved hjælp af I-SceI og I-CeuI homing endonukleaser og fragmenter fjernes ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Biblioteket er derefter PCR forstærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: repræsentativ gel-analyse af Carrier PCR-skabeloner og carrier in vitro-udskrifter. (A) Carrier PCR skabeloner før gel rensning: den første brønd indeholder 1 KBP markør, efterfulgt af Carrier PCR skabeloner 1, 1-10. B) transskriptioner af bærestof in vitro: den første brønd indeholder 1 KBP-mærket, efterfulgt af Trans skriptioner 1-10. Carrier transkriptioner blev denatureret ved opvarmning i 5 min ved 95 °C før lastning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: repræsentativ DNA-kvalitet (høj følsomhed DNA-chip) spor af SLIC-Cage før første runde af bæreren nedbrydning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: repræsentativ DNA-kvalitet (Højfølsom DNA-chip) spor af SLIC-Cage-biblioteker efter PCR-forstærkning. (A) SLIC-bur bibliotek, der kræver yderligere størrelse-valg til fjernelse af korte fragmenter. (B) SLIC-bur bibliotek efter størrelsesvalg ved hjælp af 0,6 x spri perler til prøveforhold. (C) SLIC-Cage bibliotek med lavere output beløb, der kræver størrelsesvalg til fjernelse af kort fragment. D) SPALTE-bur-bibliotek med lavere udgangstal efter størrelsesvalg med 0,6:1 spri-perler til prøveforhold. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Validering af SLIC-Cage-biblioteker. (A) fordeling af tagklyngens interkvantile bredder i SLIC-Cage-biblioteker fremstillet af 1,5 eller 10 ng af s. cerevisiae total-RNA og i NAnT-icage-biblioteket fremstillet af 5 μg s. cerevisiae total-RNA. En stor mængde smalle tagklynger i biblioteket med 1 ng SLIC-CAGE indikerer dens lave kompleksitet. B) Roc-kurver for CTSS-identifikation i S. cerevisiae SLIC-Cage-biblioteker. Alle S. cerevisiae NAnT-Icage CTSSs blev brugt som et sandt sæt. (C) Roc kurver for CTSS-identifikation i S. cerevisiae nanocage-biblioteker. Alle S. cerevisiae NAnT-Icage CTSSs blev brugt som et sandt sæt. Sammenligning af ROC-kurver viser, at SLIC-CAGE i høj grad overgår nanoCAGE i CTSS-identifikation. Data fra ArrayExpress E-MTAB-6519 blev brugt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: sekvens af bære syntetisk gen. I-SceI sites er fed og kursiseret i lilla, og I-CeuI anerkendelser sites er grønne. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Luftfartsselskab	omvendt primer 5 '-3 '		PCR produkt længde/BP
1	PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT		1034 af
2	PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC		966 af
3	PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG		889 af
4	PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT		821 af
5	PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC		744 af
6	PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA		676 af
7	PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC		599 af
8	PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC		531 af
9	PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG		454 af
10	PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA		386 af
	* Forward primer er den samme for alle Carrier skabeloner. Understreget er T7-promotoren. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA

Tabel 2: grundere til forstærkning af bære skabelonen. Forward primer er den samme for alle bære skabeloner. Understreget er T7-promotoren. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Ved hjælp af forskellige omvendte grundere, PCR skabeloner og dermed Carrier RNAs af forskellig længde er produceret.

Luftfartsselskab	Længde	ikke-reducerede/μg	øvre grænse/μg
1	1034 af	3,96 af	0,45 af
2	966 af	8,36 af	0,95 af
3	889 af	4,4 af	0,5 af
4	821 af	6,6 af	0,75 af
5	744 af	4,4 af	0,5 af
6	676 af	3,08 af	0,35 af
7	599 af	4,4 af	0,5 af
8	531 af	3,96 af	0,45 af
9	454 af	2,64 af	0,3 af
10	386 af	2,2 af	0,25 af

Tabel 3: RNA-bæremix. I alt 49 μg af bæreren mix 0,3-1 KBP: ikke-onapped = 44 μg, udjævnet = 5 μg.

Samlet RNA-input/ng	PCR-cyklusser
1 ng i	18
2 ng i	17
5 ng i	16
10 ng af	15-16 af
25 ng i	14-15 af
50 ng	13-15 af
100 ng	12-14 af

Tabel 4: Forventede antal PCR-cyklusser i afhængighed af total-RNA-input. Omtrentligt antal cyklusser er baseret på eksperimenter udført ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster og mus musculus total RNA.

Samlet RNA-input/ng	% samlet kort	% Entydigt tilknyttet	% af fragtmand
1 ng i	30	20-30 af	30
2 ng i	60 af	20-50 af	10
5 ng i	60-70 af	40-60 af	5-10 af
10 ng af	60-70 af	40-60 af	5-10 af
25 ng i	65-80 af	40-70 af	0-5 af
50 ng	65-80 af	40-70 af	0-3 af
100 ng	70-85 af	40-70 af	0-2 af

Tabel 5: forventet kortlægnings effektivitet og afhængighed af det totale RNA-input beløb. Omtrentlige tal er præsenteret og baseret på eksperimenter udført ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae og mus musculus total RNA.

Discussion

For vellykkede SLIC-CAGE bibliotek præparater, er det afgørende at bruge lav-bindende tips og rør for at forhindre prøve tab på grund af prøve adsorption. I alle trin, der involverer hentning af supernatanten, anbefales det at inddrive den entiresample volumen. Da protokollen har flere trin, vil kontinuerlig stikprøve tab føre til mislykkede biblioteker.

Hvis CAGE (nAnT-iCAGE) ikke er blevet udført rutinemæssigt, er det bedst at teste SLIC-CAGE med forskellige input mængder (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) af samme totale RNA-prøve og Sammenlign med nAnT-iCAGE-biblioteker, der tilberedes ved hjælp af 5 μg total RNA. Hvis nAnT-iCAGE biblioteket ikke lykkes (mindre end 0,5-1 ng af DNA-biblioteket opnået pr. prøve), SLIC-CAGE er usandsynligt, at arbejde, og prøve tab skal minimeres.

Et vigtigt skridt til at sikre høj kvalitet biblioteker blottet for ikke-under brudt RNA eller rRNA er Cap-fældefangst beskrevet i afsnit 7. Det er meget vigtigt, at streptavidin perler resuspenderes grundigt i vaske buffere, og at vaske bufferne fjernes, før du fortsætter til næste vask trin eller eluering af cDNA.

Hvis resultaterne fra qPCR efter den første runde af bære nedbrydning ikke viser nogen forskel mellem brugen af adaptor_f1 og carrier_f1-primere, anbefales det stadig at fortsætte protokollen. Hvis forskellen i CT-værdier efter anden runde af bære nedbrydning er mindre end fem, anbefales en tredje runde af bære nedbrydning. Vi har aldrig fundet en tredje runde af nedbrydning nødvendig, og hvis det sker, anbefales det at erstatte de homing endonuklease bestande.

Yderligere runder af PCR-forstærkning kan føjes til protokollen, hvis det endelige antal af det opnåede bibliotek ikke er nok til sekventering. PCR-forstærkning kan derefter indstilles med et minimalt antal forstærknings cyklusser, der er nødvendige for at give tilstrækkeligt materiale til sekvensering, under hensyntagen til prøve tabet, der ikke kan undgås i størrelses valget. Rensning eller størrelsesvalg ved hjælp af SPRI-magnetiske perler skal derefter udføres, indtil alle små (< 200 BP) fragmenter fjernes (hvis det er nødvendigt, skal du bruge 0,6:1 perler til prøveforhold), og biblioteket bør kvantificeres ved hjælp af Picogreen.

Biblioteker kan sekvenseres i single-end eller parret-end-tilstand. Ved hjælp af sekvensering af parrings-end-sekvenser kan der indhentes oplysninger om transskription isoformer. Desuden, som reverse transkription udføres ved hjælp af en tilfældig primer (TCT-N₆, N₆ at være en tilfældig hexamer), oplysninger fra sekvenseret 3 '-end kan bruges som unikke MOLEKYLÆRE identifikatorer (Umi) at kollapse PCR dubletter. Da der anvendes et moderat antal PCR-amplifikationscyklusser (op til 18), er det tidligere blevet konstateret, at brugen af UMIs er unødvendig.

Da kernen i protokollen er baseret på nAnT-iCAGE¹¹, SLIC-Cage bruger otte stregkoder. Derfor understøttes multiplexing af mere end otte prøver ikke i øjeblikket. Desuden er både SLIC-CAGE og nAnT-iCAGE ikke egnet til at opfange RNAs kortere end 200 BP, da protokollerne er designet til at fjerne linkers og PCR artefakter gennem size-udelukkelse med AMPure XP perler.

SLIC-CAGE er den eneste objektive lav-input single-nucleotid opløsning metode til kortlægning transskription start sites ved hjælp af nanogram af det samlede RNA materiale. Alternative metoder er afhængige af den omvendte transkriptases skabelon koblings aktivitet til stregkode udjævnet RNA i stedet for Cap-fældefangst (f. eks. er NanoCAGE¹⁵ og nanop16). På grund af skabelon Skift udviser disse metoder sekvens specifikke bias i Tsss-detektion, hvilket fører til et stigende antal falske positive tss'er og et fald i antallet af sande Tsss^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	59304-100ML-F	Used in RNAclean XP purification.
3' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881	Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit	Beckman Coulter	A63987	Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips	Axygen (available through Corning)	PCR-0208-CP-C	Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps	Axygen (available through Corning)	PCR-02CP-C	Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube	Axygen (available through Corning)	MCT-150-L-C	Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate	Axygen (available through Corning)	PCR-96-C	Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits	Agilent		To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide	Vector laboratories	SP-1100	Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer	NEB		Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase	NEB	M0259S	Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix	Takara	6023	Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	18427013	dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin	Invitrogen	65305	Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet	ThermoFisher Scientific	12321D	Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	ThermoFisher Scientific	12027	Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	51976-500ML-F	Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli)	NEB	M0293S	Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS	NEB	B7025S	agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S	Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus			purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu	NEB	R0699S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI	NEB	R0694S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK2601	PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK4600	qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL)	Gilson		Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader			For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water	ThermoFisher Scientific	AM9937	Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler			incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F530S	DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine			determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	ThermoFisher Scientific	P11495	Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	NEB	N0551S	DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N0550S	DNA ladder
Ribonuclease H	Takara	2150A	Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M4261	Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free	VWR	AAJ63669-AK	Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free			Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate	Sigma-Aldrich	311448-100G	Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719390-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719463-1000EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719412-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719447-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator			concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044	Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution			Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5			1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL)			tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose	ThermoFisher Scientific	16520050	Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)	Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)	78390500UN
USER Enzyme	NEB	M5505S	Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System	NEB	M2080S	Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.