Summary
Syftet med denna metod är att generera hjärt-specifika hjärt stamceller in vitro för att studera stamceller specifikation och funktionella egenskaper, och att generera kammarspecifika hjärt celler för hjärt sjukdom modellering.
Abstract
Pluripotenta stamceller erbjuder stor potential för att förstå hjärt utveckling och sjukdom och för regenerativ medicin. Även om de senaste framstegen inom utveckling kardiologi har lett till att generera hjärt celler från pluripotenta stamceller, är det oklart om de två hjärt fält-den första och andra hjärt fält (FHF och SHF)-induceras i pluripotenta stamceller system. För att ta itu med detta genererade vi ett protokoll för in vitro-specifikation och isolering av hjärtfältspecifika hjärt stamceller. Vi använde embryonala stamcells linjer som transporterar Hcn4-GFP och Tbx1-CRE; Rosa-RFP reportrar av FHF och SHF, respektive, och levande cell immunofärgning av cell membranet protein Cxcr4, en SHF markör. Med detta tillvägagångs sätt genererade vi stamceller som rekapitulera de funktionella egenskaper och transkriptome av deras in vivo motsvarigheter. Vårt protokoll kan användas för att studera tidig specifikation och segregering av de två hjärt fälten och för att generera kammarspecifika hjärt celler för modellering av hjärt sjukdomar. Eftersom detta är ett in vitro-organoidsystem, kan det inte ge exakt anatomisk information. Men detta system övervinner dålig till gång till gastrulation Stadium embryon och kan skalas för hög genom strömning skärmar.
Introduction
Användningen av pluripotenta stamceller (PSCs) har revolutionerat området för hjärt förnyelse och personlig medicin med patientspecifika myocyter för sjukdoms modellering och läkemedels terapier1,2,3, 4. mer nyligen, in vitro-protokoll för generering av förmaksflimmer vs ventrikulär liksom pacemaker-liknande PSC-härledda hjärt muskel celler har utvecklats5,6. Emellertid, om cardiogenesis kan återskapas in vitro för att studera hjärt utveckling och därefter generera ventrikulära kammarspecifika hjärt celler är fortfarande oklart.
Under tidig embryonal utveckling, mesodermala celler under påverkan av utsöndras morfogener såsom BMP4, Wnts och Activin en form primitiva strimma7. Kardiella mesodermala celler som kännetecknas av uttrycket av Mesp1, migrera anteriorly och senare för att bilda den kardiella halv månen och sedan primitiva hjärta röret7,8. Denna flyttande grupp av celler innehåller två mycket distinkta populationer av hjärt stamceller (CPCS), nämligen det första och det andra hjärt fältet (fhf och SHF)9,10. Celler från SHF är mycket proliferativa och flyttande och är primärt ansvariga för töjning och looping av hjärt röret. Dessutom, SHF celler differentiera till cardiomyocytes, fibroblaster, glatt mus kula tur och endotelceller som de in i hjärtat röret för att bilda höger kammare, höger kammare utflöde tarm kanalen och stor del av både Atria7,10. Däremot är FHF-celler mindre proliferativa och flyttande och differentierar främst till cardiomyocyter eftersom de ger upphov till vänster kammare och en mindre del av Atria11. Dessutom kännetecknas SHF-progenitorerna av uttrycket Tbx1, FGF8, FGF10 och Six2 medan fhf-celler uttrycker Hcn4 och Tbx511,12,13,14,15.
PSCs kan differentiera till alla tre köns lagren och därefter till vilken cell typ som helst i kroppen4,16. Därför, de erbjuder en enorm potential för att förstå hjärt utveckling och för modellering specifika utvecklingsdefekter som resulterar i kon geni tal hjärt sjukdom, den vanligaste orsaken till foster skador17. En stor under grupp av kon geni tal hjärt sjukdom inkluderar kammarspecifika hjärt avvikelser18,19. Emellertid, det fortfarande oklart om dessa kommer från avvikande hjärt fält utveckling. Dessutom, med tanke på oförmågan av hjärt muskel celler att förökar sig efter födseln, det har varit omfattande ansträngningar för att skapa hjärt vävnad för hjärt förnyelse1,7,20. Med tanke på de fysiologiska och morfologiska skillnaderna mellan hjärtats kammare, är generering av kammarspecifik hjärt vävnad med PSCs av stor betydelse. Även om de senaste framstegen inom utveckling kardiologi har lett till en robust generation av hjärt celler från PSC, är det fortfarande oklart om de två hjärt fält kan induceras i KUSP-system.
För att upprepa cardiogenesis in vitro och studera specifikationen och egenskaperna hos CPCS, vi tidigare använt ett system baserat på differentiera PSC-derived kardiella sfäroider21,22,23,24. Nyligen genererade vi mus embryonala stamceller (mESCs) med GFP och RFP reportrar under kontroll av FHF genen Hcn4 och SHF genen Tbx1, respektive (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differentierade mESCs bildade hjärt sfäroider där GFP + och RFP + celler dök upp från två distinkta områden av mesodermala celler och mönstrade på ett komplementärt sätt. De resulterande GFP +-och RFP +-cellerna uppvisade FHF-och SHF-egenskaper, respektive bestämdes av RNA-sekvensering och klon analyser. Viktigt, med hjälp av mESCs redovisade Isl1-RFP reporter (mESCIsl1-RFP), upptäckte vi att SHF celler troget präglades av cell-ytan protein CXCR4, och detta kan möjliggöra isolering av hjärt fält-specifika celler utan transgenes. Detta protokoll kommer att beskriva generering och isolering av hjärt fält-specifika CPCs från mESCs, som kan fungera som ett värdefullt verktyg för att studera kammarspecifik hjärt sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: In vitro-generering av hjärt fält-specifika mus hjärt stamceller celler (figur 1).
1. underhåll av mus-ESCs
- Odla mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 på 0,1% (vikt/volym) gelatinbelagda T25 kolvar i 2i medium (870 ml av glascow minimum viktigt medium (Gmem), 100 ml av fetalt bovint serum (FBS), 10 mL glutamax, 10 ml icke-essentiella aminosyror, 10 ml natrium Pyruvat, 3 μL beta-merkaptoetanol, 20 μL Lif (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 och 0,1 μM PD0325901).
- När cellerna når 70-80%, skölj cellerna en gång med fosfatbuffertlösning (PBS) och separera dem sedan i enstaka celler genom att tillsätta 1 mL trypsin och inrusning vid 37 ° c i 3 min.
- Neutralisera trypsin genom att lägga till 4 mL 10% FBS i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM). Räkna cellerna med en automatiserad cell räknare.
- Centrifugera ~ 3 x 105 celler i 3 min vid 270 x g och rums temperatur.
- Aspirera supernatanten, omsuspendera cellerna i 5 mL 2i medium och replate på 0,1% (w/v) gelatin belagda T25 kolvar för underhåll.
2. generering av hjärt progenitor celler med hjälp av hjärt spheroids
- Centrifugera 2,5 x 106 celler från steg 1,3 i 3 min vid 270 x g och rums temperatur.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 25 mL SFD medium (105 celler/ml). Beroende på experimentets omfattning kan mESC-numret justeras i enlighet med detta.
Anmärkning: SFD medium innehåller 715 mL Iscove modifierade Dulbecco medium (IMDM), 250 mL skinka F12, 5 mL N2-tillägg, 10 mL B27 minus vitamin A, 5 mL 10% (w/v) BSA (i PBS), 7,5 mL GlutaMAX och 7,5 mL penicillin-streptomycin. Tillsätt askor bin syra (50 mg/mL) och 3,9 x 10-3% (v/v) av monotioglycerol före användning. - Platta cell SUS pensionen till 1 150 mm x 25 mm steril plåt och inkubera vid 37 ° c i 5% co2 inkubator för 48 h. hjärt sfäroider bör bildas inom 24 h.
- Samla alla bildade hjärt sfäroider och Centrifugera i 3 min vid 145 x g och rums temperatur för att selektivt isolera sfäroider och undvika enstaka celler.
- Aspirera supernatanten och resuspendera sfäroiderna i 25 mL SFD medium med 1 ng/mL Activin A och 1,5 ng/mL av BMP4 för differentiering induktion. Platta sfäroiderna i samma 150 mm x 25mm steril plåt och inkubera dem vid 37 ° c i 5% CO2 inkubator för 40 h.
Anmärkning: Olika koncentrationer av Activin A (0-3 ng/mL) och BMP4 (0.5-2 ng/mL) kan användas för differentierings optimering beroende på mESC-linjen. - Samla alla hjärt sfäroider och Centrifugera i 3 min vid 145 x g och rums temperatur.
- Aspirera supernatanten och resuspendera sfäroiderna i 25 mL SFD medium. Överför de återsuspenderade EBs i en ultra-låg infästning 75 cm2 kolv och inkubera dem vid 37 ° c i 5% co2 inkubator för 48 h.
3. isolering av hjärt fält specifika hjärt progenitor celler med hjälp av fluorescerande reportrar
- Centrifugera hjärtsfäroider vid 145 x g och rums temperatur för 3min och aspirera supernatanten. Tillsätt 1 mL trypsin och inkubera vid 37 ° c i 3 min. blanda väl genom pipettering för att separera cellerna.
- Tillsätt 4 mL 10% FBS i DMEM för att inaktivera trypsin och blanda väl med pipettering. För att ta bort de icke-separerade EBs, filtrera blandningen med hjälp av en 70 mm sil och centrifugera filtrerad cellerna i 3 min vid 270 x g och rums temperatur.
- Att sortera CPCs transporterar fluorescerande reportrar (CPCs härrör från mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirera supernatanten och tillsätt 500 ΜL FACS sorterings lösning (1% (v/v) FBS, 200 mm HEPES och 10 mm EDTA i PBS) för att resuspendera.
- För att ta bort alla cell kluster före sortering, filtrera cellerna igen med hjälp av en 5 mL polystyren runda botten röret med en 40 μm cell sil. Håll cellerna på is tills sortering.
- Sortera cellerna för att isolera Tbx1-CRE; Rosa-RFP och HCN4-GFP positiva CPCs med hjälp av en fluorescerande aktive rad cell sorterare (FACS). Samla de sorterade cellerna i 1 mL FBS. Förvara cell provet och de sorterade cellerna vid 4 ° c.
4. isolering av hjärt fält specifika hjärt progenitor celler använda Cxcr4 som en cell yta protein markör
- För att isolera första vs andra hjärt fält CPCs baserat på uttrycket av ytan protein receptor Cxcr4, Använd mESCIsl1-RFPlinje. Aspirera supernatanten från steg 3,3 och resuspendera de enda CPCs i 300 μL av 10% FBS i PBS innehåll ande 1:200 (Vol/Vol) PerCP-efluor 710 konjugerad anti-Cxcr4 anti kropp.
- Inkubera vid rums temperatur i 5min och tvätta genom att tillsätta 1-2 mL kallt PBS. Centrifugera de enskilda CPCs i 3 min vid 270 x g och rums temperatur och tvätta ytterligare två gånger följt av centrifugering.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 500 μL FACS sorterings lösning för att resuspendera de enskilda CPCs och filtrera som i steg 3,4.
- Isolera Cxcr4 + och Cxcr4-celler med FACS. Samla de sorterade cellerna i 1 mL FBS. Förvara cell provet och de sorterade cellerna vid 4 ° c.
5. analys av isolerade hjärt fält specifika hjärt progenitor celler
- Centrifugera sorterade CPCs i 3 min vid 270 x g och rums temperatur. Sorterade celler kan användas för analys av gen-och protein uttryck eller så kan de recultiveras för analyser vid senare tidpunkter.
- Att åter odla isolerade CPCs, aspirera supernatanten, omsuspendera cellerna i SFD medium och replate ~ 3 x 104 celler per brunn av en 384-well plattan belagd med 0,1% (w/v) gelatin. Om ökad celldöd noteras efter sortering, tillsätt 10 μM av Y-27632 (ROCK-hämmare) till provet. Två dagar efter omodling bör spontan misshandel noteras.
- För att analysera förmågan hos pläterade CPCs att differentiera till cardiomyocytes, samla in cellerna på dag 12 av differentiering. Använd trypsin som beskrivs i steg 1.2-1.5 för att isolera enstaka CMs. Omsuspendera cellerna i 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 30 min vid rums temperatur för att fixera cellerna.
- Centrifugera cellerna i 3 min vid 895 x goch rums temperatur. Aspirera supernatanten och omsuspendera cellerna i PBS för att tvätta PFA. Upprepa detta steg ännu en gång.
- Aspirera supernatanten och omsuspendera cellerna i 10% FBS i PBS. Inkubera hälften av cell provet med mus anti-Troponin T-antikropp (1:500) och Använd resten av provet som en negativ kontroll. Inkubera i 30 minuter i rums temperatur.
- Tvätta cellerna två gånger enligt beskrivningen i steg 5,4 med PBS. Aspirera supernatanten och resuspendera båda cellprover i 10% FBS i PBS med 1:500 åsna anti-mus IgG (H + L) sekundär anti kropp, Alexa fluor 647 konjugat. Inkubera i 30 minuter i rums temperatur.
- Tvätta två gånger med PBS som i steg 5,6. Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 200 μL PBS. Använd en flödescytometer för att analysera cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ca 132 h differentiering, kan Tbx1-RFP och Hcn4-GFP CPCs detekteras med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop (figur 2). I allmänhet visas GFP-och RFP-cellerna ungefär ungefär samma tid. De två populationerna av CPCs fortsätter att expandera i nära närhet och ofta i ett komplementärt mönster. Genom att justera koncentrationerna av Activin A och BMP4 ändras procent satserna för FHF vs SHF-CPCs (figur 3). CPC-specifikationen in vitro bestämdes främst av koncentrationen av BMP4. Därför kan vårt hjärtspheroid-system användas för att studera CPC-specifikationen.
På samma sätt med Isl1-RFP reporter mESC linje, efter 132 h differentiering, visas Isl1-RFP + CPCs. Efter immunofärgning av CPCs för CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + vs Isl1-RFP +, kan Cxcr4-celler isoleras (figur 4).
För att analysera förmågan hos mESC-derived CPCs att differentiera till cardiomyocyter, kan immunofärgning för hjärt Troponin T utföras vid dag 12 av differentiering. I samförstånd med den modell som FHF celler skiljer sig främst till myocyter, celler som härrör från Hcn4-GFP + CPCs är främst Myogenic (figur 5A, B). På samma sätt, celler som härrör från Isl1 +, CXCR4-CPCs ger också upphov till cardiomyocyter med mycket högre procent satser jämfört med Isl1 +, CXCR4-CPCs (figur 5C).
Ibland, mESCs Miss lyckas med att differentiera effektivt och bildar mycket lågt antal hjärt fält-specifika CPCs (figur 6).
Figur 1 : Schematisk representation av in vitro-specificering av hjärtprogenitorceller. mESCs bildar sfäroider inom 48 h. Då exponering för Activin A och BMP4 för 40 h kommer att leda till mesodermala induktion. Hjärt stamceller utvecklar cirka 36 h senare. Progenitorer i det andra eller första hjärt fältet kan sorteras med hjälp av fluorescerande aktive rad cell sortering. Andra hjärt fält celler kännetecknas av Tbx1-RFP uttryck vs första hjärt fält som är markerade med Hcn4-GFP. Alternativt, Isl1-RFP märken CPCs och Använd ande levande immunofärgning emot Cxcr4 en kanna sortera Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-CPCs så pass representera andra vs första hjärta fält cellerna respectively. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativ bild av hjärt sfäroider efter CPC-specifikationen. RFP markerar Tbx1 + och GFP markerar Hcn4 + CPCs. De två cell populationerna bildas i nära närhet i ett gratis mönster. Skal streck = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flödescytometrisk analys av hjärt spheroider efter exponering för olika koncentrationer av Activin A och BMP4. Justering av koncentrationerna av de två morfogener leder till olika procent satser av Tbx1 + och Hcn4 + CPCs. De två populationerna påverkades främst av att BMP4-koncentrationen justerades. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Flödescytometrisk analys av hjärt stamceller som uttrycker Isl1 och är immunfärgade för Cxcr4. Hjärt progenitorer var först gated baserat på deras Isl1 uttryck och sedan Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-celler sorterades. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Flödescytometrisk analys av celler som härrör från hjärt fält-specifika CPCs färgas för hjärt Troponin T. (A) i överensstämmelse med den högre myogena potentialen hos fhf-celler, en hög andel av HCN4-GFP + celler differentiera till myocyter. B) analys av alla mesc-härledda cardiomyocyter, där de allra flesta är HCN4-GFP +. C) Cxcr4-CPCS differentierar till en högre andel av cardiomyocyter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Representativa cytometriska analyser av misslyckade/lågeffektiva in vitro -differentieringar. (A) flödescytometri analys efter 132 h differentiering visar ingen bildandet av HCN4-GFP celler och en mycket låg andel av TBX1-RFP + celler. (B) låg differentiering effektivitet av mescs uttrycker mycket låga nivåer av Isl1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt protokoll beskriver vi en metodik för att generera kardiella sfäroider och isolerade hjärtfältspecifika CPCs. Dessa kan användas för att studera mekanismer för CPC-specifikation och deras egenskaper, samt för kardiell kammarspecifik sjukdoms modellering. Ett tidigare publicerat arbete används en mesc linje med två fluorescerande reportrar (Mef2c/NKX 2.5) att studera cardiogenesis in vitro, emellertid, båda dessa markörer uttrycks vid embryonal dag 9.5-10 när hjärt muskel celler redan bildas26. Såvitt vi vet finns det för närvarande inga metoder för isolering av hjärt fält-specifika CPCs in vitro-. Ännu viktigare, vårt protokoll kan också tillämpas på mänskliga stamceller, där CXCR4 kan användas för att isolera SHF CPCs som uttrycker höga halter av Isl125. Dessutom, vår dubbel, fluorescerande reporter mESC linje kan användas för att skärmen bibliotek av föreningar och transkriptionsfaktorer som kan påverka hjärt fält specifikation eller cellpolaritet i CPCs.
Ett av de kritiska stegen i protokollet är start numret för mESCs. Med låga eller höga siffror kommer att avsevärt påverka storleken på hjärt sfäroider och differentiering effektivitet. Vi rekommenderar att du testar olika cell nummer (7.5-10 x 104 celler/ml) för olika mesc-linjer. Alternativt, om storleken på hjärt sfäroider är betydligt varierande, kan plattor med brunnar som innehåller mikrobrunnar av angiven storlek också användas för att öka reproducerbarheten. Utredarna bör också vara uppmärksam på den specifika tidpunkten och varaktigheten av mesodermala induktion samt tidpunkten för cell sortering. Dessutom, för olika mESC linjer, optimering av morfogen koncentrationerna kommer att behöva utföras innan du testar deras förmåga att generera CPCs i hjärt spheroids. Användning av äldre/utgångna cytokiner eller cell odlings substrat, eller inkonsekvent koncentrationer av morfogener kommer att påverka differentierings effektivitet. Slutligen, mesc linjer som har passe för mer än ~ 15-20 gånger, verkar förlora sin förmåga att differentiera effektivt.
Vårt differentierings system tillåter specifika modifieringar. Cxcr4 kan användas som en enda markör för SHF CPCs i mESC linjer utan en fluorescerande reporter. Utredarna bör dock fortfarande optimera differentierings protokollet för att öka andelen Isl1 + CPCs före sortering Cxcr4 + vs Cxcr4-CPCs25. Dessutom kan Activin A ersättas med kanoniska Wnt-agonister/aktivatorer såsom Wnt3a eller CHIR99021 (GSK3b-hämmare) för att ytterligare öka specifikationen för SHF CPCs25.
Detta protokoll gör det möjligt att studera CPC-specifikationen med hjälp av väldefinierade villkor, tids fördröjnings övervakning och obegränsat antal celler. Således är det mer lättsammare, effektivt och billigare i jämförelse med att analysera embryon. Ändå är det fortfarande ett in vitro-system där de absoluta gen uttrycks värden för hjärt-Fältspecifika CPCs inte får tätt korrelera med in vivo-genuttrycksnivåer. Således, i vårt system, endast BMP4 kunde ange CPCs från båda hjärt fält och kan avsevärt ändra sina respektive nyckeltal. Dessutom kan variationer förekomma när det gäller differentierings effektiviteten.
Sammanfattnings vis, med hjälp av mesc fluorescerande reporter linjer eller immunofärgning av cell membran proteiner, redovisas vi cardiogenesis in vitro och isolerade hjärt fält-specifika CPCS. Detta möjliggör studiet av tidiga signaler som förmedlar CPC-specifikationen och funktionella egenskaper samt modellering av hjärt fält/kammarspecifika medfödda hjärt sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget för avslöjanden.
Acknowledgments
E. T. stöddes av The Magic that Matters och AHA. C. K. stöddes av bidrag från NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, och MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
