Summary
인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.
Abstract
인간 항체 레퍼토리는 잠재적인 치료 항체 및 유용한 바이오마커의 크게 미개발 된 소스를 나타낸다. 차세대 염기서열 분석(NGS)과 같은 현재의 연산 방법은 서열 수준에서 항체 레퍼토리에 대한 방대한 데이터 세트를 산출하는 반면, 기능적 데이터는 특정 항원 또는 세트와 관련된 서열을 식별하는 데 필요합니다. 항. 여기서, 우리는 인간 혈액 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 방법을 기술한다. 이 방법은 성숙한 B 세포의 초기 농축을 이용하고 유세포 측정을 통해 IgG 기억 B 세포를 분리하기 위하여 현상형 세포 마커 및 형광 표지된 단백질의 조합을 요구합니다. 그런 다음 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 복제하고 다시 스크리클합니다. 메모리 B 세포 구획에 국한되었지만, 이 방법은 유세포 측정을 활용하여 수백만 개의 B 세포를 심문하고 단일 셀에서 페어링된 중대 및 경체인 서열을 발현 및 특이성의 확인을 위한 형식으로 반환합니다. 이 방법으로 회수된 항체는 치료 전위를 고려할 수 있지만, 또한 개인 내의 B 세포 레퍼토리를 평가하기 위한 생물정보학 접근법과 특이성 및 기능을 연결할 수 있다.
Introduction
항체는 치료 분자의 성장 부류이며, 임의의 인간에서 기존의 B 세포 레퍼토리는 그러한 항체의 잠재적인 공급원이다. 인간 공여자로부터 회수될 때, 그들은 다른 동물 시스템에서 생성된 항체에 필요한 적응 또는 "인간화"를 필요로 하지 않는다. B 세포 활성화 및 증식 1, EBV 형질전환2,3,하이브리도마 세포주 생성을 포함한 인간 항체의 식별 및 분리를 위한 여러 가지 방법이 존재한다4 ,5. 그러나, 이 방법의 전부는 항원 특정 항체를 가리고 복구하기 위하여 광대한 세포 문화를 요구합니다. 인간 항체 레퍼토리에 대한 정보는 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술의 개발로 크게 확장되어 공여자 샘플에 존재하는 대량의 개별 서열을 식별할 수 있습니다. 그러나, NGS는 존재하는 모든 서열의 불가지론적 견해를 산출하기 때문에, 특히 희귀 또는 저주파 항체의 경우 항원 특이적 항체의 식별 및 절연을 허용하지 않는다.
"BSelex" 방법의 목적은 인간 공여자에서 말초 혈액 단핵 세포를 순환시키는 항원 특이적 항체를 식별하고, 추가 분석을 위해 이들 항체의 서열을 분리 및 회수하는 것이다. 이 방법은 유세포분석및 세포 선별을 활용하여 B세포 표면에서 발현된 B세포 수용체(BCR)를 활용한다. B 세포의 수백만 더 낮은 처리량 분자 생물학 방법이 시작되기 전에 유동 세포 측정을 통해 항원 특이성을 위해 가려질 수 있습니다. 셀 서열을 대량으로 분석하는 대부분의 NGS 방법에서는 쌍이 무거운 및 경체인 식별이 불가능합니다. 여기서 설명하는 방법에서, 세포는 개별적으로 분리되고, 무거운 및 경쇄 서열 둘 다의 쌍회수가 가능하여, 전체 IgG의 직접적인 복제 및 발현을 허용한다.
Protocol
인간 자원 봉사자의 샘플 사용은 스크립스 연구소 기관 검토 위원회가 승인 한 프로토콜을 따랐습니다. 헌혈 전에 기증자로부터 통보된 동의를 얻었다.
1. 시약 준비
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말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)
- Ficoll-Plaque Plus 격리를 통해 정상적인 인간 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 회복하십시오. 90% 태아 소 혈청(FBS) 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 5천만 개의 세포/mL에서 냉동 보존. 세포를 -80 °C에서 동결시키고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
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분류를 위한 표적 항원 펩티드 에 라벨링
- 말단 비오틴을 사용하여 표적 단백질(최대 70잔고)에 특이적인 펩타이드를 생성하거나 수득한다.
- 별도의 튜브에 PE (R-phycoerythrin) 또는 APC (알로피코시아닌)에 공동으로 부착 된 스트렙타비딘과 각 개별 생체 면역 펩티드의 라벨 4 nmol. 9:1 펩티드 대 스트렙타비딘(SA)의 몰 비를 사용하여 SA-PE및 5.7 μM SA-APC의 최종 농도가 약 3.2 μM인 것을 사용하여 준비합니다. 비오틴 테트라머를 음의 대조군으로 준비하십시오.
- 각 펩티드 혼합물을 밤새, 어둠 속에서, 느린 혼합으로 4°C에서 배양한다.
- 폴리아크릴아미드 비드가 함유된 마이크로컬럼을 통해 표지된 펩티드를 통과하여 언바운드 형광포를 제거합니다.
- 펩티드 테트라머를 4°C에서 최대 2개월까지 보관하십시오.
2. 셀 정렬
- CD22+ 격리 전에 적어도 1시간 에서 16시간, 공여체 PBMC를 해동하고 37°C에서 휴식을 취하도록 한다.
- 냉동고에서 냉동 PBMC의 바이알을 제거하고 즉시 37°C 수조로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다. 바이알이 거의 해동되면 작업 영역으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮
- 각 바이알의 내용물(기증자를 분리된 상태로 유지)을 함유하는 50 mL 튜브로 옮니다. 50 mL의 최종 볼륨에 매체를 추가합니다. 내용물부드럽게 섞습니다.
- 실온에서 6 분 동안 370 x g의 원심 분리기. 상급체를 버리고, RPMI 완전한 배지의 15 mL에서 세포를 재중단하고 세포 수를 수행한다.
- RPMI 완전한 배지를 사용하여 세포 농도를 2.0 x 107 세포/mL로 조정하고, 37°C에서 T75 플라스크 또는 더 큰 세포로 세포를 옮기고, 해동된 세포의 회복 시간을 허용하기 위해 적어도 1시간 및 최대 16시간 동안 37°C에서 배양한다.
- 4°C에서 6분 동안 370 x g에서 세포(원하는 경우 풀링)와 원심분리기를 수집한다. 상급을 버리고 5 mL의 얼음 차가운 MACS 버퍼 (PBS, pH 7.6 함유 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)에서 세포를 다시 중단하고 MACS 버퍼로 50 mL로 가져 와서 세포 수를 수행합니다.
- 4 °C에서 7 분 동안 400 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
- CD22 마이크로비드에서 캡처를 통해 양성 선택으로 CD22+ B 세포를 분리합니다. 모든 세정에 MACS 버퍼를 사용합니다. 4 °C에서 7 분 동안 400 x g의 카운트 및 원심 분리기. 예상 회복은 전체 PBMC 인구의 5-10%입니다.
- mL FACS 버퍼당 4,000만 개의 세포를 재중단하고(트리스 버퍼, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 포함하는 pH 8.0)를 개별적으로 또는 풀로서 기증자의 세포 염색을 진행한다.
- 메모리 B 세포 분류를 위한 얼룩 세포
- 사용된 각 라벨링 형광에 대한 세포 측정기 설정 및 보상에 대한 세포의 aliquot를 제거합니다. 스테인드되지 않은 세포를 대조군으로 포함시다.
- 얻어진 CD22+ 셀 수에 대한 최종 염색 부피(100 μL당 2백만 염색)를 계산합니다.
- 제조업체의 희석 권장 사항에 따라 B 세포(CD19-PerCP-Cy5.5), IgG(IgG-FITC) 및 메모리 컴파트먼트(CD27-PECy7)에 대한 세포외 마커를 추가하고 부드럽게 혼합합니다. Aliquot 107 세포를 음성 대조를 위한 1.5 mL 튜브 내로 하고 나머지 세포를 15 mL 튜브로 옮김을 전달한다.
- 이중 표지된 비오틴-SA 테트라머를 PE 및 APC에 대해 각각 36 nM의 최종 농도로 음극 대조군 튜브에 추가하고, 분류 튜브내의 펩티드 수를 곱하고 FACS 버퍼(예: 10개의 펩티드 x 36 nM=360 nM)로 부피를 0.5 mL로 최종으로 가져온다.
- PE 및 APC에 대해 각각 36 nM의 분류 튜브에 펩티드 테트라머를 추가하고 TBS 버퍼로 100 μL 당 2x106으로 세포를 가져옵니다. 어둠 속에서 4 °C에서 배양하고 30-60 분 동안 부드럽게 회전합니다.
- 4 °C, 400 x g,7 분에서 2 x를 씻고 마지막 세척 전에 계산할 알리쿼트를 제거하십시오. 5 mL 필터 캡 튜브를 사용하여 셀을 필터링합니다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 세포막 무결성의 마커로 분류하기 직전에 0.3 μM 최종 농도에 추가합니다.
- 유세포 측정을 통한 단일 세포 분류
- 선별을 위해 96웰 PCR 플레이트 48개의 웰을 준비합니다.
- 마스터 믹스를 준비합니다: 샘플당 (10x RT 완충제 2 μL, RNase 억제제 0.5 μL, 멸균 PCR 등급의 물 7.5 μL). Aliquot 10 μL 당 잘, 뚜껑을 덮고, 분류준비가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
- 셀 선별기에서 음수 컨트롤을 실행하여 전체 샘플을 분석합니다.
- 단일 세포 분류에 적합한 세포 모집단을 격리하도록 유량 세포 분석 게이트를 설정합니다.
- FSC 영역 대 SSC 영역을 플롯하고 게이트 R1을 설정하여 림프구를 분리합니다.
- FSC 높이 대 FSC 너비를 플롯하고 게이트 R3를 설정하여 FSC 더블릿을 제외합니다.
- SSC 높이와 SSC 너비를 플롯하고 게이트 R4를 설정하여 SSC 더블을 제외합니다.
- SSC 높이 대 DAPI를 플롯하고 게이트 R5를 라이브 셀(DAPI-)을 격리하도록 설정합니다.
- IgG 대 CD19를 플롯하고 게이트 R6을 설정하여 IgG+ B 셀(CD19+ IgG+)을 분리합니다.
- IgG 대 CD27을 플롯하고 게이트 R7을 설정하여메모리 B 셀(CD27 높음)을 선택합니다.
- 플롯 항원-PE (Ag-PE) 대 항원-APC (Ag-APC) 및 이중 양성 게이트에서 적은 수의 이벤트와 함께 게이트 R8을 Ag-PE+/Ag-APC+ 사분면으로 설정합니다.
- 단일 세포 분류에 적합한 세포 모집단을 격리하도록 유량 세포 분석 게이트를 설정합니다.
- 노이즈에 대한 신호 의 측정을 위해항원 양성(Ag+) 샘플로부터 동일한 수의 메모리 세포를 수집합니다.
- 표현형 CD19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC +(게이트 R8)를 갖는 단일 세포를 제조된 96웰 PCR 플레이트내로 정렬한다.
- 알루미늄 테이프 패드로 플레이트를 덮고, 400 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 만들고 향후 복제를 위해 -80 °C에서 보관하십시오.
- 선별을 위해 96웰 PCR 플레이트 48개의 웰을 준비합니다.
3. 단세포 복제
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역전사 반응
- 80°C에서 단일 B 세포 정렬 플레이트를 제거합니다. 얼음을 2분 간 녹여서 3,300 x g에서 2분 동안 접시를 회전하여 개구전에 우물 바닥에 있는 컨텐츠를 풀로 합니다.
- 역이니머로서 10% 비이온성 세제와 올리고(dT)로 dNTP/버퍼 마스터 믹스를 준비합니다. 단일 세포를 포함하는 각 우물에 효소 믹스를 추가하고 혼합하지마십시오.
- 65 °C에서 5 분 배양하십시오. 100 mM DTT, RNase 억제제 및 역 전사 효소를 함유하는 효소 마스터 믹스를 추가하여 총 부피를 20 μL로 가져 와서 50 °C에서 10 분, 80 °C에서 10 분 동안 인큐베이터합니다.
- PCR 단계를 시작하기 전에 얼음으로 전송
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다단계 중첩 PCR 반응
- 중첩된 PCR 반응은 중연쇄(HC) 및 경망(LC) 증폭에 사용된다.
- PCR 증폭의 첫 번째 라운드(Step I)의 경우, 정방향 프라이머 풀과 단일 역방향 프라이머를 사용하여 별도의 PCR반응에서 HC 및 LC 가변 영역을 증폭합니다(그림 2). 의도적으로, 전진 프라이머풀은 거라인 리더(L) 서열의 큰 비율을 증폭시키고 역프라이머는 경쇄(16)에 대한 카파(λ) 및 람다(λ)를 모두 포함하는각 사슬의 다운스트림 상수 영역에 특이적이다.
- 각 PCR(Step I) 반응에 대한 템플릿으로 cDNA 제품의 2.5 μL을 사용하십시오. 프라이머를 각각 1 μM의 최종 반응 농도에 추가합니다. 10x 폴리머라제 버퍼를 2배 농도로 두 배로 늘리고, 반응당 최종 부피를 25 μL로 가져옵니다. 50사이클 동안 [94°C/4분, 94°C/15s, 55°C/20초, 68°C/60s, 68°C/3분]을 사용하여 HC PCR 반응을 실행합니다. LC PCR 반응을 50사이클 동안 [98°C/4분, 98°C/15s, 72°C/20s, 72°C/60s, 72°C/3분]을 사용하여 실행합니다.
- 각 (단계 II) PCR 반응에 대한 템플릿으로 단계 I 제품의 2.5 μL을 사용합니다. HC 및 LC(λ 및 λ) 프레임워크 1 영역및 각 항체 사슬의 접합 영역에 특이적인 역방향 프라이머 풀에 특이적인 순방향 프라이머 풀을 추가합니다. 10x 폴리머라제 버퍼를 2배 농도로 두 배로 하고, 1단계와 동일한 파라미터를 사용하여 각각 50사이클씩 PCR 반응을 실행한다.
- 완료된 PCR 반응을 1% 아가로즈 젤에서 실행하여 양성 증폭 안타를 시각화합니다. 페어링된 앰플리온(동일한 세포에서 무겁고 가벼운 사슬 모두)을 회수하고 젤 추출을 통해 분리합니다. 정확한 결찰 혼합 계산을 위해 OD260을 통해 DNA 단편 농도를 결정합니다.
- 회수된 중쇄 및 경쇄 단편을 상용 키트를 사용하여 4-단편 결찰 반응을 사용하여 링커 프래그먼트 및 발현 벡터 백본과 결합한다.
- 상용 키트를 사용하여 결찰 반응을 화학적으로 유능한 박테리아로 변환합니다. 일단 항생제 플레이트에 도금되고, 나머지 형질전환 배양에 4 mL의 성장 배지(항생제)를 추가하고, 250 rpm에서 밤새 37°C를 배양한다. 이것이 "결찰 혼합 배양"입니다.
- 상용 키트를 사용하여 하룻밤 결찰 혼합 배양으로부터 miniprep DNA를 준비하고, 생성된 플라스미드 DNA 농도를 결정한다.
4. 항원 특이성 확인을 위한 ELISA 스크린
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10 μg의 미니프렙 DNA를 양이온 지질 계 시약으로 10 mL의 현탁액 293 세포로 트랜스펙트하고, 125 rpm에서 회전하면서 37°C(8% CO2)에서 3-4일 동안 배양한다. 수확을 위해, 원심분리배양분1,000 x g에서 10분 및 정제된 배지를 회수한다.
- 단백질 A에 대한 친화성을 통해 초월제의 IgG 농도를 측정합니다.
- 각 IgG(상판)를 20 μg/mL에서 효소 연계 흡착제 분석법(ELISA)에 의해 분류에 사용되는 개별 펩티드에 대해 테스트하고, 스트렙타비딘 플레이트 또는 액틴에 포획하여 음성 대조군으로 포획하였다. 염소 항인간 과산화아제 이차 항체를 인간 IgG Fab에 대해 사용하여 재조합 클론을 검출한다. 배경을 빼면 OD > 0.5는 화면 양수로 정의됩니다.
- IgG 상판의 희석을 사용하여 mL당 20 μg에서 시작하여 농도 곡선을 생성하고, 초기 화면 ELISA에서 반응성을 나타내는 각 항원마다 OD에 대해 플로팅하여 추가 ELISA를 수행하여 화면 양성 안타를 확인합니다.
Representative Results
이 방법은 인간 공여자로부터 항원 특이적 항체를 분리하는 다단계 과정을 다룹니다. 여기에 표시된 대표적인 데이터에서, 세포는 인산화 된 인산화 부위를 모방하는 인산화 펩티드를 포함하여 타우 단백질의 여러 상이한 도메인을 나타내는 형광 표지 된 펩티드 풀로 배양되었다. 이들 펩타이드는 관심 있는 타우 에피토프(들)와 반응하는 세포를 식별하기 위해 "미끼"로 사용하였다. 분류를 위한 준비에서, 형광 표지된 현상형 마커의 위원회는 농축된 B 세포 인구 내의 다른 세포 인구를 확인하기 위하여 이용되었습니다. 일련의 세포분석 게이트를 고안하여 표적 기억 B 세포를 분리하였다(도 1). 림프구는 유세포분석6,7에서전방 산란(FSC) 및 측 산란(SSC) 플롯을 사용하여 그들의 세포 크기 및 세분성에 기초하여 분리되었다. 다중 세포("doublets") 및 죽은 세포의 배제에 이어, 자형표 마커는 IgG, CD19(B 셀) 및 CD27(메모리)을 통해 IgG+ 메모리 B 세포의 분리를 허용했다. 이 접근법에서 CD27 마커는 두 개의 개별 모집단으로 분배되지 않으므로 CD27+ 발현 셀의 상위 45%가 최종 게이트에 포함됩니다. 마지막으로, APC 및 PE 형광단 둘 다에 대한 이중 양성 세포는 게이팅 그래프의 우측 상단 사분면으로 분배되어, 두 표지된 펩티드 버전 모두에 대한 반응성을 나타낸다. 그려진 게이트 내에 떨어진 세포를 분리하고 96 웰 플레이트의 개별 우물로 분류했습니다. 2개의 다른 레이블을 가진 항원을 사용하는 것은 신호 대 잡음 비율을 증가시키고 후속 분자 생물학 프로세스에 있는 거짓 긍정의 수를 감소시킵니다. 정렬된 세포는 최종 게이트에서 메모리 B 세포의 약 0.1%, 시작 세포 샘플의 0.001%를 나타냈다.
단일 셀 클로닝의 첫 번째 판독은 각각의 중쇄 및 경변쇄 체인의 증폭을 확인한다(그림 2). 두 앰플리콘의 쌍 회수가 요구되기 때문에, PCR 반응은 아가로즈 겔상에서 나란히 평가되고, 일치하는 쌍은 추출된 겔 및 DNA 단편으로부터 절제된다. 증폭의 일반적인 효율은 30-50 % 중한 체인과 50-70 % 빛 (카파) 체인입니다. 페어링 된 앰플리곤의 회복은 일반적으로 25-40 % 효율 사이입니다. 이러한 효율성은 공여자 풀마다 다양하며, 대표적인데이터(그림 3)는 24개의 단일 셀(42% 쌍회수)으로부터 매우 효율적인 증폭의 예이다. IgG 클로닝 에 이어, IgG 발현 벡터는 인간 배아 신장(HEK-293) 현탁액 세포로 형질전환되어 발현을 최대화하는 데 사용된다. 혈청이 없는 배지를 사용하면 재조합 항체 준비에서 오염된 단백질을 감소시키고 후속 결합 성 반응에서 잡음을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 회수된 항체는 타우 펩티드의 원래 패널에 대해 스크리핑되고 ELISA에 의해 반응성을 위해 득점된다(그림 4). OD = 0.5 이상의 배경위의 초기 임계값은 양성 항원 반응성을 나타내기 위해 사용되며, β-액틴 단백질은 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 사용된다. 유세포 분석 및 선별 단계가 펩티드의 혼합 풀을 사용하는 경우, 스크리닝 ELISA는 회수된 IgGs의 특정 재활동을 감소시키는 첫 번째 단계이다. 분석된 10개의 IgGs 중 3개는 인산화CBTAU22.1 펩티드에 대하여 반응성을 입증하였고, 하나는 비인산화 CBTAU27.1에 반응하였다(도4A). 추가의 확인은 초기 스크린에서 확인된 펩티드에 대하여 동일한 재조합 항체 샘플의 농도 곡선을 사용하여 완료되었고, 추가적인 펩티드를 음성 대조군으로서 완료하였다(도4B). 각 양성 적중에 대해, 개별 플라스미드 클론은 변형된 풀로부터 분리되고 동일한 ELISA 방법에 의해 재확인되었다. 오직 클론(34)만이 제시된 데이터를 나타내고, 비인산화 CBTAU27.1에 대한 반응성이 확인되었지만, 더 낮은 친화성 결합은 또한 인산화된 27.1 펩티드로 관찰되었다(도4C).
그림 1 : 유세포측정을 통한 항원 반응성 단일 세포의 분리. (A) 표시된 것은 그려진 게이트 내에 림프구 집단이 포함된 대표적인 플롯입니다. (B) 전방 및 측면 산란을 기반으로 하는 게이트(FSC 높이 v FSC 폭(R3); SSC-높이 v SSC-폭(R4))은 더블을 배제하기 위해 사용되었다. 그려진 게이트 내의 셀만 후속 플롯에서 평가되었습니다. DAPI+ 세포는 죽은 것으로 간주되었고 제외되었다(R5). 본 실험에서, 3.7 x 107 "살아있는" 세포를 심문하였다. 살아있는 세포의 대다수는 B 세포 (CD19+)및 IgG+ 세포 (4.66%)이었습니다 이 집단(R6)에서 격리되었습니다. CD27+ -발현 메모리셀의 상위 43.2%가 선택 게이트(R7)에 포함되었다. (C) 사분면 2(Q2)는 표지된 항원(펩타이드-APC v 펩티드-PE)에 반응성 세포를 함유하고, 이들 세포를 96웰 플레이트내로 개별적으로 분류 및 회수하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PCR 증폭은 복제를 위해 IgG 무겁고 가벼운 가변 시퀀스를 회수합니다. (A) 중첩된 PCR 반응을 사용하여 무거운(VH) 및 라이트(Vk 또는 Vl) 사슬 가변 영역을 모두 복구합니다. 단계 I 프라이머는 네이티브 리더 시퀀스에서 앞으로 증폭하고 상수 영역 내에서 역방향입니다. 여러 화살표는 가능한 생식선의 넓은 범위를 보장하기 위해 사용되는 7-12 프라이머 사이의 풀을 나타냅니다. 단계 II 프라이머는 변수 오픈 판독 프레임의 극단적인 단부와 특이적으로 중첩되고, 식 벡터에서 인접 시퀀스에 상동되는 앰플리온의 끝에 시퀀스를 추가한다. (B) 링커는 상수 광쇄(Ck 또는 Cl)로 구성되며, 그 다음에 는 중쇄 프로모터 및 비네이티브 신호 펩티드 서열이 뒤따른다. 앰플리온, 링커 및 플라스미드 백본은 단계 II PCR 증폭 중에 생성된 상동 서열을 통해 동시에 결찰되고, 그대로 플라스미드로서 단리된다. 최종 발현 벡터에서 재조합 무거운 및 경쇠는 독립적인(및 동일한) CMV 프로모터에 의해 구동되고, 별도의 단백질로서 번역된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : IgG 헤비 및 라이트 가변 체인 앰플리온이 단일 셀에서 회수됩니다. 중첩된 PCR 반응(Step II)을 1% 아가로즈 겔에 직접 적재하고 시각화하였다. 동일한 셀로부터의 중계체인(H) 및 카파경망(L) PCR 반응을 인접한 웰에 적재하여 쌍을 이루는 앰플리곤을 쉽게 관찰하였다. 성공적인 중대형 및 경량 체인 제품은 각각 약 400bp 및 350bp입니다. 페어링된 앰플리곤의 성공적인 복구는 (*)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 항원 특이성이 재조합 IgGs로부터 확인됩니다. 회수된 중대 및 경혈 서열을 함유하는 플라스미드는 발현을 위해 HEK 세포내로 형질전환된다. 4일 후, 재조합 항체는 ELISA에 의해 반응성을 평가한다. (a) 정제된 매체에서 IgG 농도를 측정하고 20 μg/mL로 희석하였다. 선별에 사용되는 펩티드 풀은 스트렙타비딘 플레이트에서 웰당 40pmol을 사용하여 개별적으로 평가되었다. 모든 IgGs는 중복 우물에서 테스트되었습니다. (B) OD450 측정 >0.5를 표시한 클론을 재평가하였다(클론 #32, #34, #35)는 화면에서 확인된 펩티드에 대하여 1:5 희석 단계를 사용하여 하였다. (C) 일단 히트로 확인되면, 단일 플라스미드 클론을 클론으로부터 분리하였고 #34 형질전환된 결찰, 형질감염, 및 ELISA에 의해 재확인하였다. 클론 #32 #35(데이터가 표시되지 않음)에 대해동일한 작업이 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 방법은 유세포 분석및 단세포 복제를 결합하고, 우리가 여기에서 설명하는 방법은 우리가 이전에 틸러와 동료11에의해 개발된 방법에 근거를 둔다. 그들의 일은 개별 적인 세포의 수준에 인간에 있는 B 세포 레퍼토리를 공부하기 위하여 단클론 항체의 회수 그리고 복제를 기술합니다. 우리는 다단계 증폭 프라이머 전략을 포함하여 메모리 B 세포의 집단으로부터 항원 특이적 단일클론 항체의 회복을 허용하도록 그들의 프로세스의 주요 성분을 적응시켰다. 주요 변형은 표지된 항원 "미끼"의 첨가이다. 복제 벡터 백본을 단일 발현 플라스미드로 수정하는 것을 포함하여(이에 국한되지 않음) 게시된 프로토콜에 대한 추가 적응이 이루어졌으며, 생식선 레퍼토리의 추가 적인 프라이머 커버리지(리더 시퀀스 및 프레임워크 1 모두), 더 높은 발현을 위해 서스펜션 HEK293 셀의 형질전환 및 PCR 증폭 시 고충실도 폴리머라제의 사용.
여기서 설명한 방법의 경우, 가장 중요한 단계는 유세포 분석과 단일 세포 복제 사이의 전이에 가깝습니다. 첫째, 플레이트에 정렬 된 단일 세포를 적절하게 배치하는 것이 필수적입니다. 선별기에서 드롭 지연을 올바르게 설정하는 것이 핵심 단계입니다. 정전기 총을 대상 선별 플레이트에 사용하지 않는 한 습도가 낮음과 같은 환경 적 요인도 고려해야 합니다. 세포 배치 후, 플레이트는 세포가 우물 의 바닥에 버퍼의 10 μL에 접촉했다는 것을 확인하기 위해 원심 분리된다. 이 측정의 전부는 분자 생물학 부분이 성공하기 위하여 중요합니다. 조건이 단일 세포의 역전사 반응에 대해 최적이 아닌 경우, 심지어 β-액틴의 PCR 증폭이 어려울 수 있다. 제시된 방법의 힘은 수백만 개의 세포를 심문하고 선택의 항원 반응성 기준에 일치하는 것들만 정렬하는 능력입니다. 이를 위해서는 신호 대 잡음 비가 가능한 한 높아야 하며, 이는 분류 하기 전에 미끼 농도를 최적화하여 수행됩니다. 이중 표지 된 미끼는 형광단 중 하나가 높은 배경을 가지고있는 경우 발생할 수있는 가양성 세포의 회복을 줄이기 위해 사용됩니다. 하나 이상의 항원 미끼를 사용하면 신호가 더 어려워질 수 있습니다: 잡음 최적화가 더 어려워지지만 동시에 여러 펩티드를 심문하는 능력은 이 방법의 또 다른 이점입니다.
회복 효율이 낮으면 중첩된 β-액틴 프라이머 세트가 템플릿 cDNA가 존재하는지 확인하는 데 사용됩니다. 이 접근법의 단점은 우물에 세포가 존재하지 않았는지 또는 역전사 반응이 실패했는지 여부를 판단하기 어렵기 때문에 문제 해결이 어렵다는 것입니다. 경우에 따라 반대가 발생하고 효율성이 예상보다 높습니다. 중체인의 일반적인 회수는 30-45%이고 경쇠는 40-60% 사이에서 더 높습니다. 각 PCR 반응 (단계 I & II)는 단일 세포에서 증폭하기 위해 50 사이클을 사용합니다. 총 사이클의 수가 많기 때문에 이 방법은 오염에 취약합니다. 앰플리콘의 서열 분석은 오염물질이 유입되었는지 또는 비정상적으로 높은 회수율이 합법적으로 달성되었는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
선택의 항원에 대하여 네이티브 인간 항체를 회수하는 이 방법의 유용성은 몇몇 중요한 한계를 가지고 있다. 첫째, 표지될 수 있는 수용성 단백질만이 유세포측정을 위한 "미끼"로서 사용될 수 있다. 대표적인 결과에 제시된 종류를 위해, 우리는 타우 단백질에서 합성된 겹치는 펩티드의 시리즈를 사용했습니다, 전체 단백질을 사용하는 것은 어려운 증명하기 때문에. 선형 펩티드의 사용은 비선형 또는 구조 적 에피토프에 대한 항체의 식별을 제한 할 수 있기 때문에, 아마도 최적이 아니다. 그러나, 우리는 타우에 대하여 몇몇 유일한 항체를 확인할 수있었고 이들은 현재 추가 평가를 겪고 있습니다 8,9. 또 다른 제한은 IgGs의 분자 생물학 복구 및 복제의 낮은 처리량입니다. 초기 선별 전략은 수백만 개의 세포를 스크리닝할 수 있지만 후속 분자 생물학 처리는 여러 단계로 구성됩니다. Gibson Assembly10과 같은 최신 기술을 통합하기 위한 지속적인 최적화 노력은 여러 단계를 간소화했지만 병목 현상은 개별 중쇄 및 경량 체인 쌍을 복제하는 것으로 남아 있습니다.
"BSelex" 방법은 메모리 B 세포의 표면에 발현된 BCR을 이용하여 항원 반응성을 나타내는 세포를 식별한 다음 유세포 분석11,12를통해 이들 개별 세포를 회수한다. BCR에 대한 이러한 의존성으로 인해, 이 방법은 메모리 B 세포 구획으로 제한되고, 혈장블라스트와 같은 항체 분비 세포(ASC)를 포착하지 않는다. 그러나, 이러한 접근법은 ASC와 비교할 때 항원 특이적 면역글로빈의 광범위한 레퍼토리를 회복시키는 데 유리할 수 있다. 인플루엔자 백신 접종 연구는 반응성 ASC가 소수의 확장된 B 세포 클론에 의해 지배될 수 있는 반면, 항원 특이적 기억 B 세포 집단은 거의 클론12가아니라는 것을 보여준다. T 세포의 표면에 있는 T 세포 수용체(TCR)는 다양성을 최대화하기 위해 유전자 배열 및 재조합에서 B 세포 수용체와 유사성을 갖는다. 여기에 제시된 방법에 기재된 것과 유사한 단세포 접근법은 알파 및 베타 사슬(13)의 회수 및 단일 세포복제를 포함하는 T 세포 레퍼토리를 평가하기 위해 개발되었다. 그러나, TCR 인식은 펩티드 특이적 T 세포를 확인하기 위하여 표지된 미끼 접근에 중요한 복잡성을 추가하는 MHC 분자에 의해 제시되는 펩티드를 요구합니다. B 세포와 는 달리, T 세포는 전체 가변 영역의 친화도 성숙을 거치지 않으므로 짧은 CDR3 영역 및 일부 측면 서열의 식별은 식별 및 재구성에 필요한 모든 것입니다. 마지막으로, 이 방법은 유세포측정법을 사용하여 IgG 분자의 식별을 설명하지만, 다른 아이소타입의 B 세포를 식별하기 위해 대체 표현형 마커를 사용하는 것도 가능하다.
현재 차세대 염기서열 분석에서 수집된 방대한 양의 데이터를 항원 특이성의 기능적 분석과 연결하는 방법이 개발되고 있지만 이러한 방법은 여전히 개선되고 있습니다. 그 한계에도 불구하고, 여기에 기술된 방법은 감염성 및 비감염성 질환모두에대한 잠재적 치료 가치를 가진 항체를 식별하기 위해 사용되어 왔다 8,14,15,신뢰할 수 있는 것을 나타낸다. B 세포 또는 광범위한 세포 배양의 광범위한 조작없이 인간으로부터 관련 항원 특이적 IgGs를 복구하는 접근 방식.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
저자는 루시 Chammas, 마사 코스타, 줄리 김, 낸시 헤레디아, 그리고 현재 BSelex 플랫폼의 많은 방법 수정 및 개선의 광범위한 테스트에 대한 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
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