Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av åderförkalkning hos möss

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59828
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

Summary

Murina modeller av åderförkalkning är användbara verktyg för att undersöka patogena vägar på molekylär nivå, men kräver standardiserad kvantifiering av lesion utveckling. Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att bestämma lesion storlek i de stora arteriella fartyg inklusive aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär.

Abstract

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen. Den bakomliggande orsaken i de flesta fall är åderförkalkning, som delvis är en kronisk inflammatorisk sjukdom. Experimentella studier av åderförkalkning har belyst betydelsen av kolesterol och inflammation i sjukdomsprocessen. Detta har lett till framgångsrika kliniska prövningar med farmaceutiska agenter som minskar kliniska manifestationer av åderförkalkning. Noggranna och välkontrollerade experiment i musmodeller av sjukdomen kan ytterligare belysa patogenesen av sjukdomen, som inte är helt klarlagd. Standardiserad lesionsanalys är viktigt för att minska experimentell variation och öka reproducerbarheten. Bestämma lesion storlek i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär är vanliga endpoints i experimentell åderförkalkning. Detta protokoll ger en teknisk beskrivning för utvärdering av åderförkalkning på alla dessa platser i en enda mus. Protokollet är särskilt användbart när materialet är begränsat, vilket ofta är fallet när genetiskt modifierade djur karaktäriseras.

Introduction

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen med ischemisk hjärtsjukdom och stroke redovisning för en av varje fyra dödsfall1. De flesta fall orsakas av åderförkalkning, en sjukdom som kännetecknas av en långsam ansamling av lipidbelastade plack med tecken på kronisk inflammation i stora och medelstora artärer2. Sjukdomen är oftast obemärkt under flera decennier tills en bristning eller erosion av plack framkallar en arteriell trombos som leder till ischemisk vävnadsskada.

En normal artär består av ett intima skikt med endotelceller och glest fördelade glatta muskelceller, ett media skikt med släta muskelceller och elastiska lamellerna, och en omgivande adventitial skikt med lös bindväv3. En intimial retention av LDL kompenserar åderförkalkning utveckling4. Ackumulering och modifiering av lipoproteiner leda till aggregering och Entrapment inom arteriell intima5. Ett inflammatoriskt svar framkallas av de fångade och modifierade Lipoproteinerna6. Endotelceller börjar uttrycka adhesionsmolekyler, såsom VCAM-1 på platser i arteriella träd med turbulent blodflöde, vilket leder till rekrytering av cirkulerande monocyter och andra leukocyter7. De ininfiltrerande monocyterna gör åtskillnad mellan in i makrofager det uppsluka lipid med efterföljande omformning till makrofag skumma celler8.

Åderförkalkning har studerats i musmodeller med ökande frekvens sedan mitten av 1980-talet. C57BL/6 är den mest använda inavlade mus stammen för dessa studier, och det används som genetisk bakgrund för de flesta genetiskt modifierade stammar9. Denna stam etablerades i 1920-talet10, och dess arvsmassa publicerades i 200211. Experiment i musmodeller har flera fördelar: kolonierna återger snabbt, bostäder är utrymmeseffektiva och inavel minskar experimentell variation. Modellen möjliggör också genetiska manipulationer, såsom riktade genborttagningar och införande av transgener. Detta har lett till ny patofysiologisk förståelse av sjukdomen och nya terapimål12.

Wild-Type C57BL/6 möss är naturligt resistenta mot åderförkalkning. De har de flesta av de cirkulerande kolesterolet i HDL, och komplexa aterosklerotiska lesioner bildas inte ens när matas en fettrik och hög-kolesterol diet13. Hyperkolesterolemiska möss, såsom APOE-/- på C57BL/6-bakgrunden, används därför som experimentella modeller av åderförkalkning14,15. Avsaknaden av ApoE försämrar hepatiska upptaget av rester lipoproteiner och kraftigt perturbs lipid metabolism. I APOE-/- möss, cirkulerande kolesterol är främst i VLDL partiklar, och möss utveckla komplexa aterosklerotiska plack på en regelbunden Chow diet.

Ldlr-/- möss imiterar utvecklingen av åderförkalkning ses hos människor med familjär hyperkolesterolemi16. Den ldlr-/- möss behöver en västerländsk typ diet för att utveckla åderförkalkning17. Västerländsk diet härmar mänskligt födointag och innehåller vanligtvis 0,15% kolesterol. LDL-receptorn känner igen ApoB100 och ApoE och förmedlar upptaget av LDL-partiklar genom endocytos. LDL-receptorer är grundläggande för leverclearance av LDL från cirkulationen, medan LDL-receptoruttryck i hematopoietiska celler inte påverkar denna process. Detta öppnar möjligheten för benmärgstransplantation av ldlr+/+ celler till hyperkolesterolemiska ldlr-/- mottagare och bedömning av åderförkalkning utveckling. Benmärgs chimärer har ofta använts för att studera deltagande av hematopoietiska celler i experimentell åderförkalkning. Benmärgstransplantation kan dock påverka storleken och sammansättningen av aterosklerotiska plack, vilket gör tolkningen av resultaten tvetydig.

Olika varianter av APOE-/- och ldlr-/- möss med ytterligare genetiska förändringar har utvecklats för att studera specifika processer av sjukdomen18. Ett exempel är human APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) möss som bär den fullängds mänskliga APOB100 genen19,20. Dessa möss utveckla hyperkolesterolemi och åderförkalkning på en regelbunden Chow diet. Emellertid, utvecklingen av komplexa aterosklerotiska plack tar minst sex månader och kortare experimentella protokoll brukar använda västerländska diet21. En stor del av plasmakolesterolet cirkulerar i LDL-partiklar, vilket ger hubl möss en mer människoliknande dyslipidemi lipoprotein profil jämfört med APOE-/- och ldlr-/- möss. Hubl möss tillåter också studier av Human ApoB som autoantigenet22.

Mus modellerna av åderförkalkning utveckla komplexa aterosklerotiska plack med gemensamma egenskaper hos mänskliga sjukdomar. Emellertid, plack är ganska resistenta mot bristning med efterföljande hjärtinfarkt. Atherothrombosis är endast sporadiskt upptäcks och experimentellt utmanande att bedöma23,24,25. Särskilda modeller av plack ruptur har utvecklats, men försöksområdet saknar en tillförlitlig och reproducerbar modell för bedömning av plack stabiliserande medel.

Kvantifiering av åderförkalkning har rapporterats på många sätt i litteraturen. De senaste insatserna har försökt standardisera experimentell design, utförande och rapportering av djurstudier26. Utredarna har olika preferenser och tekniker anpassade till sina laboratorier. De flesta forskningsprojekt är också unika på ett sätt som kräver vissa protokoll ändringar. På grund av sjukdomens mångfaktoriella karaktär varierar de optimala kontrollerna mellan projekten. Lokala förhållanden och bristande standardisering kan orsaka observerade skillnader i sjukdomsutveckling, vilket hämmar framstegen inom forskningsområdet. Skillnader i experimentell variation innebär också att statistiska effektberäkningar måste baseras på pilotstudier under lokala förhållanden.

Kvantifiering av åderförkalkning rekommenderas på flera ställen i kärl trädet. Detta protokoll beskriver hur man får resultat från aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artären i en enda mus, förutom att lämna resten av thoracoabdominella aorta för andra analyser. En Face preparat möjliggör snabb kvantifiering av lipidbelastade plack i aortabågen. Sjukdomsbördan i brachiocephalic artären kan också kvantifieras om proverna är noggrant visas. Ju mer tidskrävande tvärsnittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för detaljerad utvärdering av plack sammansättning.

Protocol

Alla djurförsök kräver godkännande av etiska myndigheter.

1. mus offer och Microdissection av aorta

  1. Offra musen genom CO2 kvävning och rekord vikt.
  2. Spraya musen med 70% etanol för att undvika päls förorening av proverna. Placera musen i liggande läge. Från våldsam attack notch, gör en mittlinjen snitt med Mayo sax utvidga det nästan ner till blygdbenet.
    Försiktighet: Hög procentuell etanol är mycket brandfarlig och kan orsaka allvarlig ögonirritation. Vidta försiktighetsåtgärder.
  3. Använd en 23 G nål för att exsanguinate musen genom hjärt punktering genom bröstkorgen väggen. Denna procedur ger vanligen 750 μL blod från en 20 veckor gammal mus. Typiskt, samla in halva volymen i en Tri-kalium EDTA-belagda röret och den andra halvan i ett serum eller litium heparin-belagda röret. Vrid rören försiktigt och förvara dem i rumstemperatur tills bearbetningen fortsätter.
  4. Använd Mayo sax för att klippa parietala bukhinnan i mittlinjen för att öppna bukhålan. Håll xiphoid processen med vävnad pinkoppar och skär öppna bukhinnan sidled på båda sidor och fortsätta att öppna membranet.
    1. Använd Mayo saxen för att öppna brösthålan genom att skära genom revbenen så i sidled som möjligt. Detta kommer att möjliggöra breda vinklar för instrumenten medan microdissekera aorta senare.
  5. Gör ett snitt i den högra örat för perfusion vätska dränering. Sätt i en 27 G nål genom spetsen av hjärtat i kranialriktning. Håll nålen fast i den vänstra ventrikeln medan långsamt parfymera musen med 10 mL iskall fosfat-buffrad saltlösning (PBS) under minst 2 min. Observera levern skiftande i färg och få blemmare.
    Anmärkning: Vissa protokoll använder PARAFORMALDEHYD perfusion, men detta stör flera nedströms applikationer, såsom immunohistokemi analys av lymfocyter. Därför utförs ingen perfusion fixering med PARAFORMALDEHYD i detta protokoll.
  6. Dissekera organ av intresse (t. ex. lymfkörtlar, mjälte, lever, tarm, ljumsk fett kuddar, njurar, etc.) med hjälp av anatomiska pinvor och dissekera sax.
  7. Skär luftstrupe och matstrupen på höger sida av hjärtat utan att skada aortabågen. Skär membranet och strukturer fästa inälvor till retroperitoneum, lämnar hjärta, aorta, och njurar på plats. Vik bort lungorna och inälvor caudally och täck dem med en servett att börja retroperitoneal mikrodissektion av para-aortic lymfkörtlar och bukaorta.
  8. Starta microdissection under ett stereomikroskop vid 6x förstoring. Börja dissekera aorta bifurkation genom att lyfta omgivande vävnad med Dumont pincett och skära under spänning med Vannas sax.
    1. Fortsätt dissektion av bukaorta cranially. Skär buken grenar från aorta och frigör aorta proximalt genom aorta paus i mellangärdet.
      Anmärkning: Microdissection kräver noggrann hand-öga-koordination genom stereomicroscope, som tar lite övning att behärska.
  9. Ta bort fettvävnad som täcker bröstkorg aorta. Försiktigt dissekera dorsalt av brässen att frigöra aortabågen med grenar. Fortsätt dissekera halspulsådern så distalt som möjligt i brösthålan. I speciella fall, hals dissektion kan utföras för att inkludera halspulsådern bifurcation.
  10. Rengör instrumenten genom efterföljande sköljning i avjoniserat vatten, RNase sanering lösning, 70% etanol, och PBS innan faktiskt skära aorta. Lyft hjärtat med spetsen med pinyps. Skär aorta nära hjärtat och placera hela hjärtat i ett rör med PBS. Hjärtat kan lagras på is för ett par timmar innan fortsatt bearbetning och cryomounting den aorta roten.
  11. Skär aortabågen enligt figur 1a. Sätt aortabågen i ett rör som innehåller 1 mL 4% formaldehyd över natten vid 4 ° c. Preparatet kan lagras på detta sätt under flera år före fastlåsning och analys.
    Försiktighet: Formaldehyd kan orsaka cancer, allergiska hudreaktioner, och är skadligt vid förtäring. Använd personlig skyddsutrustning efter behov.
  12. Dissekera återstående fallande aorta och lägga den i en RNA-stabilisering lösning eller Snap frysa den för efterföljande RNA-analys eller annan tillämpning. Att optimera arbetsflödet för att minimera dissekeringstid är avgörande för att undvika överdriven RNA-nedbrytning.
  13. Placera blod uppsamlings rören (insamlade i steg 1,3) i en centrifug. Snurra ner de separata plasma-och serum rören vid 1 500 x g i 15 minuter vid rumstemperatur. Överför noggrant plasma och serum till mikrocentrifugrör och förvara vid-80 ° c. Samla både EDTA och hepariniserad plasma eller serum lämnar möjligheter för flera nedströms applikationer.
  14. Placera hjärtat på en kork säng med den ventrala sidan vänd uppåt. Fäst hjärtat till korken med en nål genom spetsen. Håll basen av hjärtat med anatomiska pinvor.
    1. Använd en skalpell för att skära bort den apikala 2/3 av hjärtat med riktningen av snittet är som en linje mellan de två auricles med skalpell vinklad 20 ° caudally i sagittal planet och 20 ° kraniellt i det tvärgående planet (figur 1b).
  15. Bädda in aorta roten i optimal skärtemperatur (OCT) förening, som omger, men inte infiltrera vävnaden. Sänk basen av hjärtat i OCT förening. Pressa försiktigt hjärtat med pinpett för att fylla aorta roten med ULT och ta bort eventuella luftbubblor.
  16. Överför preparatet till botten av en cryomold fylld med OCT. Aorta roten bör nu vara vinkelrät mot bottenytan. Sätt det monterade hjärtat på torris för att frysa. Förvara exemplaren i zip-lås påsar i-80 ° c tills de bedriver kryosektionering enligt avsnitt 3 i detta protokoll.

Figure 1
Figur 1: hjärta och aorta båge in situ. (A) lungor, luftstrupe, matstrupe och bräss avlägsnas för att Visa aortabågen på plats i en 20 veckor gammal kvinnlig APOE-/- mus på regelbunden Chow diet i en Micrograph, Scale bar = 2 mm. De streckade linjerna indikerar var att klippa aortabågen och dess grenar. (B) en schematisk skildring av hjärtat och aorta. Den prickig linje i rött indikerar var att skära hjärtat innan cryomounting aorta roten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. en ansikts analys av aortabågen och brachiocephalic artär

  1. Förbered fastlåsning sängar för en ansikts analys av aorta valv. Vik ett segment av paraffinvax film åtta gånger för att göra en platt 25 mm x 25 mm yta. Linda den med svart elektrisk isolering tejp för att göra en mörk bakgrund för aorta. Placera en etikett på baksidan av den fästa sängen och använda en blyertspenna för att skriva musen identifikationsnummer (normal penna bläck kommer att försvinna i infärgningsprocessen).
  2. Överför aortabågen till den fästa sängen och placera en droppe PBS ovanpå den. Börja rengöra aorta från kvarvarande periadventitial fettvävnad under ett stereomikroskop.
    1. Använd Vannas sax och Dumont pincett att försiktigt skala bort alla omgivande fettvävnad utan att manipulera eller skada aorta. Sudan IV kommer att fläcka fettvävnad ljust och det är viktigt att ta bort alla sådana vävnader på denna punkt.
      Anmärkning: Håll aorta fuktig hela tiden tillämpa ytterligare PBS när det behövs.
  3. Klipp öppna aorta i koronala planet genom att införa Vannas saxen i aorta lumen för att avslöja intimial ytan. Börja skära den yttre krökning av stigande bågen i distala riktning och fortsätta att skära öppna grenarna inklusive brachiocephalic artär. Reservdelar den dorsala delen av fallande bröstkorg regionen.
    1. Klipp öppna mindre krökning och vik öppna aorta för att visa den intiala ytan.
      Anmärkning: Detta steg kräver finmotorik och behöver lite övning för att bemästra.
  4. Fäst den öppna bågen till den fästa sängen med den trubbiga änden av minutien insekt stift. Använd en Micro Castroviejo nål hållare för att sätta stiften på plats. Böj försiktigt stiften bort från preparatet när de är på plats. Stift aorta platt på sängen utan att sträcka ut preparatet. Förvara den fästa bågen vänd nedåt i en petriskål fylld med PBS vid 4 ° c.
    Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
  5. Förbered en fungerande lösning av Sudan IV. Blanda 1 g Sudan IV pulver, 100 mL 70% etanol, och 100 mL aceton i en mörk flaska och försiktigt rör om i 10 min. Det finns ingen anledning att filtrera lösningen och det kan användas för ett par månader om det hålls mörkt i rumstemperatur. Om infärgnings färgen inte är tillfredsställande, kan en ny lösning göras och proverna färgas igen.
    Försiktighet: Aceton är en brandfarlig vätska som kan orsaka allvarlig ögonirritation. Förvara på en väl ventilerad plats och vidta försiktighetsåtgärder vid hantering.
  6. Ordna fem petriskålar på Lab bänk: en fylld med 70% etanol, en fylld med Sudan IV arbetslösning, två fyllda med 80% etanol, och en fylld med PBS.
    1. Börja med att skölja preparatet i 70% etanol i 5 min genom att placera den fästa sängen i den första petriskål med bågen vänd nedåt. Överför preparatet till Sudan IV arbetslösning och låt det fläcka bågen i 7 min.
    2. Nästa, skölj i 80% etanol för 3 min två gånger för att destain den normala intimial yta. Avfärgning tid kan justeras för att optimera resultaten. Slutligen, skölj i PBS innan du sätter preparatet tillbaka till den ursprungliga petriskål.
  7. Förvärva mikrografer med ett stereomikroskop på 10 gånger förstoring ansluten till en digitalkamera. Ta bilder av den fästa bågen nedsänkt i PBS med små metall vikter (20 mm x 10 mm x 5 mm) att hålla fästa sängen till botten av en petriskål. Placera en linjal bredvid aorta för kalibrering av bilden.
  8. Använd en bildanalysprogram (t. ex. ImageJ) för att bestämma lesion område och total intimial yta. I brist på anatomiska landmärken för att definiera aortabågen, mätning utförs vanligtvis från början av aorta ascendens ner till den första interkostal gren (figur 2A). Använd området kvantifiering funktionen i programvaran för att manuellt omringa det totala intimans Arch området.
    Anmärkning:     lesion kvantifieringen bör göras på ett förblindat sätt och det är tillrådligt att en andra utredare bekräftar resultaten.
    1. I ImageJ väljer du verktyget polygonmarkering och omger det totala bågen-området med repetitiva klick. Välj sedan mått i menyn analysera för att visa området total båge i resultatfönstret.
    2. Nästa, omringa alla Sudan IV-färgade plack i bågen. Sudan IV är en lysokrom Diazo färgämne som fläckar lipider, triglycerider, och lipoproteiner med en orange-röd färg. I ImageJ, Välj verktyget FreeHand Selection och omsluta alla plack medan du trycker på Alt-tangenten. Klicka på mått i menyn analysera för att visa det lesion-fria Arch-området i resultatfönstret.
    3. Beräkna relativ lesion område genom att subtrahera den lesion-fria området från den totala bågen området och sedan dividera resultatet med den totala bågen området.
  9. Försiktigt stift subclavia och carotis artärer att aktivera lesion kvantifiering i brachiocephalic artär (figur 2A). Kvantifiering av lesioner i subclavia artärer och gemensamma halspulsåder är oftast mycket utmanande och inte meningsfullt, respektive.
    1. I ImageJ, omringa båda bitarna av braciocephalic artären med hjälp av polygon markeringsverktyget medan du trycker på Shift-tangenten. Klicka på mått i menyn analysera för att visa det totala området med brachiocephalic-artären i resultatfönstret.
    2. Välj sedan verktyget FreeHand Selection och omsluta alla plack i brachiocephalic artären medan du trycker på Alt-tangenten. Klicka på mått i menyn analysera för att visa det lesionsfria brachiocephalic-artärområdet i resultatfönstret.
    3. Beräkna relativ lesion område genom att subtrahera den lesion-fria området från den totala brachiocephalic artär området och sedan dividera resultatet med den totala brachiocephalic artär område.

Figure 2
Figur 2: kvantifiering av aterosklerotisk lesion. (A) aortabågen från en 20 veckor gammal manlig mänsklig APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) mus matas västerländsk diet för tio veckor fästs öppna och färgas för lipid-rika plack med Sudan IV. Totalt aortabågen yta beskrivs med den streckade linjen i vitt i Micrograph, Scale bar = 2 mm. De streckade linjerna i gult beskriver den totala ytan av brachiocephalic artären. (B) aorta root tvärsnitt vid 400 μm från aorta sinus i en 20 veckor gammal hane ldlr-/- mus matas västerländsk diet för åtta veckor visualiseras i en Mikrograf, Scale bar = 500 μm. De streckade linjerna i svart kontur den totala fartyget området och aterosklerotiska lesioner färgade med olja röd O lokaliserad i arteriell intima. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. kryosektionering av aorta roten

  1. Ställ in kryostattemperaturen vid-20 ° c och snittjockleken till 10 μm. Montera ULT blocket som innehåller aorta roten på preparathållaren med ventrikulär vävnad vänd utåt. När du börjar skära, finjustera justeringen av sektions ytan för att vara parallell med preparathållaren.
  2. Ta bort överdriven omgivande OCT för att göra det lättare att samla sektioner utan veck. Aorta roten bör nu placeras vinkelrätt mot knivbladet med tanke på att basen av hjärtat placerades korrekt i mögel.
  3. Samla inledande kontroll sektioner på vanliga Mikroskop diabilder, som kommer att kasseras. De första avsnitten bör endast innehålla hjärtmuskel vävnad. Förloppet snittningen med 200 μm vid tidpunkten. Samla ett avsnitt och kontrollera förloppet med ett ljusmikroskop.
  4. När du närmar dig den vänstra ventrikeln utflöde tarmkanalen, kontrollera varje 100 μm under mikroskopet. När initiala indikationer på en kärl vägg observeras, sakta ner takten till 50 μm.
    Anmärkning: När den första aorta KUSP visas, detta kommer att vara punkt noll för att samla sektioner. Det kan vara svårt att se när kuspar visas exakt, men en exakt lokalisering är avgörande för att utföra jämförelser av lesioner i samma region.
  5. Luta preparatet mot punkten noll KUSP att anpassa avsnittet planet med de två andra cusps. Detta är avgörande för att få sanna tvärsnitt av aorta. Gör en ritning av aorta roten, som anger de kuspar som de visas, och räkna varje 10 μm avsnitt som skärs från punkt noll och framåt.
    1. När en andra KUSP visas, luta preparatet något igen bort från KUSP för att justera preparatet med den tredje KUSP. Nivåskillnaden mellan kuspar bör inte överstiga 50 μm. börja samla sektioner på diabilder från nivå 90 μm och framåt.
    2. Samla sektioner enligt bild planeringen i figur 3. Insamling av sektioner kan startas från 190 μm om aorta roten är mer än 50 μm lutas, för att möjliggöra ytterligare utrymme för att anpassa roten i en rak position. Fortsätt snittningen tills du når nivå 800 μm från punkt noll. Om det fortfarande finns synliga plack på denna nivå, kan samlingen utökas till 1 000 μm.
      Anmärkning: En förenklad bild organisation presenteras i kompletterande figur 1, vilket kan öka snittningshastigheten. Den optimala glid planeringen bör avgöras beroende på projektplanen.
  6. Åtgärda avsnitten efter samlingen.
    1. Fixera de sektioner som samlats in för olja röd O färgning och Picrosirius rödfärgning av kollagen i 4% formaldehyd i 10 min. Skölj i avjoniserat vatten, torka och förvara i rumstemperatur tills du fortsätter med avsnitt 4 i detta protokoll. Om diabilder bör färgas med olja röd O genast och är fortfarande våt, placera dem i 60% isopropanol för 1 min för att påskynda torkprocessen.
      Försiktighet: Isopropanol är en brandfarlig vätska som kan orsaka allvarlig ögonirritation och kan orsaka dåsighet eller yrsel. Förvara på en väl ventilerad plats och vidta försiktighetsåtgärder vid hantering.
    2. Fixera de sektioner som samlats in för immunohistokemi eller immunofluorescens i iskall ren aceton i 10 min. torka i rumstemperatur i 30 min. Förvara sektioner i-20 ° c.

Figure 3
Figur 3: organisering av diabilder för serie avsnitt av aorta roten. Under kryosektionering av aorta roten varje 10 μm tjock sektion som spänner över den första 800 μm av aorta ascendens bör samlas in. En systematisk bild organisation behövs för att erhålla lämpliga sektioner för olika tillämpningar. Analys av lesion sammansättning innehåller vanligtvis olja röd O färgning för lipider och Picrosirius rödfärgning för kollagen. Resterande sektioner samlas in och aceton-fixeras för immunohistokemi och färgning av immunofluorescensteknik. Denna siffra har modifierats från Gisterå et al30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. olja röd O färgning och kvantifiering av åderförkalkning i aorta rötter

  1. Bered en mättad olja röd O-lösning genom att lösa upp 1 g Oljeröd O i 100 mL isopropanol. Rör om lösningen i en mörk flaska i 1 timme vid rumstemperatur. Den mättade lösningen kan förvaras i flera månader.
    Anmärkning: Det är tillrådligt att ha utsett laboratorieutrustning för olja röd O färgning eftersom det är svårt att rengöra utrustning som har varit i kontakt med lösningen.
  2. Bered en fungerande lösning genom att blanda 75 mL av den mättade oljan röd O-lösning med 50 mL avjoniserat vatten. Låt stå i rumstemperatur i 10 min. filtrera genom ett kvalitativt filterpapper.
  3. Placera glidbanorna i olja röd O arbetslösning för 20 min. Skölj i kranvatten i 5 min.
  4. För att hjälpa vävnad visualisering, fläcken med Mayer ' s hematoxylin för 1 min. Skölj i ljummet kranvatten i 5 min. Alla kärnor bör nu färgas i blå färg, justera infärgnings tiden för att optimera resultatet.
  5. Montera diabilder i ett vattenhaltigt monteringsmedium (t. ex. kejsar glycerolgelatin). Värm Kaiser ' s glycerolgelatin till 40 ° c för att göra det flytande före användning. Det är inte nödvändigt att torka av bilderna eftersom monterings mediet är vattenbaserat. Var noga med att undvika luftbubbla bildas när du lägger till täckglaset.
    Försiktighet: Kaiser ' s glycerolgelatin innehåller fenol, som misstänks orsaka genetiska defekter. Använd personlig skyddsutrustning efter behov.
  6. Förvärva digitala mikrografer med hjälp av en kamera ansluten till ett ljusmikroskop. Vanligtvis hela fartyget vägg och lesion gränser kunde tydligt visualiseras av 50 gånger förstoring. Spara högupplösta bilder, helst i TIFF (Tagged Image File Format).
  7. Utföra analys av lesion storlek med hjälp av en datorstödd bildanalys mjukvarusystem. Oil Red O är en lysokrom Diazo färg som fläckar neutrala lipider och visualiserar aterosklerotiska plack med en intensiv röd färg, som hjälper lesion kvantifiering.
    Anmärkning:     lesionskvantifiering bör göras på ett förblindat sätt och det är tillrådligt att en andra utredare bekräftar de erhållna resultaten.
    1. Använd områdes kvantifieringsfunktionen i bildanalys programmet för att definiera den totala fartygs arealen genom att inringa den yttre elastiska lamina på aorta kärlens vägg (figur 2b). I ImageJ väljer du verktyget polygonmarkering och omger området med repetitiva klick. Välj sedan mått på analysera-menyn. Området total Vessel visas i resultatfönstret.
    2. Fortsätt att kvantifiera de aterosklerotiska lesioner i det intiala skiktet av kärlet, definieras av den inre elastiska lamina och den luminala gränsen. Vanligtvis är skador på ventilcusps undantagna från mätningen27. I ImageJ, Välj verktyget FreeHand Selection och omsluta alla plack medan du trycker på Alt-tangenten. Välj Mät i menyn analysera för att visa det lesion-fria fartygs området i resultatfönstret.
    3. Beräkna det relativa lesionsområdet genom att subtrahera det lesionfria området från den totala fartygs arealen och dividera resultatet med den totala fartygs arealen.
      Anmärkning: Kalibrera resultaten i bildanalysprogram varan enligt den använda förstoringen för att få absolut lesion område i kvadrat mikrometer.
  8. Definiera den Oljeröda O-färgade området i lesioner med hjälp av en färg tröskel funktion i bildanalysprogram för att beräkna andelen olja röd O positivt område av totala lesion område.
    1. I ImageJ, omringa alla lesion område med hjälp av FreeHand markeringsverktyget medan du trycker på Shift-tangenten. Välj mått i menyn analysera för att visa total lesion-området är i resultatfönstret.
    2. Välj Rensa utanför på Redigera-menyn. Ändra bildtypen till 8-bitars i bild-menyn.
    3. Ange ett rött tröskelvärde för Oljerött O negativt område genom att välja tröskelvärde på undermenyn justera på bild-menyn. Klicka på Verkställ. Gör bildbinärfilen genom att välja det här alternativet på undermenyn binär på process-menyn.
      Anmärkning: Vanligtvis olja röd O färgning varierar mellan partier. Därför rekommenderas endast färg tröskel inom samma färgningsbatch. Resultatet ska presenteras tillsammans med en beskrivning av hur tröskeln fastställdes och standardiserades.
    4. Analysera bilden genom att välja analysera partiklar i menyn analysera och klicka på OK. Totalt olje rött O negativt lesion-område visas nu i sammanfattningsfönstret. Beräkna den relativa oljan röd O positivt område genom att subtrahera olja röd O negativt område från den totala lesion området och sedan dividera med den totala lesion området.

Representative Results

I musmodeller av åderförkalkning de mest framträdande lesioner tenderar att utvecklas i aorta roten och aortabågen. Detta protokoll beskriver kvantifiering av åderförkalkning i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär i en enda mus. Mätbara lesioner i bröstkorg fallande aorta och bukaorta är endast närvarande hos djur med förskott sjukdom. I detta protokoll, dessa delar är inte analyseras för aterosklerotisk börda, men sparas för efterföljande analys av mRNA nivåer eller andra analyser. Seriella avsnitt av aterosklerotiska lesioner i aorta roten är vanligtvis visas i ett diagram med lesion storlek på y-axeln och avståndet till aorta sinus på x-axeln28. True tvärsnitt är avgörande för kvantifiering av lesionsstorlek. Sneda sektioner kan överskatta lesionstorlekar och en tippning av endast 20 ° kan överskatta den absoluta lesionsytan med 15%29. Beräkningen av lesionfraktionen av den totala fartygs arealen gör dock att resultatet blir mindre känsligt för möjliga vinkel skillnader under snittning (figur 4a). En lämplig statistisk metod för att upptäcka skillnader mellan grupper är vanligtvis en vanlig 2-vägs analys av varians (ANOVA). Bonferroni efter tester utförs sedan för att upptäcka skillnader på vissa nivåer. Fisher ' s minst signifikanta skillnaden kan också användas som ett uppföljnings test till ANOVA. Det minskar sannolikheten för statistiska fel i typ II, men tar inte hänsyn till flera jämförelser. Dessutom kan det vara belysande att beräkna arean under kurvan eller den genomsnittliga lesionsstorleken per mus och presentera data i en punktkomplott för att ytterligare visualisera enskilda variationer inom grupperna (figur 4b).

Oil Red O är ett fettlösligt ljust rött Diazo färgämne, som fläckar neutrala lipider. Polära lipider i cellmembran är inte färgade. Olja röd O färgning kan utföras på färska, frysta eller formalin-fasta prover, men inte på paraffin-inbäddade prover på grund av avlägsnande av lipider i den nödvändiga avparaffinering process. En kvantifiering av lesionell lipidackumulering kan utföras genom att färg tröskel hålls i det Olröda O-positiva området för total lesionsareal (figur 4c). Hematoxylin ger en Blåfärgning av cellkärnor, vilket är till hjälp för att visualisera plack morfologi. Höger och vänster kranskärl avviker vanligtvis från aorta runt 250 μm från aorta sinus27, som ofta sammanfaller med de mest framträdande lesion storlekar. Tvärsnitt från denna region visas ofta som representativa resultat (figur 4D).

Figure 4
Figur 4: aterosklerotiska lesioner i aorta roten. (A) tjugoåtta veckor gamla manliga benmärg chimärer matas västerländsk kost under åtta veckor utvärderades för att fastställa effekten av Smad7-bristfällig T-celler på åderförkalkning utveckling. Experimentell ldlr-/- chimärer fått CD4-CRE+Smad7fl/fl benmärg och kontroller fått CD4-CRE+Smad7fl/+ benmärg. Grafen visar kvantifiering av aterosklerotisk lesion område från åtta på varandra följande avsnitt, 100-800 μm från aorta sinus visas som lesion fraktion av totala kärlet yta (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ldlr-/- n = 9, 2-vägs ANOVA med Bonferroni ' s post test, diagram visar medelvärdet ± SEM, hängslen indikerar signifikansnivå för stam jämförelse). (B) den kombinerade dot Plot och stapeldiagram visar medelvärdet aterosklerotisk lesion området från aorta roten avsnitt (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, Students t-test) (C) fraktion av oljerött O-färgat område i lesioner (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, Students t-test, ns = icke-signifikanta) (B-C) prickar representerar enskilda möss och staplar visar medelvärdet ± SEM.D) representativa mikrografer som visar oljeröd O-färgning (i rött färg) av neutrala lipider i aorta roten 300 μm från aorta sinus (50x förstoring), Scale bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Denna siffra har modifierats från Gisterå et al.31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Olja röd O kan användas för färgning av en Face beredda aortas, men detta protokoll använder Sudan IV, en annan lämplig fettlösliga Diazo färgämne. Sudan IV visualiserar tydligt aterosklerotiska plack i en orange-röd färg genom färgning av lipider, triglycerider och lipoproteiner. Ta bort den mörka bakgrunden i representativa bilder av en Face aorta valv kan förbättra den visuella displayen (figur 5a). Vanligtvis fördelas lesionsstorlek normalt inom grupper, vilket möjliggör statistisk testning med Students t-test mellan grupper. En punktplot som visar både enskilda möss och medelvärdet, som jämförs mellan grupper, är ett informativt sätt att visa resultaten (Figur 5b-C). Eftersom variationen inom grupper vanligtvis skiljer sig mellan olika platser i det vaskulära trädet, behövs vanligtvis separata kraft beräkningar. Onödig variation kan undvikas genom metodkunskaper och protokoll standardisering. Att få statistiskt signifikanta resultat är viktigt, men den biologiska relevansen för en observerad skillnad måste alltid beaktas.

Figure 5
Figur 5: aterosklerotiska lesioner i aortabågen och brachiocephalic artär. (A) representativa en Face mikrografer av aorta valv med lipid-lastade plack färgade med Sudan IV (i orange färg) från 20 veckor gamla möss matas västerländsk kost i tio veckor, visualiseras tillsammans. Skalbar = 2 mm. Human APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) möss användes som kontroller och den experimentella gruppen bestod av TCR-transgena möss med LDL-reaktiva T-celler (filen Bt1) som korsavlade till hubl -möss. (B) aterosklerotiska lesioner i aortabågen (Hubl n = BT1xHuBL n = 12; Students t-test). (C) aterosklerotiska lesioner i brachiocephalic artären (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, Students t-test). (B-C) Prickar representerar enskilda möss, staplar visar medelvärdet ± SEM. *p ≤ 0,05. Denna siffra har modifierats från Gisterå et al.32. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: alternativ organisation av diabilder för seriella delar av aorta roten. En förenklad systematisk bild organisation för insamling av sektioner från aorta roten. Samlingen möjliggör olja röd O färgning för lipider och immunohistokemi eller immunofluorescensfärgning. Dedikerade diabilder för Picrosirius rödfärgning av kollagen utelämnas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Discussion

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta mördaren i världen och nya förebyggande mätningar behövs2. Musmodeller av sjukdomen ger en omfattande plattform för utredning av patofysiologi och experimentella behandlingar13. Kvantifiering av tillförlitlig lesionsstorlek är avgörande för denna metod. Kvantifieringsmetoderna skiljer sig dock åt mellan laboratorierna. Standardisering och optimering har varit en pågående process sedan 1980-talet13,27,33,34. Aorta rötter har dykt upp som den mest populära platsen för att kvantifiera experimentell åderförkalkning. Tvärsnitt av plack möjliggör jämförelse av plack volym mellan grupper. En Face preparat gynnas för lesion kvantifiering i större segment av aorta. En Face-metoden visualiserar plack kvantitet och möjliggör kvantifiering av plack område täckning, men inte ta plack tjocklek i konto. Den biologiska relevansen för observerade skillnader motiveras av sammanhängande resultat på olika platser i det vaskulära trädet. Utvärdera åderförkalkning utveckling på olika platser adresser möjliga platsspecifika effekter. Effekten av transplanterade hematopoietiska celler på åderförkalkning utveckling kan bedömas i hyperkolesterolemisk ldlr-/- chimärer. Men hela kroppen bestrålning påverkar åderförkalkning processen med platsspecifika effekter. Mer framträdande aterosklerotiska lesioner utvecklas i aorta roten, medan minskad lesion utveckling observeras i aorta Arches35.

Viktigt, inte bara lesion storlek behöver åtgärdas i studier av experimentell åderförkalkning. Lesion sammansättning är också en viktig parameter. Flera plack funktioner har förknippats med manifestationer av sjukdomen hos människor36. Seriell snittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för noggrann analys av plack sammansättning. Plack ruptur hos människor kännetecknas av en tunn fibrös mössa med få glatta muskelceller, glesa kollagen innehåll och tecken på inflammation i plack36. Även plack ruptur är en sällsynt händelse i musmodeller av åderförkalkning, markörer för plack stabilitet är informativa att utvärdera. Translationella tillvägagångssätt kan bekräfta mekanistiska resultat från musmodeller och avslöja viktiga egenskaper hos mänskliga sjukdomar31. Inflammatoriska status av aterosklerotiska plack kan bestämmas genom immunohistokemi färgning av VCAM-1, MHC klass II, makrofager, och lymfocyter30. Vissa protokoll använder längsgående sektioner i koronala planet i aortabågen eller brachiocephalic artär för att mäta aterosklerotisk lesion storlek och sammansättning37. Emellertid, denna alternativa metod lämnar endast få delar som ska analyseras, som begränsar dess applikationer.

Ett initialt kritiskt steg i detta protokoll är förmågan att skörda artärer effektivt. Hand-öga-koordination under mikroskopet kräver övning och är avgörande både för microdissection och den efterföljande fastlåsning av aortabågen. Nästa kritiska steg i detta protokoll är insamling av seriella sektioner från aorta roten. 80 sammanhängande avsnitt ska samlas in för varje mus, vilket kräver både fokus och tålamod. Metodiska färdigheter skulle kunna påskynda de beskrivna processerna avsevärt. Ändå, aterosklerotisk lesion kvantifiering är fortfarande en tidskrävande uppgift. Ny teknik, automatiserad hantering och smådjur avbildning kan underlätta kvantifiering av experimentell åderförkalkning i framtiden. Utvecklingen av åderförkalkning är långsam och de flesta experimentella protokoll i musmodeller tar mer än fyra månader att slutföra13. Därför måste artärer samlas in på ett optimerat sätt vid studieslut punkter. Detta protokoll ger en omfattande guide till skörd artärer effektivt och den föreslagna bearbetningen förbereder artärer för multi-purpose användning inklusive lesion kvantifiering i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär. Förhoppningsvis protokollet kan minska experimentell variation, förbättra tillförlitligheten i resultaten, och leda till resultat som kommer att bana väg för nya behandlingar mot åderförkalkning.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar alla tidigare medlemmar i Göran K Hanssons experimentella kardiovaskulära forskningsenhet som hjälpte till att utveckla detta protokoll under det senaste kvarts århundradet. Vi är särskilt tacksamma för bidragen från Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson och Inger Bodin. Detta arbete stöddes av projekt Grant 06816 och Linnéstöd 349-2007-8703 från Vetenskapsrådet, samt av bidrag från hjärt-Lungstiftelsen, Stockholms läns landsting, professor Nanna Svartz stiftelse, Loo och hans Osterman Stiftelsen för medicinsk forskning, Karolinska Institutets forskningsstiftelse och Stiftelsen för geriatriska sjukdomar vid Karolinska Institutet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer - To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer - For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water - - For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH - Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm) Any cell culture supplier - Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) - - Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Tags

Immunologi och infektion åderförkalkning ApoE knockout möss Ldlr knockout möss aorta dissektion Microtomy färgning olja röd O Sudan IV
Kvantifiering av åderförkalkning hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J.,… More

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter