Den BSelex metoden for å identifisere og gjenopprette individuelle antigen-spesifikke antistoffer fra humant perifere blod mononukleære celler kombinerer flyt flowcytometri med enkelt celle PCR og kloning.
Repertoaret av menneskelige antistoffer representerer en stor grad av de ubrukte kildene til terapeutiske antistoffer og nyttige biomarkører. Mens dagens beregningsorientert metoder, for eksempel neste generasjons sekvensering (NGS), gir enorme sett med data på antistoff repertoar på sekvens nivå, funksjonelle data er nødvendig for å identifisere hvilke sekvenser som er relevante for et bestemt antigen eller sett av Antigener. Her beskriver vi en metode for å identifisere og gjenopprette individuelle antigen-spesifikke antistoffer fra perifert blod mononukleære celler (Pbmc) fra en menneskelig blodgiver. Denne metoden utnytter en innledende berikelse av eldre B-celler og krever en kombinasjon av fenotypiske celle markører og fluorescensmerkete-merket protein for å isolere IgG minne B-celler via Flow flowcytometri. De tunge og lette kjede variabel regionene blir deretter klonet og re-skjermet. Selv om begrenset til minnet B celle rom, denne metoden utnytter Flow flowcytometri å avhøre millioner av B-celler og returnerer sammenkoblede tunge og lys kjede sekvenser fra en enkelt celle i et format klar for uttrykk og bekreftelse av spesifisitet. Antistoffer utvinnes med denne metoden kan vurderes for terapeutisk potensial, men kan også koble spesifisitet og funksjon med Bioinformatic tilnærminger for å vurdere B-cellen repertoar i individer.
Antistoffer er en voksende klasse av terapeutiske molekyler, og den eksisterende B-cellen repertoar i ethvert menneske er en potensiell kilde til slike antistoffer. Når utvinnes fra en menneskelig donor, de krever ingen tilpasning eller “menneskeliggjøring”, trinn som er nødvendig for antistoffer generert i andre dyre systemer. Det finnes flere metoder for identifisering og isolering av menneskelige antistoffer, inkludert B celle aktivering og spredning1, immortalization via EBV transformasjon2,3og generering av hybridoma cellelinjer4 ,5. Imidlertid krever alle disse metodene omfattende cellekultur til skjermen og gjenopprette antigen-spesifikke antistoffer. Informasjon om menneskets antistoff repertoar har blitt kraftig utvidet med utviklingen av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi, slik at identifisering av massive mengder individuelle sekvenser til stede i donor prøver. Men fordi NGS gir en likegyldig visning av alle sekvenser til stede, tillater det ikke for identifisering og isolering av antigen-spesifikke antistoffer, spesielt i tilfelle av sjeldne eller lavfrekvente antistoffer.
Formålet med “BSelex”-metoden er å identifisere antigen-spesifikke antistoffer fra sirkulerende perifere blod mononukleære celler i menneskelige donorer, og isolere og gjenopprette sekvenser av disse antistoffene for videre analyse. Denne metoden utnytter flyt flowcytometri og celle sortering å dra nytte av B-cellen reseptor (BCR) uttrykt på overflaten av minnet B-celler. Millioner av B-celler kan bli vist for antigen-spesifisitet via Flow flowcytometri før mer lav gjennomstrømming molekylærbiologi metoder er initiert. Sammenkoblet tung og lett kjede identifisering er ikke mulig i de fleste NGS-metoder, som analyserer celle sekvenser i bulk. I metoden beskriver vi her, celler er isolert individuelt, og sammenkoblet utvinning av både tunge og lette kjede sekvenser er mulig, som tillater direkte kloning og uttrykk for full IgG.
Metoden som presenteres her kombinerer flyt flowcytometri og enkel celle kloning, og metodene vi beskriver her vi basert på metoder som tidligere er utviklet av Tiller og kolleger11. Deres arbeid beskriver utvinning og kloning av monoklonale antistoffer for å studere B-cellen repertoar hos mennesker på nivå med individuelle celler. Vi har tilpasset de viktigste komponentene i prosessen deres for å tillate gjenvinning av antigen-spesifikke monoklonale antistoffer fra en populasjon av minne B-celler, inkludert multi-Step forsterkning primer strategi. Den store endringen er tillegg av merket antigen “agn”. Ytterligere tilpasninger er gjort i den publiserte protokollen, inkludert (men ikke begrenset til) å endre kloning vektoren ryggraden i et enkelt uttrykk plasmider, ytterligere primer dekning av germline repertoar (både leder sekvens og rammeverk 1), transfeksjoner av suspensjon HEK293 celler for høyere uttrykk, og bruk av High Fidelity polymerases under PCR forsterkning.
For metodene som beskrives her, er de mest kritiske trinnene nær overgangen mellom strømnings flowcytometri og enkel celle kloning. Først riktig plassering av sorterte enkeltceller inn i platen er avgjørende. Innstilling av drop-forsinkelsen riktig i sorteringen er et viktig trinn. Miljømessige faktorer, for eksempel lav luftfuktighet, må også tas i betraktning, som vi har funnet vår utvinning effektivitet falle betydelig med mindre en statisk pistol brukes på målet sortere platene. Etter celleplassering er platene sentrifugert for å sikre at cellene har kontaktet 10 μL av buffer i bunnen av brønnene. Alle disse tiltakene er avgjørende for at molekylærbiologi delen skal lykkes. Hvis forholdene er sub-optimale for omvendt transkripsjon reaksjonen av en enkelt celle, PCR forsterkning av selv β-utgangen kan være vanskelig. Styrken av metoden som presenteres er muligheten til å forhøre millioner av celler og bare sortere de som samsvarer med antigen reaktivitet kriterier mot antigen av valget. Dette krever at signal til støy-forhold er så høyt som mulig, noe som gjøres ved å optimalisere konsentrasjonen av agn før sortering. To-merket agn brukes til å redusere utvinningen av falske positive celler, som kan oppstå hvis en av fluorophores har høy bakgrunn. Bruke mer enn ett antigen agn kan gjøre signalet: støy optimalisering vanskeligere, men evnen til å forhøre flere peptider samtidig er en annen fordel med denne metoden.
Når utvinning effektivitet er lav, et sett med nestede β-utgangen primere brukes til å bekrefte at malen cDNA er til stede. Ulempen med denne tilnærmingen er at det er vanskelig å avgjøre om det var ingen celle tilstede i brønnen eller omvendt transkripsjon reaksjonen mislyktes, noe som gjør feilsøking vanskelig. Av og til det motsatte vil skje og effektiviteten er høyere enn forventet. Den typiske utvinningen for tunge kjeden er mellom 30-45% og lys kjeder er høyere, mellom 40-60%. Hver PCR-reaksjon (Step I & II) bruker 50 sykluser for å forsterke fra en enkelt celle. Det høye antallet totale sykluser gjør også denne metoden utsatt for forurensning. Sekvens analyse av amplicons kan brukes til å avgjøre om et miljøgifter er innført, eller en uvanlig høy utvinningsgrad er legitimt oppnådd.
Hjelpemidlet av denne metoden å komme seg innfødt Human Antistoffene imot en antigen av valget har adskillige betydelig begrensninger. Først, bare løselige proteiner som kan merkes kan brukes som “agn” for flyten flowcytometri. For sorterer presentert i representative resultater, brukte vi en rekke syntetisert overlappende peptider fra tau protein, siden bruke hele proteinet viste seg å være vanskelig. Bruk av lineære peptider er sannsynligvis ikke optimalt, siden det kan begrense identifisering av antistoffer mot ikke-lineære eller strukturelle epitopes. Men vi var i stand til å identifisere flere unike antistoffer mot tau og disse er for tiden gjennomgår ytterligere evaluering8,9. En annen begrensning er den lave gjennomstrømningen av molekylærbiologi utvinning og kloning av IgG. Den første sorterings strategien tillater screening av millioner av celler, men den påfølgende molekylærbiologi behandling består av flere etapper. Pågående optimalisering innsats for å innlemme nyere teknologi, slik som Gibson Assembly10 har strømlinjeformet flere trinn, men flaskehalsen forblir kloning individuelle tunge og lett kjede parene.
Den “BSelex” metoden utnytter BCR uttrykt på overflaten av minnet B celler for å identifisere celler som viser antigen reaktivitet, og deretter gjenopprette disse individuelle celler viaFlow flowcytometri. På grunn av denne avhengigheten av BCR, er metoden begrenset til minnet B celle rommet, og fanger ikke antistoff sekresjon celler (ASCs) som plasmablasts. Imidlertid kan denne tilnærmingen være en fordel å utvinne et bredere repertoar av antigen-spesifikke immunoglobins sammenlignet med ASCs. Influensa vaksinasjon studier viser at mens reaktive ASCs kan være dominert av et lite antall utvidet B celle kloner, er antigen-spesifikke minne B celle befolkning sjelden klonal12. T-celle reseptoren (TCR) på overflaten av T-celler har likheter med B-celle reseptoren i gen ordning og rekombinasjon for å maksimere mangfoldet. Enkelt celle tilnærminger som ligner på det som er beskrevet i metoden som presenteres her har blitt utviklet for å vurdere T-cellen repertoar, inkludert utvinning og enkel celle kloning av Alpha og beta kjeder13. Men, TCR anerkjennelse krever peptider skal presenteres av MHC molekyler, legge betydelig kompleksitet til merket agn tilnærming for å identifisere peptid-spesifikke T-celler. I motsetning til B-celler, gjør T-celler ikke gjennomgår affinitet modning av hele variabelen regionen, slik identifisering av den korte CDR3 regionen og noen flankerer sekvensen er alt som kreves for identifisering og rekonstituering. Til slutt, denne metoden beskriver identifisering av IgG molekyler ved hjelp av Flow flowcytometri, men det er også mulig å bruke alternative fenotypiske markører for å identifisere B-celler av ulike isotypes.
Foreløpig er det metoder som utvikles for å koble den enorme mengden data som samles inn fra neste generasjons sekvensering med funksjonell analyse av antigen spesifisitet, men disse metodene er fortsatt å være raffinert. Til tross for sine begrensninger, metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å identifisere antistoffer med potensiell terapeutisk verdi for både smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer8,14,15, og representerer en pålitelig tilnærming til å gjenopprette relevante antigen-spesifikke IgG fra mennesker, uten omfattende manipulering av B-celler eller omfattende cellekultur.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia, og Jeremy Macedo for omfattende testing av mange metode modifikasjoner og foredling av dagens BSelex plattformen.
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
CO2 incubator (Multitron) | |||
Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |