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Immunology and Infection

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59828
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

Summary

Murine Modelle der Arteriosklerose sind nützliche Werkzeuge, um pathogene Pfade auf molekularer Ebene zu untersuchen, erfordern aber eine standardisierte Quantifizierung der Läsionsentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Bestimmung der Läsionsgröße in den hauptartiellen Gefäßen, einschließlich der Aortenwurzel, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterie.

Abstract

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Haupttodesursache der Welt. Die zugrunde liegende Ursache ist in den meisten Fällen Arteriosklerose, die zum Teil eine chronische entzündliche Erkrankung ist. Experimentelle Atherosklerose-Studien haben die Rolle von Cholesterin und Entzündungen im Krankheitsprozess aufgeklärt. Dies hat zu erfolgreichen klinischen Studien mit pharmazeutischen Wirkstoffen geführt, die klinische Manifestationen von Arteriosklerose reduzieren. Sorgfältige und gut kontrollierte Experimente an Mausmodellen der Krankheit könnten die Pathogenese der Krankheit weiter aufklären, was nicht vollständig verstanden wird. Eine standardisierte Läsionsanalyse ist wichtig, um die experimentelle Variabilität zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die Bestimmung der Läsionsgröße in Aortenwurzel, Aortenbogen und brachiocephaler Arterie sind häufige Endpunkte bei experimenteller Arteriosklerose. Dieses Protokoll enthält eine technische Beschreibung für die Bewertung von Arteriosklerose an allen diesen Standorten in einer einzigen Maus. Das Protokoll ist besonders nützlich, wenn Material begrenzt ist, wie es häufig der Fall ist, wenn gentechnisch veränderte Tiere charakterisiert werden.

Introduction

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Haupttodesursache in der Welt mit ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfall für einen von vier Todesfällen1. Die meisten Fälle werden durch Arteriosklerose verursacht, eine Krankheit, die durch eine langsame Ansammlung von lipidhaltigen Plaques mit Anzeichen einer chronischen Entzündung in großen und mittelgroßen Arterien gekennzeichnet ist2. Die Krankheit bleibt in der Regel über mehrere Jahrzehnte unbemerkt, bis ein Bruch oder eine Erosion der Plaque eine arterielle Thrombose hervorruft, die zu ischämischen Gewebeschäden führt.

Eine normale Arterie besteht aus einer Intimaschicht mit Endothelzellen und spärlich verteilten glatten Muskelzellen, einer Medienschicht mit glatten Muskelzellen und elastischen Lamellen und einer umgebenden Adventitialschicht mit losem Bindegewebe3. Eine intime Retention von LDL kompensiert die Entwicklung von Arteriosklerose4. Die Akkumulation und Modifikation von Lipoproteinen führt zur Aggregation und Einschließung innerhalb der arteriellen Intima5. Eine Entzündungsreaktion wird durch die gefangenen und modifizierten Lipoproteine6hervorgerufen. Endothelzellen beginnen, Adhäsionsmoleküle auszudrücken, wie VCAM-1 an Stellen im arteriellen Baum mit turbulentem Blutfluss, was zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten und anderen Leukozyten führt7. Die infiltrierenden Monozyten differenzieren sich in Makrophagen, die Lipid mit der anschließenden Umwandlung in Makrophagenschaumzellen verschlingen8.

Atherosklerose wird seit Mitte der 1980er Jahre in Mausmodellen mit zunehmender Häufigkeit untersucht. C57BL/6 ist der am häufigsten verwendete Inzucht-Mausstamm für diese Studien, und es wird als genetischer Hintergrund für die Mehrheit der genetisch veränderten Stämme9verwendet. Dieser Stamm wurde in den 1920er Jahren gegründet10, und sein Genom wurde im Jahr 2002veröffentlicht 11. Experimente in Mausmodellen haben mehrere Vorteile: Die Kolonien vermehren sich schnell, das Gehäuse ist platzsparend, und Inzucht reduziert die experimentelle Variabilität. Das Modell ermöglicht auch genetische Manipulationen, wie gezielte Genlöschungen und das Einfügen von Transgenen. Dies hat zu einem neuen pathophysiologischenVerständnis der Krankheit und neuen Therapiezielen 12 geführt.

Wildtyp C57BL/6 Mäuse sind natürlich resistent gegen Arteriosklerose. Sie haben den größten Teil des zirkulierenden Cholesterins in HDL, und komplexe atherosklerotische Läsionen werden nicht gebildet, selbst wenn eine fettreiche und cholesterinreiche Diät gefüttert13. Hypercholesterinemische Mäuse, wie Apoe-/- auf dem C57BL/6-Hintergrund, werden daher als experimentelle Modelle der Arteriosklerose14,15verwendet. Der Mangel an ApoE beeinträchtigt die Leberaufnahme von Restlipoproteinen und stört den Fettstoffwechsel stark. Bei Apoe-/- Mäusen wird das zirkulierende Cholesterin hauptsächlich in VLDL-Partikeln zirkuliert, und die Mäuse entwickeln komplexe atherosklerotische Plaques auf einer regelmäßigen Chow-Diät.

Ldlr-/- Mäuse imitieren die Entwicklung von Arteriosklerose beim Menschen mit familiärer Hypercholesterinämie16. Die Ldlr-/- Mäuse brauchen eine westliche Diät, um Art der Art von Art zu entwickeln17. Westliche Ernährung imitiert menschliche Nahrungsaufnahme und enthält in der Regel 0,15% Cholesterin. Der LDL-Rezeptor erkennt ApoB100 und ApoE und vermittelt die Aufnahme von LDL-Partikeln durch Endozytose. LDL-Rezeptoren sind von grundlegender Bedeutung für die Leberclearance von LDL aus der Zirkulation, während LDL-Rezeptor-Expression in hämatopoetischen Zellen diesen Prozess nicht beeinflusst. Dies eröffnet die Möglichkeit einer Knochenmarktransplantation von Ldlr+/+ Zellen in hypercholesterinem Ldlr-/- Empfänger und Bewertung der Entwicklung von Arteriosklerose. Knochenmark Chimären wurden häufig verwendet, um die Beteiligung von hämatopoetischen Zellen an experimenteller Arteriosklerose zu untersuchen. Die Knochenmarktransplantation könnte jedoch die Größe und Zusammensetzung atherosklerotischer Plaques beeinflussen, wodurch die Interpretation der Ergebnisse mehrdeutig wird.

Verschiedene Varianten von Apoe-/- und Ldlr-/- Mäusen mit zusätzlichen genetischen Veränderungen wurden entwickelt, um spezifische Prozesse der Krankheit zu untersuchen18. Ein Beispiel sind menschliche APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) Mäuse, die das volle menschliche APOB100 Gen19,20tragen. Diese Mäuse entwickeln Hypercholesterinämie und Arteriosklerose auf einer regelmäßigen Chow-Diät. Jedoch, die Entwicklung von komplexen atherosklerotischen Plaques dauert mindestens sechs Monate und kürzere experimentelle Protokolle verwenden in der Regel westliche Ernährung21. Ein großer Teil des Plasmacholesterins zirkuliert in LDL-Partikeln, was HuBL-Mäusen ein menschlicheres dyslipidemisches Lipoproteinprofil im Vergleich zu Apoe-/- und Ldlr-/- Mäusen verleiht. HuBL-Mäuse erlauben auch Studien des menschlichen ApoB als Autoantigen22.

Die Mausmodelle der Arteriosklerose entwickeln komplexe atherosklerotische Plaques mit gemeinsamen Merkmalen menschlicher Krankheiten. Allerdings sind die Plaques ziemlich resistent gegen Bruch mit anschließendem Myokardinfarkt. Die Atherothrombose ist nur sporadisch nachgewiesen und experimentell anspruchsvoll, um23,24,25zu beurteilen. Spezielle Modelle von Plaquebruch wurden entwickelt, aber dem Versuchsfeld fehlt ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell für die Beurteilung von Plaque-Stabilisierungsmitteln.

Quantifizierung der Arteriosklerose wurde in vielerlei Hinsicht in der Literatur berichtet. Jüngste Bemühungen haben versucht, experimentelles Design, Durchführung und Berichterstattung über Tierstudien zu standardisieren26. Die Ermittler haben unterschiedliche Vorlieben und Techniken, die an ihre Laboratorien angepasst sind. Die meisten Forschungsprojekte sind auch in einer Weise einzigartig, dass sie einige Protokolländerungen erfordern. Aufgrund der multifaktoriellen Natur der Krankheit variieren optimale Kontrollen von Projekt zu Projekt. Lokale Bedingungen und mangelnde Standardisierung können zu beobachteten Unterschieden in der Krankheitsentwicklung führen, was den Fortschritt des Forschungsbereichs behindert. Unterschiede in der experimentellen Variabilität bedeuten auch, dass statistische Leistungsberechnungen auf Pilotstudien unter lokalen Bedingungen basieren müssen.

Die Quantifizierung von Arteriosklerose wird an mehreren Stellen im Gefäßbaum empfohlen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Ergebnisse aus der Aortenwurzel, dem Aortenbogen und der brachiocephalen Arterie in einer einzigen Maus erhält, zusätzlich zum Verlassen des Rests der thorakoabdominalen Aorta für andere Analysen. En-Gesichtspräparate ermöglichen eine schnelle Quantifizierung von lipidbeladenen Plaques im Aortenbogen. Die Krankheitsbelastung in der brachiocephalen Arterie kann auch quantifiziert werden, wenn die Proben sorgfältig dargestellt werden. Der zeitaufwändigere Querschnitt der Aortenwurzel lässt mehrere Abschnitte für eine detaillierte Bewertung der Plaquezusammensetzung zur Verfügung.

Protocol

Alle Tierversuche bedürfen der Zustimmung der ethischen Behörden.

1. Mausopfer und Mikrodissektion von Aorta

  1. Opfern Sie die Maus durch CO2 Erstickung und Rekordgewicht.
  2. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um eine Kontamination der Proben durch Felle zu vermeiden. Platzieren Sie die Maus in einer Supine-Position. Von der jugularen Kerbe, machen Sie einen Mittellinienschnitt mit Mayo-Schere, die sie fast bis zum Schambein ausdehnt.
    ACHTUNG: Hochprozentiges Ethanol ist leicht entzündlich und kann zu schweren Augenreizungen führen. Ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen.
  3. Verwenden Sie eine 23 G Nadel, um die Maus durch Herzpunktion durch die Thoraxwand zu exsanguinate. Dieses Verfahren ergibt in der Regel 750 l Blut von einer 20 Wochen alten Maus. In der Regel sammeln Sie die Hälfte des Volumens in einem Trikalium-EDTA-beschichteten Rohr und die andere Hälfte in einem Serum- oder Lithium-Heparin-beschichteten Rohr. Drehen Sie die Rohre vorsichtig und halten Sie sie bis zur Weiterverarbeitung bei Raumtemperatur.
  4. Verwenden Sie Mayo-Schere, um das parietale Peritoneum in der Mittellinie zu schneiden, um die Bauchhöhle zu öffnen. Halten Sie den xiphoiden Prozess mit Gewebezangen und schneiden Sie das Peritoneum seitlich auf beiden Seiten und weiterhin das Zwerchfell zu öffnen.
    1. Verwenden Sie die Mayo-Schere, um die Brusthöhle zu öffnen, indem Sie den Rippenkäfig so seitlich wie möglich durchschneiden. Dies ermöglicht Weitwinkel für die Instrumente, während die Aorta später mikroseziert wird.
  5. Machen Sie einen Schnitt in der rechten Aurikel für die Perfusion Flüssigkeit Drainage. Legen Sie eine 27 G Nadel durch die Spitze des Herzens in Schädelrichtung. Halten Sie die Nadel in der linken Herzkammer fest, während Sie die Maus während mindestens 2 min langsam mit 10 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) durchdringen. Beobachten Sie, wie sich die Leber in farbe ändert und blasser wird.
    HINWEIS: Einige Protokolle verwenden Paraformaldehydperfusion, aber dies stört mehrere nachgelagerte Anwendungen, wie die immunhistochemische Analyse von Lymphozyten. Daher wird in diesem Protokoll keine Perfusionsfixierung mit Paraformaldehyd durchgeführt.
  6. Sezieren Sie Interessenskörper (z.B. Lymphknoten, Milz, Leber, Darm, Leistenfettpolster, Nieren usw.) mit anatomischen Zangen und Sezieren der Schere.
  7. Luftröhre und Speiseröhre auf der rechten Seite des Herzens schneiden, ohne den Aortenbogen zu beschädigen. Schneiden Sie das Zwerchfell und die Strukturen, die die Eingeweide an Retroperitoneum anbringen, und lassen Sie Herz, Aorta und Nieren vor Ort zurück. Falten Sie die Lunge und die Eingeweide kauenal weg und bedecken Sie sie mit einer Serviette, um mit der retroperitonealen Mikrodissektion von paraaorten Lymphknoten und Bauchaorta zu beginnen.
  8. Starten Sie die Mikrodissektion unter einem Stereomikroskop bei 6-facher Vergrößerung. Beginnen Sie, die aortenhafte Bifurkation zu sezieren, indem Sie umgebendes Gewebe mit Dumont-Zangen heben und unter Spannung mit der Vannas-Schere schneiden.
    1. Fahren Sie mit der Zerlegung der Bauchaorta kranially fort. Bauchzweige aus der Aorta schneiden und die Aorta proximal durch die Aortenpause im Zwerchfell befreien.
      HINWEIS: Mikrodissektion erfordert genaue Hand-Augen-Koordination durch das Stereomikroskop, die einige Praxis erfordert, um zu meistern.
  9. Entfernen Sie das Fettgewebe, das die Thoraxaorta bedeckt. Sezieren Sie den Thymus vorsichtig, um den Aortenbogen mit Zweigen zu befreien. Sezieren Sie die Karotisarterien so disistal wie möglich in der Brusthöhle. In besonderen Fällen kann die Halssektion durchgeführt werden, um die Karotis-Bifurkation einzubeziehen.
  10. Reinigen Sie die Instrumente durch konsekutive Spülungen in entionisiertem Wasser, RNase-Dekontaminationslösung, 70% Ethanol und PBS, bevor Sie die Aorta tatsächlich schneiden. Heben Sie das Herz an der Spitze mit der Zange. Schneiden Sie die Aorta nah am Herzen und legen Sie das ganze Herz in eine Röhre mit PBS. Das Herz konnte für ein paar Stunden auf Eis gelagert werden, bevor die Verarbeitung und Kryomontage der Aortenwurzel fortgesetzt wurde.
  11. Schneiden Sie den Aortenbogen gemäß Abbildung 1A. Den Aortenbogen in ein Rohr geben, das 1 ml 4% Formaldehyd über Nacht bei 4 °C enthält. Die Probe konnte auf diese Weise für mehrere Jahre vor dem Anheften und Der Analyse gelagert werden.
    ACHTUNG: Formaldehyd kann Krebs, allergische Hautreaktionen verursachen und ist schädlich, wenn es geschluckt wird. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung nach Bedarf.
  12. Sezieren Sie die verbleibende absteigende Aorta und legen Sie sie in eine RNA-Stabilisierungslösung oder fangen Sie sie für die nachfolgende RNA-Analyse oder andere Anwendung ein. Die Optimierung des Arbeitsablaufs zur Minimierung der Sezierender Zeit ist entscheidend, um einen übermäßigen RNA-Abbau zu vermeiden.
  13. Legen Sie die Blutentnahmeröhrchen (in Schritt 1.3) in eine Zentrifuge. Drehen Sie die separaten Plasma- und Serumröhren bei 1.500 x g für 15 min bei Raumtemperatur nach unten. Plasma und Serum vorsichtig in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -80 °C lagern. Das Sammeln von EDTA und heparinisiertem Plasma oder Serum lässt Möglichkeiten für mehrere nachgeschaltete Anwendungen.
  14. Legen Sie das Herz auf ein Korkbett mit der ventralen Seite nach oben. Fixieren Sie das Herz mit einer Nadel durch die Spitze am Kork. Halten Sie die Basis des Herzens mit anatomischen Zangen.
    1. Verwenden Sie ein Skalpell, um das apikale 2/3 des Herzens wegzuschneiden, wobei die Richtung des Schnittes als Linie zwischen den beiden Auen mit dem Skalpell, das 20° audal in der sagittalen Ebene und 20° kranially in der Transversalebene angewinkelt ist (Abbildung 1B).
  15. Einbetten der Aortenwurzel in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) Verbindung, die das Gewebe umgibt, aber nicht infiltriert. Tauchen Sie die Basis des Herzens in OCT-Verbindung. Drücken Sie das Herz vorsichtig mit der Zange, um die Aortenwurzel mit OCT zu füllen und luftblasen zu entfernen.
  16. Übertragen Sie das Exemplar auf den Boden eines mit OCT gefüllten Kryomolds. Die Aortenwurzel sollte nun senkrecht zur unteren Oberfläche liegen. Setzen Sie das montierte Herz auf Trockeneis zum Einfrieren. Bewahren Sie die Proben in Reißverschlussbeuteln in -80 °C auf, bis sie die Kryosektion gemäß Abschnitt 3 dieses Protokolls verfolgen.

Figure 1
Abbildung 1: Herz und Aortenbogen in situ. (A) Lunge, Luftröhre, Speiseröhre und Thymus werden entfernt, um den Aortenbogen in situ in einem 20 Wochen alten weiblichen Apoeanzuzeigen -/- Maus auf regelmäßige Chow-Diät in einer Mikrografin, Scale bar = 2 mm. Die gepunkteten Linien zeigen an, wo der Aortenbogen und seine Zweige geschnitten werden sollen. (B) Eine schematische Darstellung des Herzens und der Aorta. Die gepunktete Linie in Rot zeigt an, wo das Herz geschnitten werden soll, bevor die Aortenwurzel kryomontiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. En Face Analysis of Aortic Arch and Brachiocephalic Artery

  1. Vorbereiten Von Pinning-Betten für die Gesichtsanalyse von Aortenbögen. Falten Sie ein Segment von Paraffin-Wachsfolie achtmal, um eine flache 25 mm x 25 mm Oberfläche zu machen. Wickeln Sie es mit schwarzem elektrischen Isolierband, um einen dunklen Hintergrund für die Aorta zu machen. Legen Sie ein Etikett auf die Rückseite des Pinning-Bettes und verwenden Sie einen Bleistift, um die Maus-Identifikationsnummer zu schreiben (normale Stifttinte verschwindet im Färbevorgang).
  2. Übertragen Sie den Aortenbogen auf das Pinning-Bett und legen Sie einen Tropfen PBS darauf. Beginnen Sie mit der Reinigung der Aorta von dem verbleibenden periadventitialen Fettgewebe unter einem Stereomikroskop.
    1. Verwenden Sie Vannas Schere und Dumont Zange, um das gesamte umgebende Fettgewebe sanft abzuschälen, ohne die Aorta zu manipulieren oder zu beschädigen. Der Sudan IV wird Fettgewebe hell färben und es ist entscheidend, all diese Gewebe an dieser Stelle zu entfernen.
      HINWEIS: Halten Sie die Aorta jederzeit feucht, indem Sie bei Bedarf zusätzliche PBS anwenden.
  3. Schneiden Sie die Aorta in der koronalen Ebene auf, indem Sie die Vannas-Schere in das aortenhafte Lumen einführen, um die Intimoberfläche freizulegen. Beginnen Sie, die äußere Krümmung des aufsteigenden Bogens in distaler Richtung zu schneiden und die Zweige einschließlich der brachiocephalen Arterie weiter zu schneiden. Ersparen Sie den dorsalen Teil der absteigenden Thoraxregion.
    1. Öffnen Sie die geringere Krümmung und falten Sie die Aorta, um die Intimfläche anzuzeigen.
      HINWEIS: Dieser Schritt erfordert Feinmotorik und erfordert etwas Übung zu meistern.
  4. Pin den offenen Bogen an das Pinning Bett mit dem stumpfen Ende der minutien Insektenstifte. Verwenden Sie einen Mikro Castroviejo Nadelhalter, um die Stifte an Ort und Stelle zu setzen. Biegen Sie die Stifte vorsichtig von der Probe weg, wenn sie an Ort und Stelle sind. Pin die Aorta-Wohnung auf dem Bett, ohne die Probe zu dehnen. Den gepinnten Bogen nach unten in einer mit PBS gefüllten Petrischale bei 4 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  5. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Sudan IV vor. 1 g Sudan IV Pulver, 100 ml 70% Ethanol und 100 ml Aceton in einer dunklen Flasche mischen und 10 min vorsichtig umrühren. Es besteht keine Notwendigkeit, die Lösung zu filtern und es kann für ein paar Monate verwendet werden, wenn dunkel bei Raumtemperatur gehalten. Wenn die Färbefarbe nicht zufriedenstellend ist, kann eine neue Lösung hergestellt und die Proben wieder befleckt werden.
    ACHTUNG: Aceton ist eine brennbare Flüssigkeit, die zu schweren Augenreizungen führen kann. An einem gut belüfteten Ort aufbewahren und bei der Handhabung Vorsichtsmaßnahmen treffen.
  6. Ordnen Sie fünf Petri-Gerichte auf der Laborbank an: eine mit 70 % Ethanol, eine mit Sudan IV-Arbeitslösung, zwei mit 80 % Ethanol und eine mit PBS gefüllt.
    1. Beginnen Sie mit dem Spülen der Probe in 70% Ethanol für 5 min, indem Sie das Pinning-Bett in der ersten Petrischale mit dem Bogen nach unten zeigen. Übertragen Sie das Exemplar auf die Sudan IV Arbeitslösung und lassen Sie es den Bogen für 7 min färben.
    2. Als nächstes spülen Sie 80% Ethanol für 3 min zweimal ab, um die normale Intimoberfläche zu entführen. Die Entsendezeit könnte angepasst werden, um die Ergebnisse zu optimieren. Schließlich in PBS abspülen, bevor Sie das Exemplar wieder in die ursprüngliche Petrischale geben.
  7. Erfassen Sie Mikrographen mit einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung, die mit einer Digitalkamera verbunden ist. Fotografieren Sie den in PBS getauchten Gepinntenbogen mit kleinen Metallgewichten (20 mm x 10 mm x 5 mm), um das Anheftungsbett an den Boden einer Petrischale zu halten. Platzieren Sie ein Lineal neben der Aorta, um das Bild zu kalibrieren.
  8. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ), um die Läsionsfläche und die gesamte Intimfläche zu bestimmen. In Ermangelung anatomischer Landmarken zur Definition des Aortenbogens wird die Messung in der Regel vom Beginn der aufsteigenden Aorta bis zum ersten interkostalen Zweig durchgeführt (Abbildung 2A). Verwenden Sie die Flächenquantifizierungsfunktion in der Software, um den gesamten Intimbogenbereich manuell einzukreisen.
    HINWEIS:     Die Läsionsquantifizierung sollte in einer blinden Art und Weise erfolgen, und es ist ratsam, dass ein zweiter Prüfer die Ergebnisse bestätigt.
    1. Wählen Sie in ImageJ das Polygonauswahlwerkzeug aus, und umkreisen Sie den gesamten Bogenbereich durch wiederholte Klicks. Wählen Sie dann im Analysemenü Die Messgröße aus, um den gesamten Bogenbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    2. Als nächstes umschließen Sie alle sudanesischen IV-befleckten Tafeln im Bogen. Sudan IV ist ein Lysochrom-Diazofarbstoff, der Lipide, Triglyceride und Lipoproteine mit einer orange-roten Farbe färbt. Wählen Sie in ImageJ das Freihandauswahlwerkzeug aus und umschließen Sie alle Plaques, während Sie die Alt-Taste drücken. Klicken Sie im Analysemenü auf Maß, um den läsionsfreien Bogenbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    3. Berechnen Sie die relative Läsionsfläche, indem Sie die läsionsfreie Fläche von der gesamten Bogenfläche subtrahieren und dann das Ergebnis mit der gesamten Bogenfläche dividieren.
  9. Fixieren Sie die subklavischen und Karotisarterien sorgfältig an, um die Läsionsquantifikation in der brachiocephalen Arterie zu ermöglichen (Abbildung 2A). Die Quantifizierung der Läsionen in den subklavischen Arterien und den gemeinsamen Karotisarterien ist in der Regel sehr anspruchsvoll und nicht aussagekräftig.
    1. Umkreisen Sie in ImageJ beide Teile der braciocephalen Arterie mit dem Polygonauswahlwerkzeug, während Sie die Verschiebungstaste drücken. Klicken Sie im Analysemenü auf Maß, um den gesamten brachiocephalischen Arterienbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    2. Wählen Sie als Nächstes das Freihandauswahlwerkzeug aus und umschließen Sie alle Plaques in der brachiocephalen Arterie, während Sie die Alt-Taste drücken. Klicken Sie im Analysemenü auf Maß, um den läsionsfreien brachiocephalen Arterienbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    3. Berechnen Sie die relative Läsionsfläche, indem Sie die läsionsfreie Fläche von der gesamten brachiocephalen Arterienfläche subtrahieren und dann das Ergebnis mit der gesamten brachiocephalen Arterienfläche dividieren.

Figure 2
Abbildung 2: Atherosklerotische Läsionsquantifizierung. (A) Aortenbogen aus einem 20 Wochen alten männlichen Menschen APOB100-transgenic Ldlr-/- (HuBL) Maus gefüttert westliche Ernährung für zehn Wochen offen gepinnt und für lipidreiche Plaques mit Sudan IV gefärbt. Die gesamte Aortenbogenfläche wird mit der gepunkteten Linie in weiß im Mikrographen, Skalenleiste = 2 mm umrissen. Die gepunkteten Linien in Gelb umreißen die Gesamtfläche der brachiocephalen Arterie. (B) Aortenwurzelquerschnitt bei 400 m von der Aortensinus in einem 20 Wochen alten Männlichen Ldlr-/- Maus gefüttert westliche Ernährung für acht Wochen visualisiert in einem Mikrographen, Scale Bar = 500 m. Die gepunkteten Linien in Schwarz umreißen die gesamte Gefäßfläche und atherosklerotische Läsionen, die mit Ölrot O befleckt sind und in der arteriellen Intima lokalisiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Kryosektion der Aortenwurzel

  1. Stellen Sie die Kryostattemperatur auf -20 °C und die Schnittdicke auf 10 m ein. Montieren Sie den OCT-Block, der die Aortenwurzel auf dem Probenhalter enthält, wobei das ventrikuläre Gewebe nach außen gerichtet ist. Während Sie mit dem Schneiden beginnen, stimmen Sie die Ausrichtung der Schnittfläche so ab, dass sie parallel zum Probenhalter verläuft.
  2. Entfernen Sie übermäßige Umgebung OCT, um es einfacher zu machen, Abschnitte ohne Falten zu sammeln. Die Aortenwurzel sollte nun senkrecht zur Messerklinge positioniert werden, da die Basis des Herzens korrekt in der Form platziert wurde.
  3. Sammeln Sie erste Kontrollabschnitte auf gewöhnlichen Mikroskopschlitten, die verworfen werden. Die ersten Abschnitte sollten nur Herzmuskelgewebe enthalten. Erzielen Sie den Schnitt zu diesem Zeitpunkt um 200 m. Sammeln Sie einen Abschnitt und überprüfen Sie den Fortschritt mit einem Lichtmikroskop.
  4. Wenn Sie sich dem linken Ventrikelabflusstrakt nähern, überprüfen Sie alle 100 m unter dem Mikroskop. Wenn erste Hinweise auf eine Gefäßwand beobachtet werden, verlangsamen Sie das Tempo auf 50 m.
    HINWEIS: Wenn die erste Aortenspitze angezeigt wird, ist dies Punkt Null für das Sammeln von Abschnitten. Es kann schwierig sein, zu sehen, wann die Cusps genau erscheinen, aber eine genaue Lokalisierung ist entscheidend, um Vergleiche von Läsionen in der gleichen Region durchzuführen.
  5. Neigen Sie die Probe in Richtung der Punkt Nullspitze, um die Schnittebene an den beiden anderen Spitzen auszurichten. Dies ist entscheidend, um echte Querschnitte der Aorta zu erhalten. Erstellen Sie eine Zeichnung der Aortenwurzel, die die Cusps angibt, wie sie erscheinen, und zählen Sie jeden 10-mm-Abschnitt, der ab Punkt Null geschnitten wird.
    1. Wenn eine zweite Spitze erscheint, kippen Sie die Probe leicht wieder von der Spitze weg, um die Probe mit der dritten Spitze auszurichten. Die Pegeldifferenz zwischen den Cusps sollte 50 m nicht überschreiten. Beginnen Sie mit der Erfassung von Abschnitten auf Dias ab Stufe 90 m und ab.
    2. Sammeln Sie Abschnitte gemäß der Folienplanung in Abbildung 3. Die Sammlung von Abschnitten kann ab 190 m gestartet werden, wenn die Aortenwurzel mehr als 50 m geneigt ist, um weiteren Raum zu lassen, um die Wurzel in einer geraden Position auszurichten. Fahren Sie mit dem Schnitt fort, bis die Stufe 800 m von Punkt Null erreicht ist. Wenn es auf dieser Ebene noch sichtbare Plaques gibt, könnte die Sammlung auf 1.000 m erweitert werden.
      HINWEIS: Eine vereinfachte Folienorganisation wird in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt, die die Schnittgeschwindigkeit erhöhen könnte. Die optimale Diaplanung sollte je nach Projektplan beschlossen werden.
  6. Korrigieren Sie die Abschnitte nach der Auflistung.
    1. Fixieren Sie die Abschnitte gesammelt für Oil Red O Färbung und Picrosirius rote Färbung von Kollagen in 4% Formaldehyd für 10 min. Spülen in deionisiertem Wasser, trocken, und lagern in Raumtemperatur, bis verfolgung mit Abschnitt 4 in diesem Protokoll. Wenn Dias sofort mit Öl Rot O gebeizt werden sollten und noch nass sind, legen Sie sie 1 min in 60% Isopropanol, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen.
      ACHTUNG: Isopropanol ist eine brennbare Flüssigkeit, die schwere Augenreizungen verursachen und Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen kann. An einem gut belüfteten Ort aufbewahren und bei der Handhabung Vorsichtsmaßnahmen treffen.
    2. Fixieren Sie die für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz gesammelten Abschnitte in eiskaltem reinem Aceton für 10 min. Trocknen Sie bei Raumtemperatur für 30 min. Abschnitte in -20 °C lagern.

Figure 3
Abbildung 3: Organisation von Folien für serielle Abschnitte der Aortenwurzel. Während der Kryosektion der Aortenwurzel sollte jeder 10 m dicke Abschnitt gesammelt werden, der sich über die ersten 800 m der aufsteigenden Aorta erstreckt. Eine systematische Folienorganisation ist erforderlich, um geeignete Abschnitte für verschiedene Anwendungen zu erhalten. Die Analyse der Läsionszusammensetzung umfasst in der Regel Oil Red O Färbung für Lipide und Picrosirius rote Färbung für Kollagen. Verbleibende Abschnitte werden gesammelt und Aceton-fixiert für Die Immunhistochemie und Immunfluoreszenzfärbung. Diese Zahl wurde von Gistera et al30geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Öl Rot O Färbung und Quantifizierung von Atherosklerose in Aortenwurzeln

  1. Bereiten Sie eine gesättigte Oil Red O Lösung vor, indem Sie 1 g Öl rot O in 100 ml Isopropanol auflösen. Rühren Sie die Lösung in einer dunklen Flasche für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die gesättigte Lösung kann mehrere Monate aufbewahrt werden.
    HINWEIS: Es ist ratsam, ausgewiesene Laborgeräte für die Öl-Rot-O-Färbung zu haben, da es schwierig ist, Geräte zu reinigen, die mit der Lösung in Berührung gekommen sind.
  2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie 75 ml der gesättigten Oil Red O-Lösung mit 50 ml entionisiertem Wasser mischen. Lassen Sie in Raumtemperatur für 10 min stehen. Filtern Sie durch ein qualitatives Filterpapier.
  3. Legen Sie die Dias in Oil Red O Arbeitslösung für 20 min. Spülen Sie in Leitungswasser für 5 min.
  4. Zur Unterstützung der Gewebevisualisierung, Färben Sie mit Mayers Hämatoxylin für 1 min. Spülen Sie in lauwarmem Leitungswasser für 5 min. Alle Kerne sollten nun in blauer Farbe gebeizt werden, die Färbezeit anpassen, um das Ergebnis zu optimieren.
  5. Montieren Sie Dias in einem wässrigen Montagemedium (z.B. Kaiser es Glycerolgelatine). Kaiseres Glyceringelatine vor Gebrauch auf 40 °C erwärmen, um sie flüssig zu machen. Es ist nicht notwendig, die Rutschen zu trocknen, da das Montagemedium auf Wasserbasis ist. Achten Sie darauf, Luftblasenbildung zu vermeiden, wenn Sie das Deckglas hinzufügen.
    ACHTUNG: Kaiseres Glyceringelatine enthält Phenol, das im Verdacht steht, genetische Defekte zu verursachen. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung nach Bedarf.
  6. Erfassen Sie digitale Mikrographen mit einer Kamera, die mit einem Lichtmikroskop verbunden ist. Normalerweise konnten die vollen Gefäßwand- und Läsionsgrenzen durch die 50-fache Vergrößerung deutlich visualisiert werden. Speichern Sie Bilder mit hoher Auflösung, vorzugsweise im TIFF-Format (TIFF).
  7. Führen Sie die Analyse der Läsionsgröße mit einem computergestützten Bildanalyse-Softwaresystem durch. Oil Red O ist ein Lysochrom-Diazofarbstoff, der neutrale Lipide färbt und atherosklerotische Plaques mit einer intensiven roten Farbe visualisiert, die die Läsionsquantifizierung unterstützt.
    ANMERKUNG:     Die Läsionsquantifizierung sollte in einer blinden Art und Weise erfolgen, und es ist ratsam, dass ein zweiter Prüfer die erzielten Ergebnisse bestätigt.
    1. Verwenden Sie die Flächenquantifizierungsfunktion in der Bildanalysesoftware, um die gesamte Gefäßfläche zu definieren, indem Sie die externe elastische Lamina der Aortengefäßwand umschließen (Abbildung 2B). Wählen Sie in ImageJ das Polygonauswahlwerkzeug aus, und umkreisen Sie den Bereich durch wiederholte Klicks. Wählen Sie dann im Analysemenü die Messgröße aus. Die gesamte Behälterfläche wird im Ergebnisfenster angezeigt.
    2. Belastbar werden weiterhin die atherosklerotischen Läsionen in der Intimschicht des Gefäßes, die durch die interne elastische Lamina und die Luminalgrenze definiert wird. Üblicherweise sind Läsionen an Ventilspitzen von der Messung27ausgeschlossen. Wählen Sie in ImageJ das Freihandauswahlwerkzeug aus und umschließen Sie alle Plaques, während Sie die Alt-Taste drücken. Wählen Sie im Analysemenü Die Messgröße aus, um den läsionsfreien Gefäßbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    3. Berechnen Sie die relative Läsionsfläche, indem Sie die läsionsfreie Fläche von der gesamten Gefäßfläche subtrahieren und dann das Ergebnis mit der gesamten Gefäßfläche dividieren.
      HINWEIS: Kalibrieren Sie die Ergebnisse in der Bildanalyse-Software entsprechend der verwendeten Vergrößerung, um eine absolute Läsionsfläche im Quadratmikrometer zu erhalten.
  8. Definieren Sie den Ölrot-O-befleckten Bereich in den Läsionen, indem Sie ein Farbschwellen-Feature in der Bildanalysesoftware verwenden, um den Prozentsatz der Ölrot O-positiven Fläche der gesamten Läsionsfläche zu berechnen.
    1. Umkreisen Sie in ImageJ den gesamten Läsionsbereich, indem Sie das Freihandauswahlwerkzeug verwenden, während Sie die Umschalttaste drücken. Wählen Sie Die Option Maß im Analysemenü aus, um den gesamten Läsionsbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen.
    2. Wählen Sie Außen außen löschen im Bearbeitungsmenü aus. Ändern Sie den Bildtyp im Bildmenü in 8-Bit.
    3. Legen Sie einen roten Schwellenwert für den negativen Bereich Ölrot O fest, indem Sie den Schwellenwert im Menü "Anpassen" des Bildmenüs auswählen. Klicken Sie auf Anwenden. Machen Sie die Bildbinärdatei, indem Sie diese Option im binären Untermenü des Prozessmenüs auswählen.
      HINWEIS: Normalerweise Oil Red O Färbung variiert zwischen Chargen. Daher wird die Farbschwellenung nur innerhalb derselben Färbecharge empfohlen. Das Ergebnis sollte zusammen mit einer Beschreibung, wie der Schwellenwert bestimmt und standardisiert wurde, dargestellt werden.
    4. Analysieren Sie das Bild, indem Sie im Analysemenü Partikel analysieren auswählen und auf OK klicken. Der negative Läsionsbereich "Ölrot O" wird nun im Zusammenfassungsfenster angezeigt. Berechnen Sie die relative Ölrote O-positive Fläche, indem Sie den ölroten O-Negativbereich von der gesamten Läsionsfläche subtrahieren und dann mit der gesamten Läsionsfläche dividieren.

Representative Results

Bei Mausmodellen der Arteriosklerose entwickeln sich die prominentesten Läsionen in der Aortenwurzel und im Aortenbogen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von Arteriosklerose in der Aortenwurzel, dem Aortenbogen und der brachiocephalen Arterie in einer einzigen Maus. Messbare Läsionen in thorakal absteigender Aorta und Bauchaorta sind nur bei Tieren mit Vorerkrankungen vorhanden. In diesem Protokoll werden diese Teile nicht auf atherosklerotische Belastung analysiert, sondern für die nachfolgende Analyse von mRNA-Spiegeln oder anderen Analysen gespeichert. Serielle Abschnitte atherosklerotischer Läsionen in der Aortenwurzel werden in der Regel in einem Diagramm mit Läsionsgröße auf der y-Achse und Abstand zur Aortensinus auf der x-Achse28angezeigt. Echte Querschnitte sind entscheidend für die Quantifizierung der Läsionsgröße. Schräge Abschnitte können Läsionsgrößen überschätzen und eine Neigung von nur 20° könnte die absolute Läsionsfläche um 15%29überschätzen. Die Berechnung des Läsionsanteils der gesamten Gefäßfläche macht das Ergebnis jedoch weniger empfindlich gegenüber möglichen Winkelunterschieden während der Schnitte (Abbildung 4A). Eine geeignete statistische Methode zum Erkennen von Unterschieden zwischen Gruppen ist in der Regel eine regelmäßige 2-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA). Bonferroni-Nachtests werden dann durchgeführt, um Unterschiede auf bestimmten Ebenen zu erkennen. Fishers geringster Unterschied könnte auch als Folgetest zu ANOVA verwendet werden. Es verringert die Wahrscheinlichkeit statistischer Fehler des Typs II, berücksichtigt jedoch nicht mehrere Vergleiche. Darüber hinaus könnte es veranschaulichend sein, die Fläche unter der Kurve oder die durchschnittliche Läsionsgröße pro Maus zu berechnen und die Daten in einem Punktdiagramm darzustellen, um die individuelle Variation innerhalb der Gruppen weiter zu visualisieren (Abbildung 4B).

Oil Red O ist ein fettlöslicher, leuchtend roter Diazofarbstoff, der neutrale Lipide färbt. Polare Lipide in Zellmembranen sind nicht gefärbt. Ölrote O Färbung kann auf frischen, gefrorenen oder formalinfixierten Proben durchgeführt werden, aber nicht auf Paraffin-eingebetteten Proben aufgrund der Entfernung von Lipiden in der erforderlichen Deparaffinierung Prozess. Eine Quantifizierung der lesionalen Lipidakkumulation könnte durch Farbschwellen der Ölrot O-positiven Fläche der gesamten Läsionsfläche durchgeführt werden (Abbildung 4C). Hämatoxylin produziert eine blaue Färbung von Zellkernen, die hilfreich ist, um Plaquemorphologie zu visualisieren. Die rechten und linken Herzkranzgefäße weichen in der Regel von der Aorta um 250 m von der Aortensinus27ab, die oft mit den prominentesten Läsionsgrößen zusammenfallen. Querschnitte aus dieser Region werden häufig als repräsentative Ergebnisse angezeigt (Abbildung 4D).

Figure 4
Abbildung 4: Atherosklerotische Läsionen in der Aortenwurzel. (A) Achtundzwanzig Wochen alte männliche Knochenmarkchimäre gefüttert westliche Ernährung für acht Wochen wurden ausgewertet, um die Wirkung von Smad7-mangelhafte T-Zellen auf die Entwicklung der Arteriosklerose zu bestimmen. Experimentelle Ldlr-/- Chimären erhielten Cd4-Cre+Smad7fl/fl Knochenmark und Kontrollen erhielten Cd4-Cre+Smad7fl/+ Knochenmark. Die Grafik zeigt die Quantifizierung des atherosklerotischen Läsionsbereichs aus acht aufeinanderfolgenden Abschnitten, 100 - 800 m aus der Aortensinus, die als Läsionsfraktion der gesamten Gefäßoberfläche dargestellt wird (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, 2-Wege ANOVA mit Bonferronis Post-Test, Diagramm zeigt mittelwertige SEM, Klammern geben Signifikanzniveau für Dehnungsvergleich an). (B) Das kombinierte Punktdiagramm und Balkendiagramm zeigt den mittleren atherosklerotischen Läsionsbereich aus den Aortenwurzelabschnitten (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, Student es t-test) (C) Anteil des Öls Roter O-befleckter Bereich in den Läsionen (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, Student es t-test, ns=non-significant) (B-C) Punkte stellen einzelne Mäuse dar und Balken zeigen den Mittelwert von SEM. (D) Repräsentative Mikrographien, die Ölrot-O-Färbung zeigen (in rot Farbe) von neutralen Lipiden in der Aortenwurzel 300 m aus Aortensinus (50x Vergrößerung), Scale bar = 500 'm. *p - 0,05, ***p - 0,001. Diese Zahl wurde von Gistera et al.31geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Öl Red O könnte für die Färbung von en face vorbereiteten Aortas verwendet werden, aber dieses Protokoll verwendet Sudan IV, ein weiterer bequemer fettlöslicher Diazofarbstoff. Sudan IV visualisiert atherosklerotische Plaques in orange-roter Farbe deutlich, indem es Lipide, Triglyceride und Lipoproteine färbt. Das Entfernen des dunklen Hintergrunds in repräsentativen Bildern der en face aortenäsischen Bögen könnte die visuelle Darstellung verbessern (Abbildung 5A). Normalerweise wird die Läsionsgröße in Gruppen verteilt, was statistische Tests mit dem T-Test des Schülers zwischen Gruppen ermöglicht. Ein Punktdiagramm, das sowohl einzelne Mäuse als auch den Mittelwert zeigt, der zwischen Gruppen verglichen wird, ist eine informative Möglichkeit, die Ergebnisse anzuzeigen (Abbildung 5B-C). Da die Variation innerhalb von Gruppen in der Regel zwischen den Positionen im Gefäßbaum unterschiedlich ist, sind in der Regel separate Leistungsberechnungen erforderlich. Unnötige Abweichungen können durch Methodenkompetenz und Protokollstandardisierung vermieden werden. Die Erlangung statistisch signifikanter Ergebnisse ist wichtig, aber die biologische Relevanz für einen beobachteten Unterschied muss immer auch berücksichtigt werden.

Figure 5
Abbildung 5: Atherosklerotische Läsionen in Aortenbogen und brachiocephaler Arterie. (A) Repräsentative En-Face-Mikroskope von Aortenbögen mit lipidhaltigen Plaques, die mit Sudan IV (in orange Farbe) von 20 Wochen alten Mäusen gefärbt sind, fütterten die westliche Ernährung für zehn Wochen, zusammen visualisiert. Skala bar = 2 mm. Menschliche APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) Mäuse wurden als Kontrollen verwendet und die experimentelle Gruppe bestand aus TCR-transgenen Mäusen mit LDL-reaktiven T-Zellen (BT1) gekreuzt zu HuBL-Mäusen. (B) Atherosklerotische Läsionen im Aortenbogen (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; Schüler t-test). (C) Atherosklerotische Läsionen in der brachiocephalen Arterie (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, Student es t-test). (B-C) Punkte stellen einzelne Mäuse dar, Balken zeigen den Mittelwert "SEM. *p - 0,05" an. Diese Zahl wurde von Gistera et al.32geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Alternative Organisation von Folien für serielle Abschnitte der Aortenwurzel. Eine vereinfachte systematische Folienorganisation für die Sammlung von Abschnitten aus der Aortenwurzel. Die Sammlung ermöglicht Oil Red O Färbung für Lipide und Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Färbung. Spezielle Dias für Picrosirius rote Färbung von Kollagen werden weggelassen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind der Hauptkiller der Welt und neue präventive Messungen sind erforderlich2. Mausmodelle der Krankheit bieten eine umfassende Plattform für die Untersuchung der Pathophysiologie und experimentelle Behandlungen13. Eine zuverlässige Lesionengrößenquantifizierung ist für diesen Ansatz unerlässlich. Die Quantifizierungsmethoden unterscheiden sich jedoch von Labor zu Laboratorien. Standardisierung und Optimierung sind seit den 1980er Jahren ein kontinuierlicher Prozess13,27,33,34. Aortenwurzeln haben sich als die beliebteste Website zur Quantifizierung experimenteller Arteriosklerose herauskristallisiert. Querschnitte von Plaques ermöglichen den Vergleich des Plaquevolumens zwischen Gruppen. En-Face-Präparate werden für die Läsionsquantifizierung in größeren Segmenten der Aorta bevorzugt. Die En-Face-Methode visualisiert die Plaque-Menge und ermöglicht die Quantifizierung der Plaqueflächenabdeckung, berücksichtigt jedoch nicht die Plaquedicke. Die biologische Relevanz für beobachtete Unterschiede wird durch kohärente Ergebnisse an verschiedenen Stellen im Gefäßbaum untermauert. Die Bewertung der Entwicklung von Atherosklerose an verschiedenen Standorten befasst sich mit möglichen standortspezifischen Auswirkungen. Die Wirkung transplantierter hämatopoetischer Zellen auf die Entwicklung von Arteriosklerose kann bei hypercholesterolemmischen Ldlr-/- Chimären beurteilt werden. Die Ganzkörperbestrahlung wirkt sich jedoch auf den Arteriosklerose-Prozess mit standortspezifischen Wirkungen aus. In der Aortenwurzel werden prominentere atherosklerotische Läsionen entwickelt, während eine reduzierte Läsionsentwicklung in Aortenbögen beobachtet wird35.

Wichtig ist, dass nicht nur die Läsionsgröße in Studien zur experimentellen Arteriosklerose behandelt werden muss. Auch die Läsionszusammensetzung ist ein wichtiger Parameter. Mehrere Plaque-Merkmale wurden mit Manifestationen der Krankheit beim Menschen in Verbindung gebracht36. Serielle Schnitte der Aortenwurzel lassen mehrere Abschnitte für eine sorgfältige Analyse der Plaquezusammensetzung zur Verfügung. Plaquebruch beim Menschen ist durch eine dünne faserige Kappe mit wenigen glatten Muskelzellen, spärlichem Kollagengehalt und Entzündungszeichen in den Plaquesgekennzeichnet 36. Obwohl Plaquebruch ein seltenes Ereignis in Mausmodellen der Arteriosklerose ist, sind Marker für Plaquestabilität informativ zu bewerten. Translationale Ansätze könnten mechanistische Befunde aus Mausmodellen bestätigen und wichtige Merkmale menschlicher Krankheiten aufdecken31. Der entzündliche Status atherosklerotischer Plaques könnte durch immunhistochemische Färbung von VCAM-1, MHC-Klasse II, Makrophagen und Lymphozyten30bestimmt werden. Einige Protokolle verwenden Längsschnitte in der koronalen Ebene des Aortenbogens oder der brachiocephalen Arterie zur Messung der atherosklerotischen Läsionsgröße und Zusammensetzung37. Diese alternative Methode lässt jedoch nur wenige Abschnitte zu analysieren, was ihre Anwendungen einschränkt.

Ein erster wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Fähigkeit, Aortas effizient zu ernten. Die Hand-Augen-Koordination unter dem Mikroskop erfordert Übung und ist sowohl für die Mikrodissektion als auch für das anschließende Anheften des Aortenbogens von entscheidender Bedeutung. Der nächste wichtige Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von seriellen Abschnitten aus dem Aortenstamm. Achtzig aufeinander folgende Abschnitte sollten für jede Maus gesammelt werden, was sowohl Konzentration als auch Geduld erfordert. Methodische Fähigkeiten könnten die beschriebenen Prozesse erheblich beschleunigen. Dennoch ist die atherosklerotische Läsionsquantifizierung immer noch eine zeitaufwändige Aufgabe. Neue Technologien, automatisierte handhabung und kleintierische Bildgebung könnten die Quantifizierung experimenteller Arteriosklerose in Zukunft erleichtern. Das Fortschreiten der Arteriosklerose ist langsam und die meisten experimentellen Protokolle in Mausmodellen dauern mehr als vier Monate, um13abzuschließen. Daher müssen Aortas an Studienendpunkten optimiert gesammelt werden. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für die effiziente Ernte von Aorten und die vorgeschlagene Verarbeitung bereitet Aortas für den mehrzweckbasierten Einsatz vor, einschließlich der Läsionsquantifizierung in Aortenwurzel, Aortenbogen und brachiocephaler Arterie. Hoffentlich kann das Protokoll die experimentelle Variabilität reduzieren, die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöhen und zu Erkenntnissen führen, die den Weg für neue Behandlungen gegen Arteriosklerose ebnen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken allen ehemaligen Mitgliedern der experimentellen kardiovaskulären Forschungseinheit von Göran K Hansson, die im letzten Vierteljahrhundert an der Entwicklung dieses Protokolls mitgewirkt haben. Besonders dankbar sind wir für die Beiträge von Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson und Inger Bodin. Diese Arbeit wurde durch projektbezogene Zuschüsse 06816 und Linnaeus unterstützung 349-2007-8703 vom Schwedischen Forschungsrat und durch Zuschüsse der Schwedischen Herz-Lungen-Stiftung, des Stockholm County Council, der Professor Nanna Svartz Stiftung, Loo und Hans Osterman unterstützt. Foundation for Medical Research, Karolinska Institutet es Research Foundation and Foundation for Geriattric Diseases at Karolinska Institutet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer - To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer - For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water - - For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH - Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm) Any cell culture supplier - Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) - - Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.

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