मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए BSelex विधि एकल सेल पीसीआर और क्लोनिंग के साथ प्रवाह साइटोमेट्री को जोड़ती है।
मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची संभावित चिकित्सीय एंटीबॉडी और उपयोगी biomarkers के एक बड़े पैमाने पर अप्रयुक्त स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि वर्तमान अभिकलनीय विधियाँ, जैसे कि अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS), अनुक्रम स्तर पर एंटीबॉडी प्रदर्शनों के संग्रह पर डेटा के भारी सेट उपज, कार्यात्मक डेटा की पहचान करने के लिए जो दृश्यों एक विशेष प्रतिजन या सेट के लिए प्रासंगिक हैं की आवश्यकता है एंटीजन. यहां, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से मानव रक्त दाता से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि परिपक्व बी कोशिकाओं के एक प्रारंभिक संवर्धन का इस्तेमाल करता है और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से आईजीजी स्मृति बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए phenotypic सेल मार्करों और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन का एक संयोजन की आवश्यकता है। भारी और प्रकाश श्रृंखला चर क्षेत्रों तो क्लोन और फिर से जांच कर रहे हैं. हालांकि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, इस विधि प्रवाह साइटोमेट्री का लाभ लेता है बी कोशिकाओं के लाखों पूछताछ और एक एकल सेल से युग्मित भारी और प्रकाश श्रृंखला अनुक्रम देता है अभिव्यक्ति और विशिष्टता की पुष्टि के लिए तैयार प्रारूप में. इस विधि के साथ बरामद एंटीबॉडी चिकित्सकीय क्षमता के लिए विचार किया जा सकता है, लेकिन यह भी विशिष्टता और bioinformatic दृष्टिकोण के साथ समारोह के लिए व्यक्तियों के भीतर बी सेल प्रदर्शनों का आकलन लिंक कर सकते हैं.
एंटीबॉडी चिकित्सकीय अणुओं की एक बढ़ती हुई वर्ग हैं, और किसी भी मानव में मौजूदा बी सेल प्रदर्शनों की सूची इस तरह के एंटीबॉडी का एक संभावित स्रोत है। जब एक मानव दाता से बरामद, वे कोई अनुकूलन या “मानवीकरण” की आवश्यकता होती है, कदम है कि अन्य पशु प्रणालियों में उत्पन्न एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हैं. मानव एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें बी सेल सक्रियण और प्रसार1, ईबीवी रूपांतरण2,3, और हाइब्रिडोमा सेल लाइनों की पीढ़ी 4 के माध्यम से अमरीकरण शामिल है ,5. हालांकि, इन तरीकों के सभी स्क्रीन और प्रतिजन विशेष एंटीबॉडी ठीक करने के लिए व्यापक सेल संस्कृति की आवश्यकता है. मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची के बारे में जानकारी बहुत अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकी के विकास के साथ विस्तार किया गया है, दाता के नमूनों में मौजूद अलग-अलग दृश्यों की भारी मात्रा की पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, क्योंकि एनजीएस मौजूद सभी दृश्यों का एक नास्तिक दृश्य देता है, यह एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए अनुमति नहीं देता है, विशेष रूप से दुर्लभ या कम आवृत्ति एंटीबॉडी के मामले में।
“BSelex” विधि का उद्देश्य मानव दाताओं में परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के परिसंचरण से प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करना है, और आगे के विश्लेषण के लिए इन एंटीबॉडी के दृश्यों को अलग करना और पुनर्प्राप्त करना है। इस विधि के प्रवाह cytometry और सेल छँटाई का इस्तेमाल बी सेल रिसेप्टर (BCR) स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त का लाभ लेने के लिए. अधिक कम-थ्रूपुट आण्विक जीव विज्ञान विधियों को शुरू करने से पहले प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्रतिजन-विशिष्टता के लिए लाखों बी कोशिकाओं की जांच की जा सकती है। जोड़ी भारी और प्रकाश श्रृंखला पहचान सबसे NGS तरीकों, जो थोक में सेल दृश्यों का विश्लेषण में संभव नहीं है. विधि में हम यहाँ का वर्णन, कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से अलग कर रहे हैं, और दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्यों की बनती वसूली संभव है, जो प्रत्यक्ष क्लोनिंग और पूर्ण आईजीजी की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है.
यहाँ प्रस्तुत विधि प्रवाह साइटोमेट्री और एकल कोशिका क्लोनिंग को जोड़ती है, और हम यहाँ का वर्णन तरीकों हम पहले टिलर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित तरीकों के आधार पर11. उनके काम में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की वसूली और क्लोनिंग का वर्णन किया गया है ताकि व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर मनुष्यों में बी सेल प्रदर्शनों का अध्ययन किया जा सके। हम उनकी प्रक्रिया के प्रमुख घटकों को अनुकूलित किया है स्मृति बी कोशिकाओं की आबादी से प्रतिजन-विशिष्ट monoclonal एंटीबॉडी की वसूली की अनुमति देने के लिए, बहु कदम प्रवर्धन प्राइमर रणनीति सहित. प्रमुख संशोधन लेबल प्रतिजन “बैट” के अलावा है. अतिरिक्त अनुकूलन प्रकाशित प्रोटोकॉल के लिए किया गया है, सहित (लेकिन सीमित नहीं) एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोनिंग वेक्टर रीढ़ को संशोधित करने, germline प्रदर्शनों के अतिरिक्त प्राइमर कवरेज (दोनों नेता अनुक्रम और रूपरेखा 1), उच्च अभिव्यक्ति के लिए निलंबन HEK293 कोशिकाओं के transfection, और पीसीआर प्रवर्धन के दौरान उच्च निष्ठा polymerases का उपयोग करें।
यहाँ वर्णित विधियों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रवाह साइटोमेट्री और एकल सेल क्लोनिंग के बीच संक्रमण के पास हैं। सबसे पहले, प्लेट में हल एकल कोशिकाओं की उचित नियुक्ति आवश्यक है. सॉर्टर पर ड्रॉप-देरी सही तरीके से सेट करना एक महत्वपूर्ण चरण है. पर्यावरण कारकों, जैसे कम आर्द्रता, भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, के रूप में हम अपनी वसूली क्षमता काफी गिरावट पाया है जब तक एक स्थिर बंदूक लक्ष्य सॉर्ट प्लेटों पर प्रयोग किया जाता है. सेल प्लेसमेंट के बाद, प्लेटें यह सुनिश्चित करने के लिए centrifuged हैं कोशिकाओं कुओं के नीचे बफर के 10 डिग्री एल से संपर्क किया है. इन उपायों के सभी आणविक जीव विज्ञान भाग के लिए महत्वपूर्ण हैं सफल होने के लिए. यदि शर्तें किसी एकल सेल की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए उप-अनुकूल हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन भी $-actin का उपयोग मुश्किल हो सकता है। प्रस्तुत विधि की ताकत कोशिकाओं के लाखों लोगों से पूछताछ करने की क्षमता है और केवल पसंद के प्रतिजन के खिलाफ प्रतिजन प्रतिक्रिया मानदंड से मेल खाते हैं कि लोगों को सॉर्ट. यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत की आवश्यकता के रूप में संभव के रूप में उच्च हो, जो छँटाई से पहले चारा सांद्रता के अनुकूलन द्वारा किया जाता है. दोहरी लेबल चारा झूठी सकारात्मक कोशिकाओं की वसूली को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो हो सकता है अगर फ्लोरोफोर्स में से एक उच्च पृष्ठभूमि है. एक से अधिक प्रतिजन चारा का उपयोग संकेत कर सकते हैं: शोर अनुकूलन और अधिक कठिन है, लेकिन एक साथ कई पेप्टाइड्स पूछताछ करने की क्षमता इस विधि का एक और लाभ है.
जब पुनर्प्राप्ति क्षमता कम होती है, तो यह पुष्टि करने के लिए नेस्टेड जेड-एक्टिन प्राइमर का एक सेट उपयोग किया जाता है कि टेम्पलेट cDNA मौजूद है. इस दृष्टिकोण के लिए दोष यह है कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ अच्छी तरह से या रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में कोई सेल मौजूद नहीं था विफल रहा है, समस्या निवारण मुश्किल बना रही है. कभी-कभी विपरीत हो जाएगा और क्षमता अपेक्षा से अधिक होती है। भारी श्रृंखला के लिए विशिष्ट वसूली के बीच है 30-45% और प्रकाश श्रृंखला अधिक हैं, के बीच 40-60%. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (चरण मैं और द्वितीय) एक एकल सेल से बढ़ाना करने के लिए 50 चक्र का उपयोग करता है। कुल चक्र की उच्च संख्या भी इस विधि संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है. amplicons के अनुक्रम विश्लेषण एक संदूषक शुरू किया गया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक असामान्य रूप से उच्च वसूली दर वैध रूप से प्राप्त किया गया है.
पसंद के एक प्रतिजन के खिलाफ देशी मानव एंटीबॉडी ठीक करने के लिए इस विधि की उपयोगिता कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, केवल घुलनशील प्रोटीन है कि लेबल किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है “बैट” प्रवाह cytometry के लिए. प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत प्रकार के लिए, हम ताओ प्रोटीन से संश्लेषित ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स की एक श्रृंखला का इस्तेमाल किया, पूरे प्रोटीन का उपयोग कर के बाद से मुश्किल साबित कर दिया. रैखिक पेप्टाइड्स का उपयोग इष्टतम नहीं है, क्योंकि यह गैर रेखीय या संरचनात्मक एपिटोप के खिलाफ एंटीबॉडी की पहचान को सीमित कर सकता है। तथापि, हम ताऊ के विरुद्ध अनेक विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने में सक्षम थे और ये वर्तमान में आगे मूल्यांकन8,9के दौर से गुजर रहे हैं । एक और सीमा आणविक जीव विज्ञान वसूली और IgGs की क्लोनिंग के कम थ्रूपुट है. प्रारंभिक छँटाई रणनीति कोशिकाओं के लाखों लोगों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन बाद में आणविक जीव विज्ञान प्रसंस्करण कई चरणों के होते हैं. चल रहे अनुकूलन के लिए नए प्रौद्योगिकियों को शामिल करने के प्रयास, गिब्सन विधानसभा10 के रूप में कई कदम सुव्यवस्थित है, लेकिन बाधा व्यक्तिगत भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़े क्लोनिंग बनी हुई है.
“BSelex” विधि प्रतिजन प्रतिक्रिया प्रदर्शित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त बीसीआर का इस्तेमाल करता है, और फिर प्रवाह साइटोमेट्री11,12के माध्यम से इन अलग-अलग कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें। बीसीआर पर इस निर्भरता के कारण, विधि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, और प्लाज्मा ब्लास्टकेरूप जैसे एंटीबॉडी स्रावित कोशिकाओं (एएससी) को कैप्चर नहीं करता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण ASCs की तुलना में प्रतिजन-विशिष्ट इम्यूनोग्लोबिन की एक व्यापक प्रदर्शनों को ठीक करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. इन्फ्लुएंजा टीकाकरण अध्ययनों से पता चलता है कि जबकि प्रतिक्रियाशील ASCs विस्तारित बी सेल क्लोन की एक छोटी संख्या से प्रभुत्व किया जा सकता है, प्रतिजन विशेष स्मृति बी सेल आबादी शायद ही कभी क्लोन12है. टी कोशिकाओं की सतह पर टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) जीन व्यवस्था और पुनर्संयोजन में बी सेल रिसेप्टर के लिए समानता के पास विविधता को अधिकतम करने के लिए. यहाँ प्रस्तुत विधि में वर्णित है क्या करने के लिए इसी तरह एकल सेल दृष्टिकोण टी सेल प्रदर्शनों का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, वसूली और अल्फा और बीटा चेन13के एकल सेल क्लोनिंग सहित . हालांकि, TCR मान्यता पेप्टाइड्स MHC अणुओं द्वारा प्रस्तुत किया जा करने की आवश्यकता है, पेप्टाइड-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लेबल चारा दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण जटिलता जोड़ने. बी कोशिकाओं के विपरीत, टी कोशिकाओं पूरे चर क्षेत्र की आत्मीयता परिपक्वता से गुजरना नहीं है, इसलिए कम CDR3 क्षेत्र की पहचान और कुछ flanking अनुक्रम सब है कि पहचान और पुनर्गठन के लिए आवश्यक है. अंत में, इस विधि प्रवाह साइटोमिट्री का उपयोग आईजीजी अणुओं की पहचान का वर्णन करता है, लेकिन यह भी विभिन्न आइसोटाइप के बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए वैकल्पिक phenotypic मार्करों का उपयोग करने के लिए संभव है।
वर्तमान में, एंटीजन विशिष्टता के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण से एकत्र डेटा की भारी मात्रा को जोड़ने के लिए विकसित किए जा रहे हैं, लेकिन इन तरीकों को अभी भी परिष्कृत किया जा रहा है। अपनी सीमाओं के बावजूद, यहाँ वर्णित विधि दोनों संक्रामक और गैर संक्रामक रोगोंकेलिए संभावित चिकित्सीय मूल्य के साथ एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 8 ,14,15, और एक विश्वसनीय का प्रतिनिधित्व करता है बी कोशिकाओं या व्यापक सेल संस्कृति के व्यापक हेरफेर के बिना, मनुष्यों से प्रासंगिक एंटीजन-विशिष्ट IgGs ठीक करने के लिए दृष्टिकोण।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को कई विधि संशोधनों और वर्तमान BSelex मंच के शोधन के व्यापक परीक्षण के लिए लुसी Chammas, मार्था कोस्टा, जूली किम, नैन्सी Herdia, और जेरेमी Macedo शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
CO2 incubator (Multitron) | |||
Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |