BSelex-metoden för att identifiera och återställa enskilda antigen-specifika antikroppar från mänskliga perifert blod mononukleära celler kombinerar flödescytometri med Single cell PCR och kloning.
Den humana antikropprepertoaren representerar en i stort sett outnyttjad källa till potentiella terapeutiska antikroppar och nyttiga biomarkörer. Medan nuvarande beräkningsmetoder, såsom nästa generations sekvensering (NGS), ger enorma mängder data på antikropprepertoaren på sekvensnivå, krävs funktionella data för att identifiera vilka sekvenser som är relevanta för en viss antigen eller uppsättning av Antigener. Här beskriver vi en metod för att identifiera och återvinna enskilda antigen-specifika antikroppar från perifera mononukleära blodceller (PBMCs) från en mänsklig blodgivare. Denna metod utnyttjar en initial berikning av mogna B-celler och kräver en kombination av fenotypiska cell markörer och fluorescently-märkt protein för att isolera IgG minne B celler via flödescytometri. Den tunga och lätta kedjan variabla regioner är sedan klonade och åter skärmad. Även begränsad till minne B cell facket, denna metod utnyttjar flödescytometri att förhöra miljontals B-celler och returnerar Parade tunga och lätta kedjesekvenser från en enda cell i ett format redo för uttryck och bekräftelse av specificitet. Antikroppar som återvinns med denna metod kan övervägas för terapeutisk potential, men kan också koppla specificitet och funktion med bioinformatiska metoder för att bedöma B-cellrepertoaren inom individer.
Antikroppar är en växande klass av terapeutiska molekyler, och den befintliga B-cellrepertoaren i någon människa är en potentiell källa till sådana antikroppar. När de återvinns från en mänsklig givare, de kräver ingen anpassning eller “humanisering”, åtgärder som krävs för antikroppar som genereras i andra djur system. Det finns flera metoder för identifiering och isolering av humana antikroppar, inklusive B-cellsaktivering och proliferation1, i via EBV-Transformation2,3och generering av Hybridomteknik-cellinjer4 ,5. Emellertid, alla dessa metoder kräver omfattande cellodling för att avskärma och återvinna antigen-specifika antikroppar. Information om människans antikropps repertoar har utökats kraftigt med utvecklingen av Next generation sekvensering (NGS) teknik, vilket möjliggör identifiering av massiva mängder av enskilda sekvenser som finns i givar prov. Men eftersom NGS ger en agnostiker bild av alla sekvenser som finns, det tillåter inte för identifiering och isolering av antigen-specifika antikroppar, särskilt när det gäller sällsynta eller lågfrekventa antikroppar.
Syftet med metoden “BSelex” är att identifiera antigen-specifika antikroppar från cirkulerande perifera mononukleära blodceller i humana donatorer, och isolera och återvinna sekvenser av dessa antikroppar för vidare analys. Denna metod utnyttjar flödescytometri och cell sortering för att utnyttja B-cellreceptorn (BCR) uttryckt på ytan av minnet B-celler. Miljontals B-celler kan screenas för antigen-specificitet via flödescytometri innan de mer låg genomflödet molekylärbiologiska metoder initieras. Ihopparad tung och lätt kedja identifiering är inte möjligt i de flesta NGS metoder, som analyserar cellsekvenser i bulk. I den metod som vi beskriver här isoleras cellerna individuellt, och ihopkopplad återhämtning av både tunga och lätta kedje sekvenser är möjlig, vilket möjliggör direkt kloning och uttryck av hela IgG.
Den metod som presenteras här kombinerar flödescytometri och Single cell kloning, och de metoder vi beskriver här bygger vi på metoder som tidigare utvecklats av Tiller och kollegor11. Deras arbete beskriver återhämtning och kloning av monoklonala antikroppar för att studera B-cellrepertoaren hos människor på individ cellernas nivå. Vi har anpassat de viktigaste komponenterna i deras process för att möjliggöra återvinning av antigen-specifika monoklonala antikroppar från en population av minne B-celler, inklusive multi-Step amplifiering primer strategi. Den stora modifieringen är tillsatsen av märkt antigen “bete”. Ytterligare anpassningar har gjorts i det offentliggjorda protokollet, inklusive (men inte begränsat till) ändring av ryggraden i klonings vektorn till ett enda uttryck plasmid, ytterligare primer täckning av köns cells repertoar (både Leader sekvens och RAM 1), transfektion av suspension HEK293 celler för högre uttryck, och användning av HiFi-polymeraser under PCR amplifiering.
För de metoder som beskrivs här är de mest kritiska stegen nära övergången mellan flödescytometri och enkel cell kloning. Först, rätt placering av sorterade enstaka celler i plattan är viktigt. Att ställa in dropp fördröjningen korrekt på Sorteraren är ett avgörande steg. Miljöfaktorer, såsom låg luftfuktighet, måste också beaktas, eftersom vi har funnit vår återhämtning effektivitet sjunka betydligt om inte en statisk pistol används på mål sorterings plattorna. Efter cell placering centrifugeras plattorna för att säkerställa att cellerna har kontaktat 10 μL buffert i botten av brunnarna. Alla dessa åtgärder är avgörande för att molekylärbiologi portion ska lyckas. Om förutsättningarna är suboptimala för omvänd Transkription av en enda cell kan PCR-amplifiering av även β-Actin vara svårt. Styrkan i den metod som presenteras är förmågan att förhöra miljontals celler och bara sortera de som matchar antigen reaktivitet kriterier mot antigen val. Detta kräver att signal-brus-förhållandet är så högt som möjligt, vilket görs genom att optimera betes koncentrationen före sortering. Dual-märkta bete används för att minska återhämtningen av falskt positiva celler, vilket kan inträffa om en av de fluoroforer har hög bakgrund. Använda mer än en antigen bete kan göra signalen: buller optimering svårare, men förmågan att förhöra flera peptider samtidigt är en annan fördel med denna metod.
När återhämtnings effektiviteten är låg används en uppsättning kapslade β-Actin primers för att bekräfta att cDNA-mallen finns. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att det är svårt att avgöra om det inte fanns någon cell som finns i brunnen eller omvänd Transkription reaktionen misslyckades, vilket gör felsökning svårt. Ibland kommer motsatsen att inträffa och effektivitetsvinsterna är högre än väntat. Den typiska återhämtningen för tung kedja är mellan 30-45% och lätta kedjor är högre, mellan 40-60%. Varje PCR-reaktion (steg I & II) använder 50 cykler för att förstärka från en enda cell. Det stora antalet cykler gör också denna metod mottaglig för kontaminering. Sekvensanalys av amplikonerna kan användas för att avgöra om ett främmande ämne har införts, eller en ovanligt hög återvinningsgrad har legitimt uppnåtts.
Nyttan av denna metod för att återvinna infödda mänskliga antikroppar mot ett antigen val har flera betydande begränsningar. Först kan endast lösliga proteiner som kan märkas användas som “bete” för flödescytometri. För de typer som presenteras i representativa resultat, använde vi en serie syntetiserade överlappande peptider från tau-protein, eftersom användning av hela proteinet visat sig svårt. Användningen av linjära peptider är sannolikt inte optimal, eftersom det kan begränsa identifieringen av antikroppar mot icke-linjära eller strukturella epitoper. Men vi kunde identifiera flera unika antikroppar mot Tau och dessa genomgår för närvarande ytterligare utvärdering8,9. En annan begränsning är den låga genomströmningen av molekylärbiologisk återhämtning och kloning av IgGs. Den ursprungliga sorterings strategin möjliggör screening av miljontals celler, men den efterföljande molekylärbiologiska bearbetningen består av flera stadier. Pågående optimering ansträngningar för att införliva nyare teknik, såsom Gibson Assembly10 har effektiviserat flera steg, men flaskhalsen förblir kloning enskilda tunga och lätta kedje par.
Metoden “bselex” utnyttjar BCR uttryckt på ytan av minnet B-celler för att identifiera celler som visar antigen reaktivitet, och sedan återvinna dessa enskilda celler via flödescytometri11,12. På grund av detta beroende av BCR, metoden är begränsad till minne B cell facket, och inte fånga antikroppar utsöndring celler (ASCs) såsom plasmabjumbor. Detta tillvägagångssätt kan dock vara fördelaktigt att återvinna en bredare repertoar av antigen-specifika immunoglobins jämfört med ASCs. Influensavaccination studier visar att även reaktiva ASCs kan domineras av ett litet antal expanderade B-cellkloner, den antigen-specifika minne B cellpopulation är sällan klon12. T-cellreceptorn (TCR) på ytan av T-celler besitter likheter med B-cellreceptorn i gen arrangemang och rekombination för att maximera mångfalden. Single cell-metoder som liknar vad som beskrivs i den metod som presenteras här har utvecklats för att bedöma T-cellrepertoaren, inklusive återhämtning och Single cell kloning av alfa-och beta kedjor13. Emellertid, TCR erkännande kräver peptider som skall presenteras av MHC molekyler, lägga till betydande komplexitet till den märkta bete strategi för att identifiera peptid-specifika T-celler. Till skillnad från B-celler, T-celler inte genomgår affinitet mogningen av hela variabel regionen, så identifiering av den korta CDR3 regionen och vissa kompletterande sekvens är allt som krävs för identifiering och beredning. Slutligen beskriver denna metod identifieringen av IgG-molekyler med flödescytometri, men det är också möjligt att använda alternativa fenotypiska markörer för att identifiera B-celler av olika isotyper.
För närvarande finns det metoder som utvecklas för att ansluta den enorma mängd data som samlats in från nästa generations sekvensering med funktionell analys av antigen specificitet, men dessa metoder är fortfarande förfinas. Trots sina begränsningar har den metod som beskrivs här använts för att identifiera antikroppar med potentiellt terapeutiskt värde för både smittsamma och icke-smittsamma sjukdomar8,14,15, och utgör en tillförlitlig metod för att återvinna relevanta antigen-specifika IgGs från människor, utan omfattande manipulation av B-celler eller omfattande cellkultur.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia, och Jeremy Macedo för omfattande tester av många metodändringar och förfining av den nuvarande BSelex plattformen.
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
CO2 incubator (Multitron) | |||
Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |