Summary
Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.
Abstract
Pluripotente stamcellen bieden een groot potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en ziekte en voor regeneratieve geneeskunde. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot het genereren van hartcellen uit pluripotente stamcellen, is het onduidelijk of de twee cardiale velden-de eerste en tweede hart velden (FHF en SHF)-worden geïnduceerd in pluripotente stamcellen systemen. Om dit aan te pakken, genereerden we een protocol voor in vitro specificatie en isolatie van hartveld-specifieke cardiale stamcellen. We gebruikten embryonale stamcellen lijnen die Hcn4-GFP en Tbx1-CRE; Rosa-offerte reporters van de FHF en de SHF, respectievelijk, en levende cel immunokleuring van de celmembraan eiwit Cxcr4, een SHF marker. Met deze aanpak genereerden we voorlopercellen die de functionele eigenschappen en transcriptoom van hun in vivo recapituleren. Ons protocol kan worden gebruikt om vroege specificatie en scheiding van de twee hart gebieden te bestuderen en kamer-specifieke hartcellen voor de modellering van de hartkwaal te produceren. Aangezien dit een in vitro organite systeem is, kan het geen nauwkeurige anatomische informatie verstrekken. Echter, dit systeem overwint de slechte bereikbaarheid van gastrulation embryo's en kan worden opgeschaald voor high-throughput schermen.
Introduction
Het gebruik van pluripotente stamcellen (psc's) heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van cardiale regeneratie en gepersonaliseerde geneeskunde met patiënt-specifieke myocytes voor ziektemodel lering en drugs therapieën1,2,3, 4. meer recentelijk, in vitro protocollen voor de generatie van atriale VS ventriculaire evenals pacemaker-achtige PSC-afgeleide cardiomyocytes zijn ontwikkeld5,6. Echter, of cardiogenesis kan worden herschapen in vitro om cardiale ontwikkeling te bestuderen en vervolgens te genereren ventriculaire kamer-specifieke cardiale cellen is nog steeds onduidelijk.
Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, mesodermaal cellen onder invloed van afgescheiden morphogens zoals BMP4, Wnts en Activin een vorm van de primitieve streak7. Cardiale mesodermaal cellen gekenmerkt door de expressie van Mesp1, migreren naar voren en de laatste tijd om de hart sikkel en vervolgens de primitieve hart buis7,8te vormen. Deze migrerende groep van cellen omvat twee zeer verschillende populaties van cardiale stamcellen (cpc's), namelijk de eerste en de tweede hartveld (fhf en SHF)9,10. Cellen uit de SHF zijn zeer proliferative en trekkende en zijn primair verantwoordelijk voor de rek-en lus van de hart buis. Bovendien, SHF cellen differentiëren tot cardiomyocytes, fibroblasten, gladde spieren en endothelial cellen als ze in het hart buis om de rechter ventrikel, rechter ventrikel uitstroom tractus en een groot deel van beide atria7,10te vormen. In tegenstelling, FHF cellen zijn minder proliferatie en trekkende en differentiëren vooral om cardiomyocytes als ze aanleiding geven tot de linker ventrikel en een kleiner deel van de atria11. Bovendien SHF progenitoren worden gekenmerkt door de expressie van Tbx1, FGF8, FGF10 en Six2, terwijl fhf cellen Express Hcn4 en Tbx511, 12,13,14,15.
Psc's kan aan alle drie kiem lagen en later aan om het even welk type van cel in lichaam4,16onderscheiden. Daarom bieden ze een enorm potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en voor het modelleren van specifieke ontwikkelingsstoornissen resulteert in aangeboren hart-en vaatziekten, de meest voorkomende oorzaak van aangeboren afwijkingen17. Een grote subgroep van aangeboren hartziekte omvat kamer-specifieke cardiale afwijkingen18,19. Nochtans, is het nog onduidelijk of deze uit abnormale hart gebiedsontwikkeling voortkomen. Bovendien, gezien het onvermogen van cardiomyocytes te vermenigvuldigen na de geboorte, zijn er uitgebreide inspanningen om cardiale weefsel te creëren voor hart regeneratie1,7,20. Gezien de fysiologische en morfologische verschillen tussen hartkamers, is het genereren van kamer-specifieke cardiale weefsels met behulp van Psc's van groot belang. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot een robuuste generatie van cardiale cellen van Psc's, is het nog onduidelijk of de twee hart velden kunnen worden geïnduceerd in PSC-systemen.
Om recapituleren cardiogenesis in vitro en de studie van de specificatie en de eigenschappen van cpc's, hebben we eerder gebruik gemaakt van een systeem op basis van differentiëren PSC-afgeleide cardiale sferoïden21,22,23,24. Onlangs hebben we gegenereerd muis embryonale stamcellen (mESCs) met GFP en offerte verslaggevers onder de controle van de FHF gen Hcn4 en de SHF gen Tbx1, respectievelijk (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP) 25. In vitro gedifferentieerde mESCs gevormd cardiale sferoïden waarin GFP + en offerte + cellen verschenen uit twee verschillende gebieden van mesodermaal cellen en patroon in een complementaire wijze. De resulterende GFP + en offerte + cellen tentoongesteld FHF en SHF kenmerken, respectievelijk, bepaald door RNA-sequencing en klonale analyses. Belangrijk is, met behulp van mESCs die de Isl1-offerte Reporter (mESCIsl1-offerte), ontdekten we dat SHF cellen getrouw werden gekenmerkt door de cel-oppervlakte-eiwit CXCR4, en dit kan de isolatie van hartgebied-specifieke cellen mogelijk te maken zonder transgenen. Het huidige protocol beschrijft de generatie en isolatie van hart-specifieke Cpc's van mESCs, die als waardevol instrument kunnen dienen voor het bestuderen van kamer-specifieke hartziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: In vitro generatie van hartgebied-specifieke muis hart voorlopercellen (Figuur 1).
1. onderhoud van de muis Ser's
- Grow mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP, MESCISL1-offerte)25 op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium (870 ml van GLASCOW minimale essentiële medium (GMEM), 100 ml foetale boviene serum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml niet-essentiële aminozuren, 10 ml natrium pyruvaat, 3 l van Beta-mercaptoethanol, 20 l van LIF (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 en 0,1 μM PD0325901).
- Wanneer de cellen bereiken 70-80% samenvloeiing, spoel de cellen een keer met fosfaatbuffer Solution (PBS) en vervolgens te scheiden in enkele cellen door toevoeging van 1 mL trypsine en incubatie bij 37 ° c voor 3 min.
- Neutraliseren trypsine door toevoeging van 4 mL van 10% FBS in Dulbecco gemodificeerde Eagle medium (DMEM). Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller.
- Centrifuge ~ 3 x 105 cellen voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.
- Aspireren de bovendrijvende, de cellen opnieuw op te schorten in 5 mL 2i medium en replate op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven voor onderhoud.
2. generatie van cardiale stamcellen met behulp van cardiale Sferoïden
- Centrifugeer 2,5 x 106 cellen van stap 1,3 voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.
- Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in 25 mL SFD medium (105 cellen/ml). Afhankelijk van de schaal van het experiment, kan het mESC nummer dienovereenkomstig worden aangepast.
Opmerking: SFD medium bevat 715 mL van het Iscove gemodificeerde Dulbecco medium (IMDM), 250 mL van de F12 van de ham, 5 mL N2-supplement, 10 mL B27 minus vitamine A, 5 mL 10% (w/v) BSA (in PBS), 7,5 mL GlutaMAX en 7,5 mL penicilline-streptomycine. Voeg ascorbinezuur (50 mg/mL) en 3,9 x 10-3% (v/v) van monothioglycerol voorafgaand aan het gebruik. - Plaat de cel schorsing in 1 150 mm x 25 mm steriele plaat en Incubeer bij 37 ° c in de 5% CO2 incubator voor 48 h. cardiale sferoïden moet worden gevormd binnen 24 uur.
- Verzamel alle gevormde cardiale sferoïden en centrifugeren voor 3 min bij 145 x g en kamertemperatuur om selectief te isoleren sferoïden en te voorkomen dat enkele cellen.
- Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de sferoïden in 25 mL SFD medium met 1 ng/mL van Activin A en 1,5 ng/mL BMP4 voor differentiatie inductie. Plaat de sferoïden in dezelfde 150 mm x 25mm steriele plaat en incubeer ze bij 37 °C in de 5% CO2 incubator voor 40 h.
Opmerking: Verschillende concentraties van Activin A (0-3 ng/mL) en BMP4 (0,5-2 ng/mL) kunnen worden gebruikt voor differentiatie optimalisatie afhankelijk van de mESC lijn. - Verzamel alle hart sferoïden en centrifugeer voor 3 min bij 145 x g en kamertemperatuur.
- Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de sferoïden in 25 mL SFD medium. Breng de opnieuw gesuspendeerde EBs over in een ultra-lage bevestigings 75 cm2 kolf en broed ze bij 37 °c in de 5% Co2 incubator voor 48 h.
3. isolatie van hartgebied specifieke cardiale stamcellen met behulp van TL-Reporters
- Centrifugeer cardiale sferoïden bij 145 x g en kamertemperatuur voor 3min en aspireren de bovendrijvende. Voeg 1 mL trypsine toe en Incubeer bij 37 °C voor 3 min. Meng goed door te pipetteren om de cellen te scheiden.
- Voeg 4 mL 10% FBS in DMEM toe om trypsine te deactiveren en meng goed door pipetten. Voor het verwijderen van de niet-gescheiden EBs, filter de mix met behulp van een 70 mm zeef en centrifugeer de gefiltreerde cellen voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur.
- Om Cpc's te sorteren die fluorescente verslaggevers dragen (Cpc's voortgekomen uit mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP), aspireren de bovendrijvende en voeg 500 l van FACS Sorteer oplossing toe (1% (v/v) FBS, 200 mm Hepes en 10 mm EDTA in PBS) om opnieuw op te schorten.
- Voor het verwijderen van alle cel clusters voorafgaand aan het sorteren, filter de cellen opnieuw met behulp van een 5 mL polystyreen ronde bodem buis met een 40 μm cel zeef. Houd de cellen op het ijs tot het sorteren.
- Sorteer de cellen te isoleren Tbx1-CRE; Rosa-offerte en HCN4-GFP positieve Cpc's met behulp van een fluorescerende geactiveerde cel Sorter (FACS). Verzamel de gesorteerde cellen in 1 mL FBS. Houd de cel monster en gesorteerd cellen op 4 ° c.
4. isolatie van hartgebied specifieke cardiale stamcellen met behulp van Cxcr4 als een cel oppervlakte eiwit marker
- Te isoleren eerste VS tweede hartveld Cpc's gebaseerd op de expressie van het oppervlak eiwit receptor Cxcr4, gebruik maken van de mESCIsl1-offertelijn. Aspireren de bovendrijvende uit stap 3,3 en hersuspendeer de enkelvoudige Cpc's in 300 l van 10% FBS in PBS met 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 geconjugeerd anti-Cxcr4 antilichaam.
- Incubeer bij kamertemperatuur voor 5min en wassen door toevoeging van 1-2 mL koude PBS. Centrifugeer de enige Cpc's voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur en was nog twee keer gevolgd door centrifugeren.
- Aspireren de bovendrijvende en voeg 500 l van FACS Sorteer oplossing toe om de enkelvoudige Cpc's en filter te hersuspenderen als in stap 3,4.
- Isoleer Cxcr4 + en Cxcr4-cellen met behulp van FACS. Verzamel de gesorteerde cellen in 1 mL FBS. Houd de cel monster en gesorteerd cellen op 4 ° c.
5. analyse van geïsoleerde hartgebied specifieke hart voorlopercellen
- Centrifugeer gesorteerde Cpc's voor 3 min bij 270 x g en kamertemperatuur. De gesorteerde cellen kunnen voor gen en eiwit uitdrukkings analyses worden gebruikt of zij kunnen voor analyses op recentere tijdpunten worden hercultiveerd.
- Om re-cultuur geïsoleerde Cpc's, aspireren de bovendrijvende, de cellen opnieuw op te schorten in SFD medium en replate ~ 3 x 104 cellen per put van een 384-well plaat bekleed met 0,1% (w/v) gelatine. Als verhoogde celdood na het sorteren wordt genoteerd, voeg 10 μM van Y-27632 (rots inhibitor) aan het monster toe. Twee dagen na de recultuur, spontane kloppen moet worden opgemerkt.
- Om de capaciteit van plated Cpc's te analyseren om aan cardiomyocytes te onderscheiden, verzamel de cellen bij dag 12 van differentiatie. Gebruik trypsine zoals beschreven in stappen 1.2-1.5 om enig CMs te isoleren. hersuspendeer de cellen in 4% (w/v) Paraformaldehyde (middel) en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur om de cellen vast te zetten.
- Centrifugeer de cellen voor 3 min bij 895 x g, en kamertemperatuur. Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in PBS om het te wassen. Herhaal deze stap nogmaals.
- Aspireren de bovendrijvende en de cellen opnieuw op te schorten in 10% FBS in PBS. Incubeer de helft van de cel monster met de muis anti-troponine T antilichaam (1:500) en gebruik de rest van het monster als een negatieve controle. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen tweemaal zoals beschreven in stap 5,4 gebruikend PBS. Aspireren de bovendrijvende en hersuspenderen beide cel monsters in 10% FBS in PBS met 1:500 Donkey anti-Mouse IgG (H + L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647 geconjugeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal met PBS zoals in stap 5,6. Aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer de cellen in 200 l van PBS. Gebruik een flow cytometer om de cellen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na ongeveer 132 h van differentiatie, Tbx1-offerte en Hcn4-GFP Cpc's kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorescerende Microscoop (Figuur 2). Over het algemeen, GFP en offerte cellen verschijnen ongeveer rond dezelfde tijd. De twee populaties van Cpc's blijven groeien in de nabijheid en vaak in een complementair patroon. Aanpassing van de concentraties van Activin A en BMP4 zal veranderen de percentages van FHF VS SHF Cpc's (Figuur 3). De CPC-specificatie in vitro werd voornamelijk bepaald door de concentratie van BMP4. Daarom kan ons cardiale sferoïde systeem worden gebruikt om de CPC-specificatie te bestuderen.
Ook met behulp van de Isl1-offerte reporter mESC lijn, na 132 h van differentiatie, Isl1-offerte + Cpc's verschijnen. Na immunokleuring van Cpc's voor CXCR4, Isl1-offerte +, Cxcr4 + VS Isl1-offerte +, kunnen Cxcr4-cellen worden geïsoleerd (Figuur 4).
Voor het analyseren van het vermogen van mESC-afgeleide Cpc's te differentiëren tot cardiomyocytes, immunokleuring voor cardiale troponine T kan worden uitgevoerd op dag 12 van differentiatie. In overeenstemming met het model dat de cellen van FHF hoofdzakelijk aan myocytes onderscheiden, zijn de cellen die uit Hcn4-GFP + Cpc's worden afgeleid hoofdzakelijk myogene (Figuur 5A, B). Evenzo, cellen afgeleid van Isl1 +, CXCR4-Cpc's ook aanleiding geven tot cardiomyocytes op veel hogere percentages in vergelijking met Isl1 +, CXCR4-Cpc's (Figuur 5C).
Af en toe, mESCs niet efficiënt te differentiëren en vormen zeer lage aantallen hartgebied-specifieke Cpc's (Figuur 6).
Figuur 1 : Schematische weergave van in-vitro specificatie van hartgebied-specifieke hart voorlopercellen. mESCs vorm sferoïden binnen 48 h. Dan zal de blootstelling aan Activin A en BMP4 voor 40 h leiden tot mesodermaal inductie. De hart voorlopercellen ontwikkelen zich ongeveer 36 h later. Progenitoren van de tweede of eerste hartveld kan worden gesorteerd met behulp van fluorescerende geactiveerde cel sorteren. Tweede hartveld cellen worden gekenmerkt door Tbx1-offerte expressie versus eerste hartveld dat wordt gekenmerkt door Hcn4-GFP. Als alternatief, Isl1-offerte markeert Cpc's en het gebruik van Live immunokleuring tegen Cxcr4 men kan sorteren Isl1 +, Cxcr4 + VS Isl1 +, Cxcr4-Cpc's dat de tweede VS eerste hartveld cellen vertegenwoordigen respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Representatief beeld van cardiale sferoïden na CPC-specificatie. OFFERTE markeert Tbx1 + en GFP Marks Hcn4 + Cpc's. De twee cellen populaties worden gevormd in de nabijheid in een gratis patroon. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Flow flowcytometrische analyse van cardiale sferoïden na blootstelling aan verschillende concentraties van Activin A en BMP4. Het aanpassen van de concentraties van de twee morphogens leidt tot verschillende percentages van Tbx1 + en Hcn4 + Cpc's. De twee populaties werden voornamelijk beïnvloed door het aanpassen van de BMP4 concentratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Flow flowcytometrische analyse van cardiale stamcellen uitdrukken Isl1 en zijn immunostained voor Cxcr4. Cardiale progenitoren waren eerste gated gebaseerd op hun Isl1 expressie en vervolgens Isl1 +, Cxcr4 + VS Isl1 +, Cxcr4-cellen werden gesorteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Flow flowcytometrische analyse van cellen afgeleid van hartgebied-specifieke cpc's gekleurd voor cardiale troponine T. (A) in overeenstemming met de hogere myogene potentieel van fhf cellen, een hoog percentage van HCN4-GFP + cellen differentiëren tot myocytes. Banalyse van alle mESC cardiomyocytes, waarbij de overgrote meerderheid HCN4-GFP + is. (C) Cxcr4-cpc's differentiëren tot een hoger percentage van cardiomyocytes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Representatieve flowcytometrische analyses van mislukte/lage efficiency in vitro differentiaties. (A) flow Cytometry analyse na 132 h van differentiatie die geen vorming van HCN4-GFP cellen en een zeer laag percentage van TBX1-offerte + cellen toont. (B) lage differentiatie efficiëntie van mESCs uitdrukken zeer lage niveaus van Isl1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In ons protocol beschrijven we een methodologie om cardiale sferoïden en geïsoleerde hartveld-specifieke Cpc's te genereren. Die kunnen worden gebruikt om mechanismen van CPC-specificatie en hun eigenschappen te bestuderen, evenals voor cardiale kamer-specifieke ziektemodel lering. Één eerder gepubliceerd werk gebruikte een mESC lijn met twee fluorescente verslaggevers (Mef2c/Nkx 2.5) om cardiogenesis in vitro te bestuderen, echter, worden beide markeringen uitgedrukt bij embryonale dag 9.5-10 wanneer cardiomyocytes reeds26worden gevormd. Aan onze kennis, zijn er momenteel geen methodes voor de isolatie van hartgebied-specifieke Cpc's in vitro. Wat nog belangrijker is, kan ons protocol ook op menselijke stamcellen worden toegepast, waar CXCR4 kan worden gebruikt om SHF Cpc's te isoleren die hoge niveaus van Isl125uitdrukken. Bovendien kan onze dubbele, fluorescente verslaggever mESC lijn aan scherm bibliotheken van samenstellingen en transcriptiefactoren worden gebruikt die de specificatie van het hartgebied of de polariteit van de cel in Cpc's kunnen beïnvloeden.
Een van de kritieke stappen in het protocol is het beginnummer van mESCs. Het gebruiken van lage of hoge aantallen zal beduidend de grootte van hart sferoïden en differentiatie efficiency beïnvloeden. Wij raden het testen van verschillende cel nummers (7,5-10 x 104 cellen/ml) voor verschillende mESC lijnen. Als alternatief, als de grootte van de cardiale sferoïden blijft significant variabel, platen met putten met microgoeds van de opgegeven grootte kan ook worden gebruikt om de reproduceerbaarheid te verhogen. Onderzoekers moeten ook rekening houden met de specifieke timing en de duur van mesodermaal inductie, alsmede de timing van de cel sorteren. Bovendien, voor verschillende mESC lijnen, zal de optimalisering van de morphogen concentraties voorafgaand aan het testen van hun capaciteit moeten worden uitgevoerd om Cpc's in cardiale sferoïden te produceren. Het gebruik van oudere/verstreken cytokines of cel cultuurmedium, of inconsistente concentraties van morphogens zal invloed hebben op de differentiatie efficiëntie. Ten slotte, mESC lijnen die zijn doorgegeven voor meer dan ~ 15-20 keer, lijken te verliezen hun vermogen om efficiënt te differentiëren.
Ons differentiatie systeem maakt specifieke modificaties mogelijk. Cxcr4 kan als enige teller van SHF Cpc's in mESC lijnen zonder een fluorescente verslaggever worden gebruikt. Nochtans, zouden de onderzoekers het differentiatie protocol nog moeten optimaliseren om het percentage van Isl1 + Cpc's te verhogen voorafgaand aan het sorteren van Cxcr4 + versus Cxcr4-Cpc's25. Bovendien kan Activin A met canonieke WNT agonisten/activators zoals Wnt3a of CHIR99021 (GSK3b inhibitor) worden vervangen om de specificatie van SHF Cpc's25verder te verhogen.
Dit protocol maakt de studie van de CPC-specificatie met behulp van welomschreven voorwaarden, time-lapse monitoring en onbeperkt aantal cellen. Zo is het gemakkelijker, efficiënter en minder kostbaar in vergelijking met het analyseren van embryo's. Toch is het nog steeds een in vitro systeem waar de absolute genexpressie waarden van hart-veld specifieke Cpc's niet nauw kunnen correleren met in vivo genexpressie niveaus. Zo, in ons systeem, alleen BMP4 kunnen specificeren Cpc's van beide hart velden en kan aanzienlijk veranderen hun respectieve ratio's. Daarnaast kan variabiliteit bestaan met betrekking tot de differentiatie efficiency.
Samenvattend, gebruikend mESC fluorescente verslaggever lijnen of immunokleuring van de proteïnen van het celmembraan, gerecapituleerd wij cardiogenesis in vitro en geïsoleerde hartgebied-specifieke Cpc's. Dit maakt de studie van de vroege signalen die bemiddelen CPC-specificatie en functionele eigenschappen, alsmede modellering hartgebied/kamer-specifieke aangeboren hartziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets voor de onthullingen.
Acknowledgments
E. T. werd ondersteund door de magie die telt en AHA. C. K. werd gesteund door toelagen van NICHd/NIH (R01HD086026), AHA, en MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E.
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
