Summary
מטרת שיטה זו היא לייצר תאים ספציפיים לשדה הלב בחלל החוץ בתוך מבחנה כדי ללמוד את המפרט תא מחולל ותכונות פונקציונלי, וליצור תאי לב מסוימים בחדר לדגמי מחלות לב.
Abstract
תאי גזע פלאוריטי מציעים פוטנציאל רב להבנת התפתחות לב ומחלות ולרפואה רגנרטיבית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לייצר תאים לב מתאי גזע פלאוריטי, זה לא ברור אם שני שדות הלב-הראשון והשני שדות הלב (FHF ו SHF)-הם המושרה במערכות מערכות גזע רב עוצמה pluripotent ובידוד של תאים. ספציפיים לשדה-הלב השתמשנו בתאי גזע עובריים הנושאים Hcn4-GFP ו Tbx1-היצורים; רוזה-RFP כתבים של FHF ואת SHF, בהתאמה, ואת החיסוני לחיות התאים של הקרום התא חלבון Cxcr4, סימן SHF. עם גישה זו, יצרנו תאים מחולל קדמון אשר לכידה של המאפיינים הפונקציונליים ואת ההמרה של שלהם vivo עמיתיהם. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מנוצל כדי ללמוד מוקדם מפרט והפרדה של שני שדות הלב וליצור תאי לב ספציפיים לחדר לדגמי מחלות לב. מאחר שזוהי מערכת ארגונית מחוץ למערכת, ייתכן שהיא אינה מספקת מידע אנטומי מדויק. עם זאת, מערכת זו גוברת על הנגישות הירודה של עוברי הבמה והוא יכול להיות מוקטן עבור מסכי תפוקה גבוהה.
Introduction
השימוש בתאי גזע פלאוריטי (PSCs) יש מהפכה בתחום התחדשות הלב ורפואה אישית עם מיציטים ספציפיים לחולה עבור מידול מחלות וטיפולים בסמים1,2,3, 4. לאחרונה, בפרוטוקולי חוץ גופית עבור דור של פרפור לעומת המוח, כמו גם קוצב לב PSC-הקרדיוציטים הנגזר פותחו5,6. עם זאת, אם cardiogenesis ניתן ליצור מחדש בתחום החוץ כדי ללמוד את התפתחות הלב ולאחר מכן ליצור החדרית תאי הלב ספציפיים לחדר עדיין לא ברור.
במהלך ההתפתחות העובריים המוקדמת, התאים המזושים תחת השפעת מורגנים מופרשים כגון BMP4, Wnts ופעילות בצורה פרימיטיבית7. תאים מזופנים לב מסומנים על-ידי הביטוי של Mesp1, להעביר למטה ולמטה ליצור את הסהר הקרדיולוגית ולאחר מכן את צינור הלב הפרימיטיבי7,8. זו קבוצת הנדידה של תאים כולל שתי אוכלוסיות נפרדות מאוד של תאים מחולל לב (cpcs), כלומר הראשון ואת שדה הלב השני (fhf ו shf)9,10. תאים מן SHF הם מתרבים מאוד נדידה והם אחראים בעיקר התארכות ולולאה של צינור הלב. בנוסף, תאים shf להבדיל הקרדיוציטים, פיברותקיעות, שריר החלקה ותאים אנדותל כפי שהם נכנסים לצינור הלב כדי ליצור את החדר הימני, מערכת הכניסה הבין-חדרית הימנית ואת החלק הגדול של שתי האטריה7,10. לעומת זאת, תאים fhf הם מתרבים פחות הנדידה ולהבדיל בעיקר הקרדיוציטים כפי שהם מעניקים לחדר שמאל וחלק קטן יותר של אטריה11. יתר על כן, shf ושלתי מסומנים על ידי הביטוי של Tbx1, FGF8, FGF10 וSix2 בעוד fhf תאים express Hcn4 ו Tbx511,12,13,14,15.
PSCs יכול להבדיל לכל שלוש שכבות הנבט ולאחר מכן כל סוג תא בגוף4,16. לכן, הם מציעים פוטנציאל עצום להבנת התפתחות הלב ולמידול פגמים התפתחותיים ספציפיים כתוצאה ממחלת לב מולדים, הגורם השכיח ביותר למומים מולדים17. תת קבוצה גדולה של מחלת לב מולדים כולל ליקויים בתאי הלב הספציפיים18,19. עם זאת, עדיין לא ברור אם אלה מקורם בפיתוח שדה לב חריג. בנוסף, בהינתן חוסר היכולת של הקרדיוציטים להתרבות לאחר הלידה, היו מאמצים נרחבים ליצור רקמת לב להתחדשות הלב1,7,20. בהתחשב ההבדלים הפיסיולוגיים ומורפולוגיים בין תאי לב, הדור של רקמת הלב ספציפי לחדר באמצעות PSCs הוא בעל חשיבות משמעותית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לדור חזק של תאי לב מ PSCs, זה עדיין ברור אם שני שדות הלב יכול להיות המושרה במערכות PSC.
כדי לcardiogenesis את המפרט והמאפיינים של cpcs, השתמשנו בעבר מערכת מבוססת על ההבחנה PSC-נגזרות לב הנגזרים21,22,23,24. לאחרונה, שיצרנו תאים גזע מעובריים של העכבר (mESCs) עם כתבים GFP ו-RFP תחת שליטה של FHF gene Hcn4 ואת הגן SHF Tbx1, בהתאמה (mESCsTbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP) 25. ב מתורבת הבדיל mESCs יצר spheroids לב שבו GFP + ו RFP התאים הופיעו משני אזורים ברורים של תאים מזועורי ומתבנית באופן משלים. התאים המתקבלים GFP + ו RFP + הציגו FHF ו SHF מאפיינים, בהתאמה, נקבע על-ידי רצפי RNA וניתוחים שבטיים. חשוב מכך, באמצעות mESCs נושאים את הכתב Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), גילינו כי תאים shf היו מסומנים בנאמנות על ידי חלבון פני השטח התאים CXCR4, וזה יכול לאפשר בידוד של תאים ספציפיים לשדה הלב ללא טרנסגנים. הפרוטוקול הנוכחי יתאר את הדור והבידוד של CPCs לשדה הלב ספציפיים מ mESCs, אשר עשוי לשמש כלי רב ערך ללימוד מחלת לב מסוימת לחדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בדור מחוץ לתחום של לב שדות העכבר הספציפיים לשדה הלב (איור 1).
1. תחזוקה של ESCs העכבר
- לגדול mESCs (mESCsTbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP, mescISL1-rfp)25 על 0.1% (w/v) ג'לטין מצופה T25 מבחנות ב 2i בינונית (870 ml של מדיום חיוני מינימלי של הפרה (gfp) 100 ml של סרום העוברי (Fbs), 10 מ ל של גלוטמקס, 10 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 10 מ ל נתרן פירובט, 3 μL של בטא-mercaptoethanol, 20 μL של חיי (200 U/mL), 0.3 μM CHIR99021 ו 0.1 μM PD0325901).
- כאשר התאים מגיעים 70-80% המפגש, לשטוף את התאים פעם אחת עם פתרון מאגר פוספט (PBS) ולאחר מכן לנתק לתוך תאים בודדים על ידי הוספת 1 מ ל טריפסין ו דגירה ב 37 ° c עבור 3 דקות.
- נטרל את טריפסין על ידי הוספת 4 מ ל של 10% FBS בינונית הנשר המתוקנת של דולבקה (DMEM). ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
- צנטריפוגה ~ 3 x 105 תאים עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
- מריף את supernatant, להשעות מחדש את התאים 5 מ ל של 2i בינונית ו resuspend על 0.1% (w/v) הג מצופה T25 מבחנות עבור תחזוקה.
2. הדור של בתאי מחולל לב באמצעות מספרי כדוריות הלב
- צנטריפוגה 2.5 x 106 תאים משלב 1.3 עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
- משף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את התאים בגודל 25 מ ל של בינונית-SFD (105 תאים/mL). בהתאם לקנה המידה של הניסוי, ניתן לכוונן מספר mESC בהתאם.
הערה: המדיום SFD מכיל 715 מ ל של Iscove של מדיום שונה של המדיום (IMDM), 250 מ ל של בשר חזיר, 5 מ ל של N2-תוספת, 10 מ ל של B27 מינוס ויטמין A, 5 מ ל 10% (w/v) BSA (ב PBS), 7.5 מ ל של גלוטמקס ו 7.5 mL של פניצילין הוסף חומצה אסקורבית (50 mg/mL) ו 3.9 x 10-3% (v/v) של מוניוגליצרול לפני השימוש. - צלחת התא ההשעיה לתוך 1 150 mm x 25 מ"מ צלחת סטרילית ו מודקת ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה עבור 48 h. יש ליצור בתוך 24 h הרואידים לב.
- לאסוף את כל שנוצרו spheroids לב וצנטריפוגה עבור 3 דקות ב 145 x g וטמפרטורת החדר כדי לבודד באופן סלקטיבי spheroids ולהימנע תאים בודדים.
- מורידים את הסופרנטאנט ומשגרות את הספרואידים ב -25 מ ל של מדיום בינוני עם 1 ng/mL של פעילות A ו 1.5 ng/mL של BMP4 עבור אינדוקציה בידול. צלחת spheroids באותו 150 mm x 25mm הצלחת סטרילי ו מודקת אותם ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה עבור 40 h.
הערה: ריכוזים שונים של פעילות (0-3 ng/mL) ו BMP4 (0.5-2 ng/mL) ניתן להשתמש עבור מיטוב בידול בהתאם לקו mESC. - לאסוף את כל spheroids לב צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 145 x g וטמפרטורת החדר.
- מורידים את הסופרנטאנט ומשגרות את הספרואידים ב -25 מ ל של המדיום. העבר את בס מחדש מצורף אולטרה נמוך 75 ס מ2 בקבוקון ו-דגירה אותם ב 37 ° צ' בחממה 5% CO2 עבור 48 h.
3. בידוד של שדה הלב בתאי לב ספציפיים באמצעות כתבים פלורסנט
- ב145 x g ובטמפרטורת החדר במשך שלושה מינימום ומורידים את הסופרנטאנט. הוסיפו 1 מ ג לטריפסין ולדגירה ב 37 ° c למשך 3 דקות. ערבב היטב על ידי ליטוף כדי לנתק את התאים.
- הוסיפו 4 מ ל של 10% FBS ב-DMEM כדי להשבית את טריפסין ולערבב היטב על ידי ליטוף. כדי להסיר את בס שאינו מנתק, לסנן את התמהיל באמצעות מסננת 70 מ"מ ו צנטריפוגה את התאים filtrated עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
- כדי למיין מחשבי CPCs הנושאים כתבים פלורסצנט (CPCs הנגזרים מ-MESCs Tbx1. . רוזה-ראFP HCN4-GFP), משלחים את סופרנטאנט ומוסיפים 500 μL של פתרון מיון FACS (1% (v/v) FBS, 200 MM HEPES ו 10 מ"מ של EDTA ב PBS) כדי להשעות מחדש.
- כדי להסיר את כל אשכולות התא לפני מיון, לסנן את התאים שוב באמצעות 5 מ"ל קלקר עגול-בתחתית עם מסננת תא 40 יקרומטר. לשמור על התאים בקרח עד מיון.
- מיין את התאים כדי לבודד Tbx1. רוסה-RFP ו-HCN4-GFP חיוביים מחשבים באמצעות מסדר פלורסנט המופעל התא (FACS). לאסוף את התאים ממוין 1 mL של FBS. שמור את דגימת התא והתאים הממוינים ב-4 ° c.
4. בידוד של שדה הלב מסוים בתאים מחולל לב באמצעות Cxcr4 כסמן חלבון משטח התא
- כדי לבודד הראשון לעומת שדה לב השני CPCs מבוסס על הביטוי של קולטן חלבון פני השטח Cxcr4, השתמש בשורה mESCIsl1-RFP. משלחים את supernatant משלב 3.3 ולהשעות מחדש את CPCs בודד 300 μL של 10% FBS ב-PBS המכיל 1:200 (vol/vol) PerCP-efor 710 Cxcr4 מצועם נגד הנוגדן.
- דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5min ולשטוף על ידי הוספת 1-2 mL של הקרים PBS. צנטריפוגה את CPCs יחיד עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים יותר פעמים ואחריו צנטריפוגה.
- לייבש את supernatant ולהוסיף 500 μL של פתרון מיון FACS להשעות מחדש את CPCs היחיד ולסנן כמו בשלב 3.4.
- בידוד Cxcr4 + ו-Cxcr4-תאים באמצעות FACS. לאסוף את התאים ממוין 1 mL של FBS. שמור את דגימת התא והתאים הממוינים ב-4 ° c.
5. ניתוח של שדות לב מבודדים בשדה הלב תאים
- צנטריפוגה מיון CPCs עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש בתאים ממוינים עבור ניתוחים של גנים וביטויים בחלבון או שהם יכולים להיות מתורבתים לניתוח בנקודות זמן מאוחרות יותר.
- כדי מחדש תרבות מבודדת CPCs, מרוב את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב-SFD בינונית ו resuspend ~ 3 x 104 תאים לכל טוב של 384-באר צלחת מצופה עם 0.1% (w/v) ג'לטין. אם מוות התאים מוגבר הוא ציין לאחר מיון, להוסיף 10 μM של Y-27632 (סלע מעכב) למדגם. יומיים לאחר התרבות החוזרת יש לציין הכאה ספונטנית.
- כדי לנתח את היכולת של CPCs מצופה להבדיל לקרדיוציטים, לאסוף את התאים ביום 12 של בידול. השתמש בטריפסין כמתואר בצעדים 1.2-1.5 כדי לבודד CMs יחיד. השהה את התאים ב-4% (w/v) פאראפורמלדהיד (בחצי הט) ו דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
- צנטריפוגה את התאים עבור 3 דקות ב 895 x g, וטמפרטורת החדר. ומשהה את התאים ב-PBS. כדי לשטוף את הליגת העל חזור על שלב זה פעם נוספת.
- ולהשעות את התאים. ב -10% בערוץ הPBS החלק השני של מדגם התא עם נוגדנים אנטי Troponin T העכבר (1:500) ולהשתמש בשאר המדגם כפקד שלילי. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטוף את התאים פעמיים כפי שמתואר בשלב 5.4 באמצעות PBS. משלחים את supernatant ולהשעות את שתי דגימות התא ב 10% FBS ב PBS עם 1:500 חמור נגד העכבר IgG (H + L) נוגדן משני, אלקסה Fluor 647 המשלים. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לרחוץ פעמיים עם PBS כמו בשלב 5.6. ולהשעות את התאים. ב200 μL של הערוץ החדש השתמש cytometer זרימה כדי לנתח את התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר כ 132 h של בידול, Tbx1-RFP ו-Hcn4-GFP מחשבים ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (איור 2). באופן כללי, תאים GFP ו-RFP מופיעים בערך באותו זמן. שתי האוכלוסיות של CPCs ממשיכות להתרחב בסמיכות ובדרך כלל בתבנית משלימה. התאמת ריכוזי הפעילות הBMP4 תשנה את האחוזים של FHF לעומת SHF CPCs (איור 3). מפרט CPC במבחנה נקבע בעיקר על ידי ריכוז של BMP4. לכן, המערכת שלנו לב ספרואיד ניתן להשתמש כדי ללמוד מפרט CPC.
באופן דומה, באמצעות הכתב Isl1-RFP כתבת mESC, לאחר 132 h של בידול, Isl1-RFP + CPCs מופיעים. לאחר כתמים חיסוני של CPCs עבור CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + לעומת Isl1-RFP +, Cxcr4-תאים יכול להיות מבודד (איור 4).
כדי לנתח את היכולת של ה-CPCs נגזר להבדיל לקרדיוציטים, כתמים חיסוני הלב Troponin T ניתן לבצע ביום 12 של בידול. בהסכם עם המודל כי תאים FHF להבדיל בעיקר מיציטים, תאים הנגזרים מ-Hcn4-GFP + CPCs הם בעיקר מיוגניים (איור 5א, ב). באופן דומה, תאים הנגזרים מ Isl1 +, CXCR4-CPCs גם מעניקים לקרדיוציטים באחוזים גבוהים הרבה יותר בהשוואה ל-Isl1 +, CXCR4-CPCs (איור 5ג).
לעיתים, mESCs לא מצליחים להבדיל בצורה יעילה וליצור מספרים נמוכים במיוחד לשדה הלב (איור 6).
איור 1 : ייצוג סכימטי של מפרט חוץ-גופית של תאי לב מיוחדים בשדה הלב. mESCs הטופס spheroids בתוך 48 h. לאחר מכן, החשיפה לפעילות הBMP4 בשביל 40 h תוביל לאינדוקציה מזובית. תאים מחולל לב מתפתחים כ-36-h מאוחר יותר. ושלתי של שדה הלב השני או הראשון יכול להיות ממוין באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט. תאי שדה הלב השני מסומנים על ידי Tbx1-RFP ביטוי לעומת שדה הלב הראשון המסומנים על ידי Hcn4-GFP. לחילופין, Isl1-RFP סימנים CPCs ושימוש חיסוני חיים נגד Cxcr4 אחד יכול למיין Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-CPCs המייצגים השני לעומת בתאי שדה הלב הראשון בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : דמות מייצגת של הרורואידים לב לאחר מפרט CPC. מרכאות RFP Tbx1 + ו-GFP Hcn4 + CPCs. שתי אוכלוסיות תאים נוצרות בסמיכות בדפוס חינם. קנה מידה של סרגלים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ניתוח ציטומטלי זרימה של בדיקת מחלות לב לאחר חשיפה לריכוזים שונים של פעילות וBMP4. כוונון ריכוזי שני הורקוגנים מוביל לאחוזים שונים של Tbx1 + ו-Hcn4 + CPCs. שתי האוכלוסיות הושפעו בעיקר על ידי התאמת ריכוז BMP4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ניתוח ציטומטלי זרימה של תאים מחולל לב ומבטא Isl1 ומוכתם בCxcr4. ושלתי לב היו מגודרת הראשון מבוסס על הביטוי Isl1 שלהם ולאחר מכן Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4 תאים ממוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : ניתוח ציטומטט זרימה של תאים שמקורם בשדה הלב-CPCs ספציפיים מוכתם לב Troponin T. (A) עקבי עם הפוטנציאל מיוגני גבוה יותר של תאים fhf, אחוז גבוה של HCN4-gfp + תאים להבדיל מיאלוציטים. (ב) ניתוח של כל הקרדיוציטים הנגזרות מידי, שבו הרוב המכריע הם HCN4-gfp +. (ג) Cxcr4-cpcs להבדיל אחוז גבוה יותר של הקרדיוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : ניתוח הסייציטומטי הנציג של יעילות שנכשלה/נמוכה בתחומי החוץ. (א) זרימה cyHcn4 try ניתוח לאחר 132 h של בידול מראה שום היווצרות של תאים-gfp ואחוז נמוך מאוד של TBX1-rfp + תאים. (ב) הרמת יעילות נמוכה של mESCs מבטאת רמות נמוכות מאוד של Isl1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת מידרואידים קרדיולוגית ומבודדים בשדה הלב הייחודיים של ה-CPCs. ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מנגנונים של מפרט CPC ותכונותיהם, כמו גם לדגמי מחלות ספציפיות לתאי לב. אחת העבודות שפורסמו בעבר השתמשו בשורה mESC עם שני כתבים פלורסנט (Mef2c/Nkx 2.5) כדי ללמוד cardiogenesis בתחום החוץ, עם זאת, שני סמנים אלה מבוטא ביום עובריים 9.5-10 כאשר הקרדיוציטים כבר הקימו26. לידיעתך, כרגע אין שיטות לבידוד של CPCs ספציפיים לשדה הלב בתחום החוץ. חשוב יותר, הפרוטוקול שלנו יכול גם להיות מיושם על תאי גזע אנושי, שבו CXCR4 ניתן להשתמש כדי לבודד SHF CPCs המבטאים רמות גבוהות של Isl125. בנוסף, שלנו כפול, פלורסנט כתבת mESC הקו יכול לשמש כדי למסך ספריות של תרכובות ושעתוק גורמים שיכולים להשפיע על מפרט שדה הלב או קוטביות התא ב-CPCs.
אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול הוא המספר ההתחלתי של mESCs. שימוש במספרים נמוכים או גבוהים ישפיע באופן משמעותי על הגודל של הספרואידים לב ויעילות הבידול. אנו ממליצים לבדוק מספרי תאים שונים (7.5-10 x 104 תאים/mL) עבור קווי mesc שונים. לחילופין, אם גודל המירואידים הקרדיולוגי נשאר משתנה באופן משמעותי, ניתן להשתמש בלוחות עם בארות המכילות את המיקרוגל בגודל שצוין, כדי להגביר את האפשרות להגברת התוכנות. החוקרים צריכים גם להיות מודעים לתזמון הספציפי ולמשך הזמן של השראה מזועורי, כמו גם את העיתוי של מיון התא. יתר על כן, עבור קווי mESC שונים, אופטימיזציה של ריכוזי מורפוגן יהיה צורך לבצע לפני בדיקת היכולת שלהם ליצור CPCs ב-spheroids לב. השימוש של מבוגרים/ציטוקינים שפג תוקפם או בינונית תרבות התא, או ריכוזים לא עקביים של מורפולגנים ישפיע על יעילות הבידול. לבסוף, קווי mESC שעברו בגיל יותר מ ~ 15-20 פעמים, נראה לאבד את היכולת שלהם להבדיל ביעילות.
מערכת הבידול שלנו מאפשרת שינויים ספציפיים. Cxcr4 יכול לשמש כסמן יחיד של SHF CPCs בשורות mESC ללא כתב פלורסנט. עם זאת, החוקרים צריכים עדיין למטב את פרוטוקול הבידול כדי להגדיל את אחוז Isl1 + CPCs לפני מיון Cxcr4 + vs Cxcr4-CPCs25. בנוסף, ניתן להחליף את פעילות המחשב באמצעות מפעילי Wnt קאנוניים כגון Wnt3a או CHIR99021 (GSK3b מעכב) כדי להגדיל את המפרט של SHF CPCs25.
פרוטוקול זה מאפשר את המחקר של מפרט CPC באמצעות תנאים מוגדרים היטב, ניטור צניחה בזמן ומספר בלתי מוגבל של תאים. לכן, זה יותר מהנה, יעיל ויקר פחות בהשוואה לניתוח עוברים. עם זאת, הוא עדיין מערכת מחוץ גופית שבו ערכי הביטוי הגן המוחלט של CPCs ספציפיים שדה הלב לא יכול לתאם בחוזקה עם רמות ביטוי גנים vivo. כך, במערכת שלנו, רק BMP4 יכול לציין CPCs משני שדות הלב והוא יכול לשנות באופן משמעותי את היחס שלהם. בנוסף, ייתכן ששונות קיימת בנוגע ליעילות הבידול.
לסיכום, באמצעות קווי הכתב פלורסנט mESC או חיסוני של חלבונים קרום התא, אנחנו לכידה cardiogenesis ב מבחנה ומבודדים לב שדה-CPCs ספציפיים. זה מאפשר את המחקר של אותות מוקדמים הבתווך מפרט CPC ותכונות פונקציונלי, כמו גם מודל לב שדה/חדר מחלות לב מולדים ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין כלום לגילויים.
Acknowledgments
א. ט. נתמך על ידי הקסם החשוב ו-AHA. ג. ק. הייתה נתמכת על ידי מענקים מ-R01HD086026/NIH, AHA ו-MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E.
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
