Summary
在这里,我们提出了一个协议,以精确形成血源内皮,从人类多能干细胞在馈送和异种条件下。该方法在治疗性化合物的疾病建模和筛选中有着广泛的应用。
Abstract
从人类多能干细胞(PSCs)中提取功能性造血干细胞和祖细胞(HSPCs),是治疗血液学和恶性疾病的自体移植的一个难以捉摸的目标。造血内皮(HE)是一个可调节的平台,通过转录因子产生功能性HSPCs或以稳健的方式诱导淋巴细胞。然而,目前派生HE的方法要么成本高,要么产量变化。在此协议中,我们建立了一种经济高效、精确的方法,在无馈线和异种定义的条件下在 4 天内得出 HE。由此产生的HE经历了内皮到造血的过渡,并产生了CD34+CD45+造血造物原代。我们平台在生成功能性HSPCs方面的潜在能力将在疾病建模和治疗化合物筛查方面得到广泛应用。
Introduction
血液学和免疫学疾病新疗法的开发因缺乏可靠的疾病建模平台和来自患者的自体造血干细胞 (HSC) 的高通量药物筛查而受阻多能干细胞。诱导(i)PSC技术的突破有望从患者细胞中模拟疾病,但从患者iPSC中建立功能性HSC一直难以实现。为了从人类PSC获得HSC,胚胎模式和转录程序的正确诱导是关键1,2,3,4,5,6, 7,8.造血发育的最新进展表明,造血内皮(HE)在HSC开发中的作用9。他可以从PSC诱导,并适合下游干预,如基因转移10,11,12,13。以HE为平台,结合5个转录因子(ERG、HOXA5、HOXA9、LCOR、RUNX1)的组合,成功地诱导了长期移植并分化成多个谱系的功能HSC。然而,从PSC生成多变和低效的HE,阻碍了细胞的系统操作和分析,以及现成的生产和大规模诱导用于临床的造血细胞。
在这里,我们描述了一种经济高效且精确的方法,在 4 天内通过无进料和异种定义条件得出 HE。在这种方法中,在iMarix-511上球形形成和自发再扁平化可确保PSC菌落的一致密度,这对HE细胞的有效诱导至关重要。
Protocol
1. 试剂
- 细胞系(人类PSCs):获得胚胎干细胞(ESCs)或iPSC系409B2和201B7(317-9)和CBA11。
-
试剂制备
- PSC 电镀介质:将 PSC 维护介质与 10 μM Y-27632 混合,并储存在 4°C 下。
- PSC 类球形切片介质:在使用前将 PSC 维护介质与 625*1,250 纳克/mL 人体重组拉米宁-511 E8 片段(LM511-E8)(取决于细胞系)混合。
注:LM511-E8 可在介质15中混合。其他基质,如全长拉米宁-511需要预涂,即使这样做,它们也不会维持在分化过程中粘附的中皮器官。 - 第 0 天分化介质:将美生皮基础培养基与 2 μM CHIR99021、80 纳克/mL骨形态遗传蛋白 4 (BMP4) 和 80 纳克/mL 血管内皮生长因子 (VEGF) 混合。
- 第2天分化介质:将造血基基培养基与1μM SB431542、80纳克/mL VEGF和100纳克/mL干细胞因子(SCF)混合。
- 在没有钙或镁的情况下制备磷酸盐缓冲盐(PBS)(参见材料表)。
- 1 mM 乙烯二甲酸 (EDTA) 缓冲液:将 1 mL 的 0.5 m EDTA 添加到 500 mL 的 PBS 中。
- EHT介质:将血泊基基介质与50纳克/mL SCF、20纳克/mL血栓形成素(TPO)、50纳克/mL Fms相关的酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、20纳克/mL白细胞介素-6/英莱金-6受体(α(IL-6/IL-IL-6R)混合使用。胰岛素转移-硒-乙醇胺、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素/氨热素B。
- FACS缓冲液:将PBS与2%的胎儿小牛血清和1 mM EDTA混合。
- 准备磁分离缓冲器(见材料表)。
- 制备甲基纤维素基培养基(见材料表)。
2. PSC殖民地形成
- 在 mTeSR1 中,在 mTeSR1 中,在具有5% CO2的培养箱中将 hPSC 增长至 70 ± 80% 的汇合。
-
PSC 分离(第 4 天)
- 吸出介质,用PBS清洗细胞两次。用解散溶液冲洗细胞。在37°C孵育15分钟(细胞在此期间不会干燥)。
- 将细胞悬浮在PSC维护介质中,将悬浮液转移到适当大小的管中,并在200 x g下离心3分钟。
- 将PSC悬浮液以48,000~70,000个细胞cm-2(取决于细胞系)的密度镀在微造塑料容器上,并在37°C培养箱中孵育过夜,CO2为5%。
注:我们建议在96孔微制塑料容器中100μL孔-1的细胞悬浮液。你通常会在96孔的盘子里播种20,000个细胞-1,以产生大约100个球体。 -
平铺 PSC 球形LM511-E8(第-3天)
- 使用 P1000 微管轻轻移液,将 PSC 球体收集到 15 mL 锥形管中,让球体在室温下站立 2 分钟,以重力沉淀。吸气上清液。
- 悬浮在球形电镀介质中,将悬浮液放入密度为4球体厘米-2的非涂层6孔培养板中,在37°C培养箱中培养5%CO2三天。
3. 造血诱导(第0天)
- 吸气介质,在37°C培养箱中加入Day0分化介质和培养,5%O2和5%CO2(缺氧培养箱)。
- 在Day0分化介质中经过两天的培养,吸出介质,然后在缺氧培养箱中加入Day2分化介质和文化。
4. 血原内皮分离(第4天)
- 两天后,吸气中,用PBS清洗细胞两次。用解散溶液冲洗细胞。在 37°C 培养箱中孵育,用 5% CO2孵育 30 分钟。
- 轻轻悬浮1 mM EDTA中的细胞,使其分离到单细胞水平,将悬浮液转移到50 mL锥形管中,并在200 x g下离心细胞3分钟。缓冲区。
- 加入100 μL的CD34+微珠,轻轻移液。在室温下孵育30分钟。每100μL CD34+珠子可使用多达2000万个细胞。
- 通过 40 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。
- 使用磁性分离器分离 CD34+细胞。
5. 内皮到造血转化的诱导
-
纤维内丁涂层
- 通过在PBS中稀释1mg/mL纤维化剂,制备所需的5μg/mL纤维化涂层溶液。
- 将 0.5 mL 的涂层溶液分配到 24 孔培养板的每个孔中。在室温下孵育板30分钟。
- 在200 x g下将分类的CD34+细胞离心3分钟,将细胞颗粒悬浮在1 mL的EHT培养基中。
- 使用细胞计数器确定可行的细胞密度。通过添加 EHT 培养基将细胞密度调整到 200,000 个细胞 mL-1。
- 吸气并丢弃纤维内膜涂层良好的涂层溶液。将 0.5 mL 的 CD34+细胞悬浮液放入每个纤维素涂层孔中。
- 在缺氧培养箱中孵育一周。
6. 造血细胞的流细胞测定分析
- 浮动单元格集合:将培养基转移到15 mL锥形管中。在200 x g下离心介质3分钟。吸气上清液。
-
坚持单元格集合
- 用0.5 mL的PBS清洗细胞两次。
- 用分离溶液冲洗细胞,吸出多余的液体。
- 在37°C培养箱中孵育板5分钟。
- 在 1 mL 的 FACS 缓冲区中重新悬浮细胞。
- 混合浮动细胞和附着细胞。
- 在200 x g下使细胞离心3分钟。吸气上清液。在 50 μL 的 FACS 缓冲器中重新悬浮。在黑暗中,用抗CD34和抗CD45抗体孵育细胞1小时。
- 用PBS清洗细胞两次,在200 x g下离心3分钟。吸气下清液,用0.5 μg/mL 4',6-二酰胺-2-苯林醇重新悬浮在0.5 mL的FACS缓冲液中。
- 通过流量细胞计测量 CD34 和 CD45 表达式。
7. 细胞形成单元(CFU)血细胞测定
- 造血细胞集合:将培养基从培养体转移到 15 mL 锥形管。用 PBS 轻轻冲洗井两次。
- 在200 x g下使细胞离心3分钟。吸气上清液。在 1 mL 的 EHT 介质中重新悬浮。使用单元格计数器确定单元格编号。
- 将相当于10,000个细胞的悬浮量添加到3 mL的甲基纤维素基培养基中,辅以抗生素,并与16G或18 G注射器混合5次。
- 将整个甲基纤维素基介质悬浮液放入6孔板的每个孔中。
- 在37°C培养箱中孵育,用5%CO2孵育两周,同时保持湿润。请勿打扰盘子。殖民地对运动敏感。
- 两周后,在显微镜下数殖民地。
Representative Results
图1A描述了形成PSC菌落的示意图。PSC球体在微制塑料容器上形成一天。作为代表性的结果,每96孔微制造塑料容器可以处理20,000个409B2细胞,尽管其他细胞系可能需要更高的密度(每96孔微制造塑料容器30,000-40,000个细胞)。当在 LM511-E8 的存在下被镀在培养皿上时,这些球体会自发地扁平化为几乎二维的培养体。
图1B显示了造血诱导原理图。当PSC菌落增长到直径为750μm时,介质按顺序改变以诱导中皮器官。PSC菌落将在分化至中皮器官过程中逐渐成为阳光向上的结构,通过连续的介质变化,直到第4天。在第4天,血源内皮从中皮有机体中通过磁分法指定,随后在EHT介质中镀到纤维素上。5-1000万CD34+CD45-细胞预计来自含有100万个PSC的球体(图1C)。
观察细胞形态从内皮细胞向造血细胞变化(补充视频1)。图2A显示了造血原细胞在第7天用造血鸡尾酒刺激时的代表性相对比图像。造血细胞群落在培养中出现。
具有代表性的流式细胞测定图如图2B所示。整个文化被造血鸡尾酒刺激,并在第7天通过流式细胞学分析CD34和CD45的表达。造血祖细胞表达CD34和CD45。
CFU测定显示,从CD34+ CD45+ 造血祖细胞(图2C)生成颗粒细胞/巨噬菌落。 估计菌群数为每10,000个细胞38 CFU-G/M(图2D)
图1:平铺PSC菌落的原理图,以及随后通过造血内皮的造血性分化。(A) 形成PSC殖民地的原理过程.PSC 维护在 PSC 维护介质中的 LM511-E8 涂层 6 孔板上。在第-4天,细胞分离并分离到单细胞水平,使用分离溶液,随后在PSC维护介质中用Y-27632镀在微制造塑料容器上,并在一夜之间培养成球体。在第 3 天,球体在 PSC 维护介质中镀有 LM511-E8,并培养三天。到了第 0 天,球体被自发地扁平化为几乎二维的文化。刻度条 = 200 μm . (B) 在第 0 天,介质被 Day0 分化介质替换,并在低氧培养箱中培养。在分化的第 2 天,介质被第 2 天分化介质替换。在造血内皮富集的第4天,CD34+细胞在EHT培养基纤维涂层12孔板上进行磁分和培养,为期6天。(C) CD45和CD34表达的代表性流细胞学图,第4天细胞按CD34排序。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:造血性特性分析。(A) 第7天用造血鸡尾酒刺激后造血祖细胞的代表性相对比图像。刻度棒 = 200 μm . (B) CD45 的代表性流式细胞学图,CD34 在第 7 天用造血鸡尾酒刺激时表达整个文化。(C) 第11天造血原细胞产生的粒细胞/巨噬细胞群的代表性相对比图像。刻度条 = 500 μm . (D) 每 10,000 个细胞的 CCF 数量。请点击此处查看此图的较大版本。
补充视频 1:EHT 视频。请点击此处下载此文件。
Discussion
我们的无馈线和异种定义感应方法提供了一个精确且经济高效的平台,以可扩展的方式诱导 HE 细胞。在常规协议10、11、12、13、14中,由于对PSC菌群密度和大小缺乏精确控制,血原内皮形成的忠实形成,影响形态原/细胞因子定向分化的效率。从常规协议中,我们在每个独立批次中都经历了造血内皮诱导的不一致。新方案对PSC菌群密度和尺寸进行严格调节,克服了造血内皮诱导的不一致性。
我们利用球体的制服形成,随后在总共4天内传达了无馈线和异种的确定条件,形成HE。我们确认使用三个独立的细胞系,球形形成确保HE细胞的一致形成。作为代表性的结果,409B2细胞系在三个独立实验的基础上产生了12.7%-23.6%CD34+细胞效率。平铺 PSC 球体的关键因素是 LM511-E8。我们不建议用其他矩阵替换,例如在我们的经验中,Matrigel 或全长拉米宁产品。我们体验到,间皮器官很容易从母体分离,并在分化过程中丢失。而且,没有预涂层,Matrigel 或全长拉米宁都不会锚定细胞。
该协议的潜在限制是,我们依靠 PSC 维护介质来维护 PSC。我们已经测试了其他介质,如StemFit,但我们妥协了造血诱导。在我们的短时间(4天)诱导协议中,细胞可能抵抗从多能状态退出。如果在其他介质中维护PSC,我们建议在PSC维护介质中调整细胞,并在分化前进行几个通道。该平台将允许对细胞进行系统操作和分析,并生产出现成和大规模诱导造血细胞,供潜在的临床使用。该系统的一个长期目标是在人化小鼠模型中模拟免疫缺陷疾病,以研究负责任的细胞和分子机制,并进行药物筛选。
Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢李爱丽和本诺精工的技术援助。我们还要感谢渡边昭一女士提供行政援助,感谢彼得·卡拉吉安尼斯博士编辑了这份文件。这项工作得到了日本医学研究和发展机构(AMED)(M.K.S.)的再生医学实现研究中心网络iPS细胞研究中心的核心支持。利用。AMED (17935423) [M.K.S.] 和日本科学技术厅创新中心项目 (R.O. 和 M.K.S.) 的特异性 iPS 细胞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
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