유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 단일 뉴클레오티드 분해능에서 RNA 폴리머라제 II 전사 시작 부위를 포착하기 위해 mRNA 5’ends의 게놈 전반의 정량적 매핑을 위한 방법이다. 이 작품은 나노그램 양의 총 RNA를 사용하여 고품질 라이브러리의 생성을 위한 낮은 입력(SLIC-CAGE) 프로토콜을 설명합니다.
유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 RNA 폴리머라제 II 전사 개시 부위(TSSs)의 단일 뉴클레오티드 분해능 검출에 사용되는 방법이다. TSS의 정확한 검출은 핵심 프로모터의 식별 및 발견을 향상시킵니다. 또한, 활성 인핸서는 양방향 전사 개시의 서명을 통해 검출 될 수있다. 여기서 설명된 초저 입력 반송파-CAGE(SLIC-CAGE)를 수행하기 위한 프로토콜이 있다. 이러한 CAGE 프로토콜의 SLIC 적응은 관심 있는 샘플에 추가되는 시험관 내 전사 RNA 담체 혼합물을 사용하여 RNA 양을 인위적으로 증가시킴으로써 RNA 손실을 최소화하여 총 나노그램 양에서 라이브러리 준비를 가능하게 합니다. RNA (즉, 수천 개의 세포). 캐리어는 예상된 DNA 라이브러리 단편 길이 분포를 모방하여 균질한 담체의 풍부에 의해 야기될 수 있는 편견을 제거합니다. 프로토콜의 마지막 단계에서, 반송파는 호밍 엔도누클리스를 통해 분해를 통해 제거되고 표적 라이브러리는 증폭된다. 표적 샘플 라이브러리는 호밍 엔도뉴클로스 인식 사이트가 길기 때문에(18~27bp 사이) 진핵 게놈에서 존재할 확률이 매우 낮기 때문에 분해로부터 보호됩니다. 최종 결과는 차세대 염기서열 분석이 준비된 DNA 라이브러리입니다. 시퀀싱까지 프로토콜의 모든 단계는 6일 이내에 완료할 수 있습니다. 캐리어 준비는 하루 종일 작동해야합니다. 그러나, 대량으로 제조될 수 있고 -80°C에서 냉동 보관할 수 있다. 일단 서열화되면, 판독은 게놈 전체 의 단일 뉴클레오티드 분해능 TSSs를 얻기 위하여 가공될 수 있습니다. TSSs는 유전자 규칙에 대한 통찰력을 제공하는 코어 프로모터 또는 증강인자 발견을 위해 사용될 수 있습니다. 프로모터에 집계되면 데이터는 5’중심 식 프로파일링에도 사용할 수 있습니다.
유전자 발현(CAGE)의 캡 분석은 RNA 폴리머라제 II 전사 개시 부위(TSSs)의 단일 뉴클레오티드 분해능 게놈 전체 매핑에 사용되는 방법1. 정량적 특성으로 인해 5’엔드 중심 식 프로파일링도 가능합니다. TSSs를 둘러싼 영역(대략 40 bp 상류 및 다운스트림)은 핵심 프로모터이며 RNA 폴리머라제 II및 일반 전사 인자 결합이 결합되는 물리적 위치를 나타낸다(이전에 검토된 2,3). TSS의 정확한 위치에 대한 정보는 코어 프로모터 발견 및 프로모터 역학 모니터링에 사용될 수 있습니다. 또한, 액티브 인핸서가 양방향 전사의 서명을 나타내기 때문에, CAGE 데이터는 또한 인핸서 역학4의 증강 발견 및 모니터링에 사용될 수 있다. CAGE 방법론은 최근 인코드 5, modENCODE6및 FANTOM 프로젝트7과 같은 중요한 연구 프로젝트에서광범위한 응용 프로그램 및 사용으로 인해 인기가 높아졌습니다. 또한, TSS 정보는 또한 질병 특이적 TSS가 진단 목적으로 사용될 수 있기 때문에 건강하고 병이 있는 조직을 구별하는 데 중요한 것으로 입증되고있다8.
TSS 매핑을 위한 여러 가지 방법(CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, 올리고 캡핑)을 사용할 수 있지만, 우리와 다른 사람들은 최근 CAGE가 거짓 긍정 수가 가장 적은 진정한 TSS를 캡처하는 가장 편견없는 방법임을 보여주었습니다9 , 10. 최근 CAGE 프로토콜, nAnT-iCAGE11은제한 효소를 사용하여 짧은 태그로 조각을 절단하는 것을 피하고 PCR 증폭을 사용하지 않기 때문에 TSS 프로파일링을위한 가장 편견없는 프로토콜입니다. nAnT-iCAGE 프로토콜의 한계는 다량의 시작 물질(예를 들어, 각 샘플에 대해 총 RNA의 5 μg)에 대한 요구사항이다. 구체적인 생물학적으로 관련된 질문에 대답하기 위해, 그러한 다량의 시작 물질(예를 들어, FACS 분류 세포 또는 초기 배아 단계)을 얻는 것은 종종 불가능하다. 마지막으로, nAnT-iCAGE가 성공하면 각 샘플에서 DNA 라이브러리 물질의 1-2 ng만 사용할 수 있어 달성 가능한 시퀀싱 깊이를 제한합니다.
총 RNA의 나노그램만을 사용하여 TSS 프로파일링을 가능하게 하기 위해, 우리는 최근에 초저 입력 캐리어-CAGE 10(SLIC-CAGE, 그림1)을 개발했습니다. SLIC-CAGE는 높은 복잡성 라이브러리를 얻기 위해 총 RNA의 10ng만 필요로 합니다. 당사의 프로토콜은 총 5 μg의 RNA 물질을 달성하기 위해 관심 있는 RNA에 추가된 신중하게 설계된 합성 RNA 담체에 의존합니다. 합성 담체는 초과균질 분자에 의해 야기될 수 있는 잠재적인 편견을 피하기 위하여 길이 분포에 있는 표적 DNA 라이브러리를 모방합니다. 담체의 서열은 대장균 류실-tRNA 합성 유전자의 서열에 기초한다(표 1)는 두 가지 이유로. 첫째, 최종 라이브러리에 있는 운반체의 남은 것은, 순서가 있더라도, 진핵 게놈에 지도되지 않을 것입니다. 둘째, 대장균은 중증 종이므로, 하우스키핑 유전자는 SLIC-CAGE에 적합한 온도 범위에 최적화되어 있습니다. 담체 서열은 또한 운반체 RNA 분자로부터 유래된 DNA의 특이적 분해를 허용하기 위해 호밍 엔도뉴클로스 인식 부위와 함께 내장된다. 호밍 엔도뉴클레아제 인식 사이트가 길기 때문에 대상, 샘플 유래 라이브러리는 그대로 유지됩니다(I-CeuI = 27 bp; I-SceI = 18 bp) 및 진핵 게놈에서 통계적으로 발견될 가능성이 낮다. 캐리어의 특정 분해 및 크기 배제에 의한 단편의 제거 후, 대상 라이브러리는 PCR 증폭 및 차세대 시퀀싱에 대한 준비된다. 시작 RNA 양 (1-100 ng)에 따라, 13-18 PCR 증폭 주기 사이 요구 될 것으로 예상 된다. 각 샘플당 DNA의 최종 양은 5-50 ng 사이, 매우 깊은 시퀀싱을 위한 충분한 물자를 산출합니다. 총 RNA의 단지 1-2 ng를 사용하는 경우에, 진정한 TSS는 검출될 수 있습니다; 그러나 라이브러리의 복잡성은 낮을 것으로 예상됩니다. 마지막으로 SLIC-CAGE는 nAnT-iCAGE 프로토콜11을기반으로 하므로 시퀀싱 전에 최대 8개의 샘플을 다중화할 수 있습니다.
성공적인 SLIC-CAGE 라이브러리 준비의 경우, 시료 흡착으로 인한 시료 손실을 방지하기 위해 낮은 결합 팁과 튜브를 사용하는 것이 중요합니다. 상급물의 검색과 관련된 모든 단계에서 전체 샘플 볼륨을 복구하는 것이 좋습니다. 프로토콜에 여러 단계가 있기 때문에 연속 샘플 손실은 실패한 라이브러리로 이어질 수 있습니다.
CAGE(nAnT-iCAGE)가 일상적으로 수행되지 않은 경우, 동일한 총 RNA 샘플의 다른 입력 량(10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng)으로 SLIC-CAGE를 테스트하고 총 RNA 5 μg를 사용하여 제조된 nAnT-iCAGE 라이브러리와 비교하는 것이 가장 좋습니다. nAnT-iCAGE 라이브러리가 실패하는 경우(샘플당 얻은 DNA 라이브러리의 0.5-1 ng 미만), SLIC-CAGE는 작동하지 않을 수 있으며 샘플 손실을 최소화해야 합니다.
상한 되지 않은 RNA 또는 rRNA가 없는 고품질 라이브러리를 보장하는 중요한 단계는 섹션 7에 설명된 캡 트래핑입니다. 스트렙타비딘 비드는 세척 버퍼에 완전히 다시 매달려 있고 세척 버퍼가 다음 세척 단계 또는 cDNA 용출을 계속하기 전에 제거되는 것이 매우 중요합니다.
캐리어 성능 저하의 첫 번째 라운드 후 qPCR의 결과가 adaptor_f1 및 carrier_f1 프라이머의 사용 간에 차이가 없는 경우 프로토콜을 계속 사용하는 것이 좋습니다. 캐리어 저하의 두 번째 라운드 후, Ct 값의 차이가 5 보다 작은 경우, 캐리어 저하의 세 번째 라운드를 권장 합니다. 우리는 필요한 저하의 세 번째 라운드를 발견 한 적이 없다, 그리고 발생하는 경우, 호밍 endonuclease 주식을 교체하는 것이 좋습니다.
얻어진 라이브러리의 최종 양이 시퀀싱을 위해 충분하지 않은 경우 PCR 증폭의 추가 라운드가 프로토콜에 추가될 수 있다. PCR 증폭은 크기 선택에서 피할 수 없는 샘플 손실을 고려하여 시퀀싱에 충분한 재료를 산출하는 데 필요한 최소한의 증폭 주기로 설정할 수 있습니다. SPRI 자기 비드를 사용하여 정화 또는 크기 선택은 모든 작은 (&200 bp) 조각이 제거 될 때까지 수행되어야합니다 (필요한 경우, 샘플 비율에 0.6 :1 구슬을 사용), 라이브러리는 Picogreen을 사용하여 정량화되어야한다.
라이브러리는 단일 엔드 또는 페어링 된 엔드 모드에서 시퀀스할 수 있습니다. 페어링된 말단 시퀀싱을 사용하여 전사체 이소폼에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 또한, 역전사가 랜덤 프라이머(TCT-N 6,N6 임의 의 hexamer인)를 사용하여 수행됨에 따라, 서열화된 3′-말단으로부터의 정보는 PCR 중복을 붕괴시키는 고유 분자 식별자(UMI)로서 사용될 수 있다. 적당한 수의 PCR 증폭 주기가 사용됨에 따라(최대 18), UMI의 사용은 이전에 불필요한 것으로 밝혀졌다.
프로토콜의 핵심은 nAnT-iCAGE11에의존하기 때문에 SLIC-CAGE는 8개의 바코드를 사용합니다. 따라서 8개 이상의 샘플을 다중화하는 것은 현재 지원되지 않습니다. 또한 SLIC-CAGE와 nAnT-iCAGE는 AMPure XP 비드를 사용하여 크기 제외를 통해 링커와 PCR 아티팩트를 제거하도록 설계되었기 때문에 200bp 미만의 RNA를 캡처하는 데 적합하지 않습니다.
SLIC-CAGE는 전체 RNA 물질의 나노그램을 사용하여 전사 개시 부위를 매핑하는 유일한 편견없는 저입력 단일 뉴클레오티드 분해 방법이다. 대안적인 방법은 캡 트래핑 대신에 역전사의 템플릿 스위칭 활성을 바코드 캡핑 RNA(예를 들어, NanoCAGE15 및 NanoPARE16)에의존한다. 템플릿 스위칭으로 인해 이러한 메서드는 TSS 검출에서 시퀀스 별 편향을 나타내며, 거짓 양성 TSS의 수가 증가하고 실제 TSS9,10의수가 감소합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 웰컴 트러스트 보조금에 의해 지원되었다 (106954) B. L. 및 의료 연구위원회에 수여 (MRC) 핵심 자금 (MC-A652-5QA10). N. C.는 EMBO 장기 펠로우십(EMBO ALTF 1279-2016)의 지원을 받았습니다. E. P. 의학 연구 위원회 영국에 의해 지원 되었다; B. L. 의료 연구 위원회 영국에 의해 지원 되었다 (MC UP 1102/1).
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 59304-100ML-F | Used in RNAclean XP purification. |
3' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
5' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
Agencourt AMPure XP, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Purification of DNA |
Agencourt RNAClean XP Kit | Beckman Coulter | A63987 | Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps. |
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips | Axygen (available through Corning) | PCR-0208-CP-C | Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes). |
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps | Axygen (available through Corning) | PCR-02CP-C | Caps for PCR plates. |
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube | Axygen (available through Corning) | MCT-150-L-C | Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration. |
Axygen 96 well no skirt PCR microplate | Axygen (available through Corning) | PCR-96-C | Low-binding PCR plates – have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples |
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits | Agilent | To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used) | |
Biotin (Long Arm) Hydrazide | Vector laboratories | SP-1100 | Biotinylation/tagging |
Cutsmart buffer | NEB | Restriction enzyme buffer | |
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | NEB | M0259S | Second strand synthesis |
DNA Ligation Kit, Mighty Mix | Takara | 6023 | Used for 5' and 3'-linker ligation |
dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR) |
Dynabeads M-270 Streptavidin | Invitrogen | 65305 | Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used. |
DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12321D | Magnetic stand for 1.5 ml tubes – used to prepare Streptavidin beads. |
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | ThermoFisher Scientific | 12027 | Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) – used with cut plates to contain 2 x 8 wells. |
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 51976-500ML-F | Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used. |
Exonuclease I (E. coli) | NEB | M0293S | Leftover primer degradation |
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS | NEB | B7025S | agarose gel loading dye |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | Kit for carrier in vitro transcription |
Horizontal electrophoresis apparatus | purification of carrier DNA templates from agarose gels | ||
I-Ceu | NEB | R0699S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
I-SceI | NEB | R0694S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x) | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK2601 | PCR mix for target library amplification |
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK4600 | qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles |
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µl, 1-20 µl, 20-200 µ) | Gilson | Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss. | |
Microplate reader | For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste. | ||
nuclease free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | Or any nuclease (DNase and RNase) free water |
PCR thermal cycler | incubation steps and PCR amplficication | ||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F530S | DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase) |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Purification of carrier PCR templates from agarose gels. |
qPCR machine | determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation | ||
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher Scientific | P11495 | Used to measure final library concentration – recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit. |
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | NEB | N0551S | DNA ladder |
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N0550S | DNA ladder |
Ribonuclease H | Takara | 2150A | Digestion of RNA after cap-trapping. |
RNase ONE Ribonuclease | Promega | M4261 | Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping |
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free | VWR | AAJ63669-AK | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution |
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution | ||
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | Oxidation of vicinal diols |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719390-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719463-1000EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719412-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719447-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
SpeedVac Vacuum Concentrator | concentrating samples in various steps to lower volume | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | Used for reverse transcription (1st CAGE step) |
Trehalose/sorbitol solution | Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5 | 1 M solution, DNase and RNase free | ||
tRNA (20 mg/mL) | tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
UltraPure Low Melting Point Agarose | ThermoFisher Scientific | 16520050 | Or any suitable pure low-melt agarose. |
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) | Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific) | 78390500UN | |
USER Enzyme | NEB | M5505S | Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme |
Vaccinia Capping System | NEB | M2080S | Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules |
Wash buffer A | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Wash buffer B | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Wash buffer C | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. |