Summary
De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.
Abstract
Het menselijke antilichaam repertoire vertegenwoordigt een grotendeels onbenutte bron van potentiële therapeutische antilichamen en nuttige biomarkers. Hoewel de huidige rekenmethodes, zoals de sequenties van de volgende generatie (NGS), een enorme hoeveelheid gegevens opleveren over het repertoire van het antilichamen op het sequentie niveau, zijn functionele gegevens vereist om vast te stellen welke reeksen relevant zijn voor een bepaald antigeen of een reeks Antigenen. Hier beschrijven we een methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te identificeren en te herstellen van een humane bloeddonor. Deze methode maakt gebruik van een initiële verrijking van volwassen B-cellen en vereist een combinatie van fenotypische celmarkers en fluorescently-gelabelde eiwitten om IgG-geheugen B-cellen te isoleren via Flowcytometrie. De zware en lichte keten variabele regio's worden vervolgens gekloond en opnieuw gescreend. Hoewel beperkt tot het celcompartiment van Memory B, maakt deze methode gebruik van Flowcytometrie om miljoenen B-cellen te ondervragen en retourneert gekoppelde zware en lichte ketting sequenties uit een enkele cel in een formaat dat klaar is voor expressie en bevestiging van specificiteit. Antilichamen die met deze methode worden teruggewonnen, kunnen worden overwogen voor therapeutisch potentieel, maar kunnen ook specificiteit en functie koppelen aan bioinformatische benaderingen om het B-celrepertoire binnen individuen te beoordelen.
Introduction
Antilichamen zijn een groeiende klasse van therapeutische moleculen, en het bestaande B-celrepertoire bij elke mens is een potentiële bron van dergelijke antilichamen. Wanneer ze van een menselijke donor worden teruggewonnen, behoeven ze geen aanpassing of "humanisatie", stappen die nodig zijn voor antilichamen die in andere dier systemen worden gegenereerd. Er bestaan verschillende methoden voor de identificatie en isolatie van menselijke antilichamen, waaronder B-celactivering en proliferatie1, vereeuwiging via EBV-transformatie2,3en het genereren van hybridoma-cellijnen4 ,5. Al deze methoden vereisen echter een uitgebreide celcultuur om antigeen-specifieke antilichamen te schermen en te herstellen. Informatie over het repertoire van menselijke antilichamen is sterk uitgebreid met de ontwikkeling van de Next generation sequencing (NGS) technologie, waardoor er enorme hoeveelheden individuele sequenties in donor monsters kunnen worden geïdentificeerd. Omdat NGS echter een agnostische weergave van alle aanwezige sequenties oplevert, is het niet mogelijk antigeen-specifieke antilichamen te identificeren en isoleren, met name in het geval van zeldzame of laagfrequente antilichamen.
Het doel van de methode "BSelex" is het identificeren van antigeen-specifieke antilichamen tegen circulerende perifere bloed mononucleaire cellen bij menselijke donoren, en het isoleren en herstellen van de sequenties van deze antilichamen voor verdere analyse. Deze methode maakt gebruik van flow cytometrie en celsortering om te profiteren van de B cell receptor (BCR) uitgedrukt op het oppervlak van geheugen B cellen. Miljoenen B-cellen kunnen worden gescreend op antigeen-specificiteit via Flowcytometrie voordat de meer lage doorvoer moleculaire biologie methoden worden geïnitieerd. Gekoppelde zware en lichte keten identificatie is niet mogelijk in de meeste NGS-methoden, die celsequenties in bulk analyseren. In de methode die we hier beschrijven, cellen worden afzonderlijk geïsoleerd, en gepaarde herstel van zowel zware als lichte ketting sequenties is mogelijk, waardoor direct klonen en expressie van de volledige IgG.
Protocol
Het gebruik van monsters van menselijke vrijwilligers volgde de protocollen die zijn goedgekeurd door het Scripps Research Institute Institutional Review Board. Voorafgaand aan de bloeddonatie werd geïnformeerde toestemming verkregen van de donoren.
1. bereiding van het reagens
-
Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)
- Herstel perifere bloed mononucleaire cellen van normale menselijke donoren door Ficoll-plaque plus isolatie. Cryopreserve bij 50.000.000 cellen/mL in 90% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Vries de cellen bij-80 °C en breng over naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag.
-
Labeling doel antigen peptiden voor het sorteren
- Genereren of verkrijgen van peptiden specifiek voor het doeleiwit (tot 70 residuen lang) met een terminale biotine.
- Etiket 4 nmol van elke individuele biotinyleerd peptide met streptavidine covalent gehecht aan PE (R-phycoerythrin) of APC (allophycocyanin) in afzonderlijke buisjes. Bereid met behulp van een molaire verhouding van 9:1 peptide aan streptavidine (SA), met een uiteindelijke concentratie van ongeveer 3,2 μM voor SA-PE en 5,7 μM SA-APC. Bereid Biotine tetramers als een negatieve controle.
- Inincuberen elke peptide mix 's nachts, in het donker, bij 4 °C met langzame menging.
- Verwijder ongebonden de door het gelabelde peptiden door te geven via micro kolommen die polyacrylamideparels bevatten.
- Bewaar peptide tetramers tot 2 maanden bij 4 °C.
2. sorteren van cellen
- Ten minste 1 h tot 16 h voor de CD22 + isolatie, ontdooien donor PBMCs en laten rusten bij 37 °C.
- Verwijder flacons met bevroren PBMCs uit de vriezer en breng onmiddellijk over in een waterbad van 37 °C. Wanneer de flacons bijna ontdooid zijn, gaat u over naar het werkgebied.
- Breng de inhoud van elke injectieflacon over in een buis van 50 mL met voorverwarmde medium (waarbij de donoren gescheiden blijven). Voeg medium toe aan een eindvolume van 50 mL. Meng de inhoud voorzichtig.
- Centrifugeer op 370 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg, regeer de cellen in 15 mL RPMI compleet medium en voer een celtelling uit.
- Pas de celconcentratie aan op 2,0 x 107 cellen/ml met het volledige rpmi-medium en breng cellen over in een T75 kolf of groter en incuberen bij 37 °c gedurende ten minste 1 uur en tot 16 uur om de hersteltijd voor ontdooide cellen toe te staan.
- Verzamel de cellen (pooling indien gewenst) en centrifugeer bij 370 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi supernatant weg en regeer de cellen in 5 mL ijskoude MACS buffer (PBS, pH 7,6 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA), breng naar 50 mL met MACS buffer en voer een aantal cellen uit.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c.
- Isoleer de CD22+ B-cellen door positieve selectie via Capture op CD22 microbeads. Gebruik MACS buffer voor alle washes. Tel en centrifugeer 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Het verwachte herstel is 5-10% van de totale PBMC populatie.
- Respendeer cellen op 40.000.000 per mL FACS buffer (tris-buffer, pH 8,0 met 0,5% BSA en 2 mM EDTA) en ga verder met celkleuring van de donoren afzonderlijk of als een pool.
- Vlek cellen voor geheugen B-celsortering
- Verwijder een aliquot van cellen voor het instellen van de cytometer en de compensatie voor elk van de gebruikte fluophores. Niet-bevlekte cellen opnemen als een besturingselement.
- Bereken het uiteindelijke kleurings volume voor het aantal verkregen CD22+ cellen (kleuring 2.000.000 per 100 μL).
- Voeg extracellulaire markers toe voor B-cellen (CD19-PerCP-CY 5.5), IgG (IgG-FITC) en geheugen compartiment (CD27-PECy7) volgens de verdunnings aanbevelingen van de fabrikant en meng zachtjes. Aliquot 107 cellen in een tube van 1,5 ml voor de negatieve controle en breng de resterende cellen over naar een buis van 15 ml.
- Voeg de dubbele gelabelde biotin-SA-tetramers toe aan de negatieve controle buis bij een eindconcentratie van 36 nM per stuk voor PE en APC, vermenigvuldigd met het aantal peptiden in de sorteer buis en breng het volume naar 0,5 mL definitief met FACS-buffer (bijv. 10 peptiden x 36 nM = 360 nM).
- Voeg de peptide tetramers toe aan de sorteer buis bij 36 nM elk voor PE en APC en breng de cellen naar 2x106 per 100 ΜL met TBS-buffer. Inincuberen bij 4 °C in het donker en met zachte rotatie voor 30-60 min.
- Was 2x bij 4 °C, 400 x g, 7 min, verwijder een aliquot om te tellen voor de laatste wasbeurt. Filter cellen met 5 mL filterdop buizen. Voeg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) vlek tot 0,3 μM eindconcentratie net voorafgaand aan het sorteren als een marker van de integriteit van de celmembraan.
- Sorteren van één cel via Flowcytometrie
- Bereid 48 putten van 96-goed PCR-platen voor sortering.
- Bereid een hoofdmix voor: (2 μL van 10x RT-buffer, 0,5 μL RNase-remmer, 7,5 μL steriel water van PCR-niveau) per monster. Aliquot 10 μL per goed, afdekking en bewaren bij 4 °C tot het klaar is om te sorteren.
- Voer de negatieve controle op de celsorteerder uit, waarbij het hele voorbeeld wordt geanalyseerd.
- Stel flow cytometrie poorten in om de juiste celpopulaties te isoleren voor het sorteren van één cel.
- Plot FSC-gebied versus SSC-gebied en stel Gate R1 in om lymfocyten te isoleren.
- Plot FSC-hoogte versus FSC-breedte en stel Gate R3 in om FSC-doubleten uit te sluiten.
- Plot SSC-hoogte versus SSC-breedte en stel Gate R4 in om SSC-doubleten uit te sluiten.
- Plot SSC Height versus DAPI en stel Gate R5 in om levende cellen (DAPI-) te isoleren.
- Plot IgG VS CD19 en zet Gate R6 om IgG+ B cellen (CD19+ IgG+) te isoleren.
- Plot IgG versus CD27 en stel Gate R7 in om geheugen B-cellen (CD27hoog) te selecteren.
- Plot antigen-PE (AG-PE) vs antigeen-APC (AG-APC) en set Gate R8 als een AG-PE+/AG-APC+ Kwadrant met een laag aantal gebeurtenissen in de dubbele positieve poort.
- Stel flow cytometrie poorten in om de juiste celpopulaties te isoleren voor het sorteren van één cel.
- Verzamel een gelijk aantal geheugen cellen uit het antigeen-positieve (AG+) monster voor de bepaling van het signaal naar ruis.
- Sorteer enkelvoudige cellen met het fenotype CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (Gate R8) in bereide 96-well PCR-platen.
- Afdekplaten met aluminium tape pads, Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 400 x g en bewaar bij-80 °C voor toekomstig klonen.
- Bereid 48 putten van 96-goed PCR-platen voor sortering.
3. klonen van één cel
-
Omgekeerde transcriptie reacties
- Verwijder de enkelvoudige B-cel Sorteer plaat van 80 °C. Ontdooien op ijs gedurende 2 min. Draai de plaat gedurende 2 minuten bij 3.300 x g om de inhoud in de bodem van de putjes te openen voordat u deze opent.
- Bereid een dNTP/buffer Master mix met 10% niet-ionische reinigingsmiddel en oligo (dT) als de omgekeerde primer. Voeg enzym mix toe aan elk goed met de enkele cel en Meng niet.
- Inincuberen 5 min bij 65 °C. Voeg enzym Master mix met 100 mM DTT, RNase-remmer en reverse transcriptase enzym toe om het totale volume te brengen tot 20 μL. Inbroed 10 min bij 50 °C, dan 10 min bij 80 °C.
- Overdracht naar ijs voorafgaand aan het starten van PCR-stappen
-
Meerdere stappen geneste PCR-reacties
- Gebruik afzonderlijke geneste PCR-reacties worden gebruikt voor de versterking van de zware keten (HC) en de lichte keten (LC).
- Gebruik voor de eerste ronde van PCR-versterking (stap I) een pool van voorwaartse primers en een enkele omgekeerde primer om de HC-en LC-variabele regio's te versterken in afzonderlijke PCR-reacties (Figuur 2). Door het ontwerp zal de pool van voorwaartse primers een groot percentage van de kiembaan Leader (L)-sequenties versterken en de omgekeerde primer is specifiek voor de benedenstroomse constante gebieden van elke keten, inclusief zowel de Kappa (κ) als lambda (λ) voor licht kettingen16.
- Gebruik 2,5 μL cDNA-product als sjabloon voor elke PCR-(stap I)-reactie. Voeg primers toe aan de uiteindelijke reactie concentratie van 1 μM per stuk. Verdubbel de 10x polymerase buffer tot 2x de concentratie, breng het eindvolume naar 25 μL per reactie. Voer HC PCR-reacties uit met behulp van [94 °C/4 min; 94 °C/15 s, 55 °C/20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 min] voor 50 cycli. Voer LC-PCR-reacties uit met [98 °C/4 min; 98 °C/15 s, 72 °C/20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 min] voor 50 cycli.
- Gebruik 2,5 μL van het product Step I als template voor elke (stap II) PCR-reactie. Voeg de pool van voorwaartse primers toe die specifiek zijn voor de regio HC en LC (κ en λ) Framework 1 en een pool van reverse primers die specifiek zijn voor de Junction-regio van elke keten van antilichamen. Dubbele de 10x polymerase buffer tot 2x concentratie, en uitvoeren PCR reacties 50 cycli elk met behulp van dezelfde parameters als stap I.
- Voer de voltooide PCR-reacties uit op 1% agarose-gel om positieve versterkings treffers te visualiseren. Herstel gekoppelde amplicons (zowel zware als lichte keten uit dezelfde cel) en Isoleer via gel-extractie. Bepaal DNA-fragment concentratie via OD260 voor nauwkeurige ligatie mix berekeningen.
- Combineer herstelde zware en lichte ketting fragmenten met een linker fragment en de Expression vector backbone met behulp van een 4-fragment ligatie reactie met behulp van een commerciële Kit.
- Transformeer ligatie reacties in chemisch competente bacteriën met behulp van een commerciële Kit. Eenmaal geplateerd op antibiotica platen, Voeg 4 mL groeimedia (met antibioticum) toe aan de overgebleven transformatie cultuur en incuberen 37 °C 's nachts bij 250 rpm. Dit is de "ligatie mix cultuur."
- Bereid miniprep DNA van de nachtelijke ligatie mix culturen met behulp van een commerciële Kit, en bepaal de resulterende plasmide DNA-concentratie.
4. ELISA-scherm voor bevestiging van antigeen-specificiteit
-
Transfect 10 μg miniprep DNA met cationische lipide-gebaseerde reagens in 10 mL suspensie 293 cellen, en incuberen voor 3-4 dagen bij 37 °C (8% CO2) tijdens het roteren bij 125 rpm. Voor de oogst, centrifuge cultuur 10 min bij 1.000 x g en herstellen van geklaarde media.
- Meet de IgG-concentratie in de supernatanten via affiniteit met proteïne A.
- Test elke IgG (in supernatant) op 20 μg/mL door een enzym-gebonden adsorptietest (ELISA) tegen de individuele peptiden die voor het soort worden gebruikt, gevangen op een streptavidine-plaat of actine als een negatieve controle. Gebruik een geit anti-humaan peroxidase secundair antilichaam tegen menselijke IgG Fab om recombinant klonen te detecteren. Na het aftrekken van de achtergrond, wordt OD > 0,5 gedefinieerd als positief scherm.
- Bevestig de positieve hits van het scherm door een extra ELISA uit te voeren met verdunningen van IgG-supernatant om een concentratie curve te genereren vanaf 20 μg per mL, en om te plotten tegen OD voor elk antigeen dat reactiviteit weergeeft in het initiële scherm ELISA.
Representative Results
Deze methode bestrijkt een proces van meerdere stappen om antigeen-specifieke antilichamen van menselijke donoren te isoleren. In de hier getoonde representatieve gegevens werden cellen geïnbroed met een pool van fluorescently-gelabelde peptiden die verschillende domeinen van het Tau-eiwit representeren, inclusief gefosforyleerd peptiden om vermoedelijke fosforylatie sites na te bootsen. Deze peptiden werden gebruikt als "aas" om cellen te identificeren die reactief zijn met tau-epitopes (s) van belang. Ter voorbereiding op sortering werd een panel van fluorescently gelabelde fenotypische markers gebruikt om verschillende celpopulaties binnen de verrijkte B-celpopulatie te identificeren. Een reeks cytometrie poorten werden bedacht om de doel geheugen B-cellen te isoleren (Figuur 1). Lymfocyten werden geïsoleerd op basis van hun Celgrootte en granulariteit met behulp van de waarnemingspunten forward Scatter (FSC) en side Scatter (SSC) in flow flowcytometrieonderzoeken6,7. Na uitsluiting van meerdere cellen ("doublets") en dode cellen, lieten fenotypische markeringen de scheiding van IgG+ geheugen B-cellen via IgG, CD19 (B-cel) en CD27 (geheugen). In deze benadering, de CD27 marker verspreidt zich niet in twee discrete populaties, zodat de Top 45% van CD27+ uitdrukken cellen zijn opgenomen voor de uiteindelijke poort. Tot slot, cellen dubbel-positief voor zowel APC en PE fluoroforen verdelen in de rechterbovenhoek kwadrant van de gating grafiek, wat reactiviteit aan beide gelabelde versies van peptiden. De cellen die binnen de getekende poort vielen, werden geïsoleerd en gesorteerd in afzonderlijke putjes van een 96-boorput. Het gebruik van antigeen met twee verschillende labels verhoogt de signaal-ruis verhouding en vermindert het aantal valse positieven in het daaropvolgende moleculaire biologie proces. De gesorteerde cellen vertegenwoordigden ongeveer 0,1% van de geheugen B-cellen in de uiteindelijke poort en 0,001% van het startcel monster.
De eerste uitlezen van het klonen van één cel is een bevestiging van de versterking van de respectieve zware en lichte variabele ketens (Figuur 2). Aangezien het gepaarde herstel van beide amplicons gewenst is, worden de PCR-reacties naast elkaar geëvalueerd op agarose-gel en worden de overeenkomende paren uit de uitgepakte gel-en DNA-fragmenten weggesneden. Typische efficiëntie van amplificatie is 30-50% zware ketting en 50-70% lichte (Kappa) keten. Herstel van gekoppelde amplicons is meestal tussen 25-40% efficiëntie. Deze efficiëntieverbeteringen variëren tussen donor Pools en de representatieve gegevens (Figuur 3) is een voorbeeld van zeer efficiënte versterking van 24 afzonderlijke cellen (42% gepaarde herstel). Na het klonen van IgG wordt de IgG-expressie vector omgezet in menselijke embryonale nier (HEK-293) suspensie cellen, die worden gebruikt om de expressie te maximaliseren. Het gebruik van serumvrij medium vermindert contaminerende eiwitten uit het recombinant antilichaam prep, en helpt bij het minimaliseren van ruis in daaropvolgende bindende testen. De herstelde antilichamen worden gescreend tegen het oorspronkelijke paneel van Tau peptiden en gescoord voor reactiviteit door ELISA (Figuur 4). Een initiële drempelwaarde van OD = 0,5 boven achtergrond wordt gebruikt om positieve antigeen reactiviteit aan te duiden, en β-actin eiwit wordt gebruikt als een controle voor niet-specifieke binding. Als de Flowcytometrie en sorteer stappen een gemengde pool van peptiden gebruiken, is de screening-ELISA de eerste stap om specifieke reactiviteiten van de herstelde Igg's te deconvoluten. Drie van de 10 IgGs controleerden de reactiviteit tegen gefosforyleerd CBTAU 22.1 peptide, en een was reactief tot niet-fosforyleerd CBTAU 27.1 (Figuur 4A). Aanvullende bevestiging werd voltooid met behulp van een concentratie curve van dezelfde recombinant antilichaam monsters tegen de peptiden geïdentificeerd in het beginscherm, en een extra peptide als een negatieve controle (Figuur 4B). Voor elke positieve treffer werd een individuele plasmide kloon geïsoleerd van de getransformeerde pool en opnieuw bevestigd door dezelfde ELISA-methode. Alleen kloon 34 wordt getoond van de gepresenteerde gegevens, en terwijl reactiviteit naar niet-fosforylated CBTAU 27.1 werd bevestigd, lagere affiniteit binding werd ook waargenomen met de fosforylated 27,1 peptide (Figuur 4C).
Figuur 1 : Isolatie van antigeen-reactieve enkelvoudige cellen via Flowcytometrie. A) afgebeeld is een representatief perceel waar de lymfocyten populatie zich binnen de getekende poort bevindt. B) poorten op basis van voorwaartse en zijspreiding (FSC-hoogte v FSC-breedte (R3); SSC-Height v SSC-width (R4)) werden gebruikt om doublets uit te sluiten. Alleen cellen binnen getekende hekken werden in volgende plots geëvalueerd. DAPI+ -cellen werden beschouwd als Dead en uitgesloten (R5). In dit experiment werden 3,7 x 107 "levende" cellen ondervraagd. De meerderheid van de levende cellen waren B-cellen (CD19+) en IgG+ -cellen (4,66%) werden geïsoleerd van deze populatie (R6). De top 43,2% van CD27+-uitdrukken geheugen cellen werden opgenomen in de Selection Gate (R7). (C) kwadrant 2 (Q2) bevatte cellen die reactief zijn voor beide gelabelde antigenen (peptide-APC v PEPTIDE-PE), en deze cellen werden gesorteerd en individueel teruggevonden in een 96-put. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : PCR-versterking herstelt IgG zware en lichte variabele sequentie voor klonen. (A) zowel zware (VH) als lichte (VK of VL) keten variabele regio's worden teruggewonnen met behulp van geneste PCR-reacties. Stap I-primers versterken de vooruitgang van de native Leader-sequentie en keren zich terug vanuit de constante regio. Meerdere pijlen vertegenwoordigen een pool van tussen 7-12 primers, die worden gebruikt om te zorgen voor een brede dekking van mogelijke germlines. Stap II-primers zijn genest, specifiek voor de uiterste uiteinden van het variabele open Lees frame, en voegen sequentie toe aan de uiteinden van de amplicons die homologe zijn voor de aangrenzende sequentie in de expressie vector. B) de linker bestaat uit de constante licht keten (CK of cl), gevolgd door de heavy Chain promoter en een niet-native signaal peptide sequentie. De versterkings-, linker-en plasmide ruggengraat worden tegelijkertijd geligd via overlappende homologe sequenties gegenereerd tijdens stap II PCR-versterking en geïsoleerd als een intact plasmide. De recombinante zware en lichte ketens in de uiteindelijke expressie vector worden gedreven door onafhankelijke (en identieke) CMV-promoters, en worden vertaald als afzonderlijke eiwitten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : IgG zware en lichte variabele keten amplicons worden teruggewonnen uit enkele cellen. De geneste PCR-reacties (stap II) werden direct geladen op 1% agarose gel en gevisualiseerd. Zware ketting (H) en Kappa lichte ketting (L) PCR-reacties uit dezelfde cel werden in aangrenzende putjes geladen, zodat de gekoppelde amplicons gemakkelijk werden waargenomen. Succesvolle zware en lichte keten producten zijn ongeveer 400 BP en 350 BP respectievelijk. Succesvol herstel van gepaarde amplicons wordt aangeduid met een (*). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Antigeen specificiteit wordt bevestigd door recombinante Igg's. Plasmiden met de herstelde zware en lichte ketting sequenties worden omgezet in HEK cellen voor expressie. Na vier dagen worden recombinant antilichamen beoordeeld op reactiviteit door ELISA. A) de IgG-concentratie in de geklaarde media werd gemeten en verdund tot 20 μg/ml. De pool van peptiden gebruikt voor het sorteren werden individueel beoordeeld met behulp van 40 pmol per put in streptavidine platen. Alle Igg's werden getest in dubbele putjes. B) KLONEN die OD450 meting > 0,5 werden weergegeven, werden opnieuw beoordeeld (klonen #32, #34, #35) met 1:5 verdunnings stappen tegen de in het scherm geïdentificeerde peptiden. C) eenmaal bevestigd als een hit, werd één plasmide kloon geïsoleerd van de kloon #34 getransformeerde ligaties, omgezet en opnieuw bevestigd door Elisa. Hetzelfde werd gedaan voor klonen #32 en #35 (gegevens niet weergegeven). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De hier gepresenteerde methode combineert flow cytometrie en het klonen van één cel, en de methoden die we hier beschrijven, zijn gebaseerd op methoden die eerder zijn ontwikkeld door Tiller en collega's11. Hun werk beschrijft het herstel en het klonen van monoklonale antilichamen om het B-celrepertoire bij de mens op het niveau van individuele cellen te bestuderen. We hebben de belangrijkste componenten van hun proces aangepast om de terugwinning van antigeen-specifieke monoklonale antilichamen uit een populatie van geheugen B-cellen, waaronder de multi-step amplificatie primer-strategie, mogelijk te maken. De belangrijkste modificatie is de toevoeging van gelabeld antigeen "aas". Er zijn aanvullende aanpassingen aangebracht aan het gepubliceerde protocol, met inbegrip van (maar niet beperkt tot) het wijzigen van de backbone van het klonen vector in een enkele uitdrukking plasmide, extra primer dekking van het kiembaan repertoire (zowel Leader sequence als kader 1), transfectie van suspensie HEK293 cellen voor hogere expressie, en het gebruik van High Fidelity polymerasen tijdens PCR-versterking.
Voor de methoden die hier worden beschreven, zijn de meest kritieke stappen in de buurt van de overgang tussen flowcytometry en klonen van één cel. Ten eerste is de juiste plaatsing van gesorteerde enkelvoudige cellen in de plaat essentieel. Het correct instellen van de drop-delay op de sorteerder is een belangrijke stap. Milieufactoren, zoals een lage luchtvochtigheid, moeten ook in aanmerking worden genomen, omdat we hebben vastgesteld dat onze herstel efficiëntie aanzienlijk daalt, tenzij er een statisch pistool wordt gebruikt op de doel Sorteer platen. Na plaatsing van de cel worden platen gecentrifugeerd om ervoor te zorgen dat cellen contact hebben opgenomen met de 10 μL buffer in de bodem van de putjes. Al deze maatregelen zijn van cruciaal belang voor het succes van de moleculaire biologie. Als de omstandigheden suboptimaal zijn voor de omgekeerde transcriptie reactie van een enkele cel, kan PCR-versterking van zelfs β-actin moeilijk zijn. De sterkte van de gepresenteerde methode is het vermogen om miljoenen cellen te ondervragen en alleen de methoden te sorteren die voldoen aan de reactiviteits criteria van het antigeen tegen het antigeen van de keuze. Dit vereist dat de signaal-ruis verhouding zo hoog mogelijk is, wat wordt gedaan door de aas-concentraties te optimaliseren voordat ze worden gesorteerd. Dubbel gelabeld aas wordt gebruikt om het herstel van vals-positieve cellen te verminderen, wat kan voorkomen als een van de fluoroforen een hoge achtergrond heeft. Met behulp van meer dan één antigeen aas kan het signaal te maken: ruis optimalisatie moeilijker, maar de mogelijkheid om meerdere peptiden tegelijkertijd te ondervragen is een ander voordeel van deze methode.
Wanneer de efficiëntie van het herstel laag is, wordt een set geneste β-actin-primers gebruikt om te bevestigen dat de sjabloon cDNA aanwezig is. Het nadeel van deze aanpak is dat het moeilijk is om te bepalen of er geen cel aanwezig was in de put of de omgekeerde transcriptie reactie mislukte, waardoor het oplossen van problemen moeilijk werd. Af en toe zal het tegenovergestelde gebeuren en de efficiëntieverbeteringen zijn hoger dan verwacht. Het typische herstel voor zware keten is tussen 30-45% en lichte ketens zijn hoger, tussen 40-60%. Elke PCR-reactie (stap I & II) gebruikt 50 cycli om te versterken van een enkele cel. Het grote aantal cycli van het totaal maakt deze methode ook vatbaar voor verontreiniging. Sequentieanalyse van amplicons kan worden gebruikt om te bepalen of een verontreiniging is geïntroduceerd, of een ongewoon hoog herstelpercentage is rechtmatig bereikt.
Het nut van deze methode om inheemse menselijke antilichamen tegen een antigeen keuze te herstellen heeft verschillende belangrijke beperkingen. Eerste, alleen oplosbare eiwitten die kunnen worden geëtiketteerd kunnen worden gebruikt als "aas" voor de stroom cytometrie. Voor de soorten gepresenteerd in de representatieve resultaten, gebruikten we een reeks gesynthetiseerde overlappende peptiden van Tau-eiwit, omdat het gebruik van het hele eiwit moeilijk bleek. Het gebruik van lineaire peptiden is waarschijnlijk niet optimaal, omdat het de identificatie van antilichamen tegen niet-lineaire of structurele epitopen kan beperken. We waren echter in staat om verschillende unieke antilichamen tegen tau te identificeren en deze worden momenteel verder geëvalueerd op8,9. Een andere beperking is de lage doorvoer van het herstel van de moleculaire biologie en het klonen van Igg's. De eerste Sorteer strategie maakt het mogelijk om miljoenen cellen te screenen, maar de daaropvolgende moleculaire biologie verwerking bestaat uit meerdere stadia. Voortdurende optimalisatie inspanningen om nieuwere technologieën te integreren, zoals Gibson assembly10 , hebben verschillende stappen gestroomlijnd, maar het knelpunt blijft het klonen van individuele zware en lichte ketting paren.
De methode "bselex" gebruikt de BCR, uitgedrukt op het oppervlak van geheugen B-cellen om cellen te identificeren die antigeen reactiviteit weergeven en deze afzonderlijke cellen vervolgens te herstellen via flow flowcytometrieonderzoeken11,12. Vanwege deze afhankelijkheid van de BCR, de methode is beperkt tot de Memory B cel compartiment, en neemt geen antilichaam afscheidende cellen (Asc's) zoals plasmablasten. Deze aanpak kan echter voordelig zijn om een breder repertoire van antigeen-specifieke bloed te herstellen in vergelijking met asc's. Influenza vaccinatie studies tonen aan dat, terwijl reactieve Asc's kunnen worden gedomineerd door een klein aantal geëxpandeerde B-celklonen, de antigeen-specifieke geheugen B-celpopulatie zelden klonale12is. De T Cell receptor (TCR) op het oppervlak van T-cellen bezit gelijkenissen met de B-celreceptor in genregeling en recombinatie om de diversiteit te maximaliseren. Eencellige benaderingen vergelijkbaar met wat wordt beschreven in de hier gepresenteerde methode zijn ontwikkeld voor de beoordeling van het T-celrepertoire, inclusief herstel en het klonen van één cel van Alfa-en bèta ketens13. De TCR-erkenning vereist echter dat peptiden worden gepresenteerd door MHC-moleculen, wat aanzienlijke complexiteit toevoegt aan de gelabelde aas-benadering om peptide-specifieke T-cellen te identificeren. In tegenstelling tot B-cellen ondergaan T-cellen geen affiniteit rijping van de gehele variabele regio, dus identificatie van de korte CDR3 regio en sommige flankerende sequentie is alles wat nodig is voor identificatie en reconstitutie. Ten slotte beschrijft deze methode de identificatie van IgG-moleculen met behulp van Flowcytometrie, maar het is ook mogelijk om alternatieve fenotypische markers te gebruiken om B-cellen van verschillende isotypes te identificeren.
Momenteel zijn er methoden die worden ontwikkeld om de enorme hoeveelheid gegevens die worden verzameld van de volgende generatie sequencing met functionele analyse van antigeen specificiteit te verbinden, maar deze methoden worden nog steeds verfijnd. Ondanks de beperkingen is de hier beschreven methode gebruikt om antilichamen met potentiële therapeutische waarde te identificeren voor zowel besmettelijke als niet-besmettelijke ziekten8,14,15, en vormt een betrouwbare aanpak om relevante antigeen-specifieke Igg's van mensen te herstellen, zonder uitgebreide manipulatie van B-cellen of uitgebreide celcultuur.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs willen Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia en Jeremy Macedo bedanken voor de uitgebreide testen van vele methode modificaties en verfijning van het huidige BSelex platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
- Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
- Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
- Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
- Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
- Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
- Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
- Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
- Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
- van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
- Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
- Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
- Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).
