Somatiske mutation mønstre i celler afspejler tidligere mutagene eksponering og kan afsløre udviklingsmæssige Lineage relationer. Præsenteret her er en metode til at katalogisere og analysere somatiske mutationer i individuelle hæmatopoietiske stem og stamceller.
Hæmatopoietisk stamme og stamceller (Hspc’er) akkumulerer gradvist DNA-mutationer i løbet af en levetid, hvilket kan bidrage til aldersrelaterede sygdomme som leukæmi. Karakterisering mutation ophobning kan forbedre forståelsen af etiologien af aldersrelaterede sygdomme. Præsenteret her er en metode til at katalogisere somatiske mutationer i individuelle Hspc’er, som er baseret på hel-genomsekvensering (WGS) af klonale primære cellekulturer. Mutationer, der findes i den oprindelige celle, deles af alle celler i den klonale kultur, hvorimod mutationer erhvervet in vitro efter celle sortering er til stede i en delmængde af celler. Derfor giver denne metode mulighed for nøjagtig påvisning af somatiske mutationer til stede i genomer af individuelle Hspc’er, som akkumuleres i løbet af livet. Disse kataloger over somatiske mutationer kan give værdifuld indsigt i de mutationale processer, som er aktive i det hæmatopoietiske væv, og hvordan disse processer bidrager til leukemogenesen. Ved at vurdere somatiske mutationer, der deles mellem flere Hspc’er af samme person, kan der desuden fastsættes klonal Lineage-relationer og populationsdynamik for blod populationer. Da denne fremgangsmåde bygger på in vitro-udvidelse af enkeltceller, er metoden begrænset til hæmatopoietiske celler med tilstrækkelig replikerende potentiale.
Eksponering af hæmatopoietiske stamceller og progenitorcellerne (Hspc’er) til endogene eller ydre mutagene kilder bidrager til den gradvise ophobning af mutationer i DNA under en levetid1. Gradvis mutation akkumulering i hspcs1 kan resultere i aldersrelateret klonal hematopoiese (bue)2,3, som er en ikke-symptomatisk tilstand drevet af hspc’er transporterer leukæmi-driver mutationer. I første omgang blev det troet, at personer med bue har en øget risiko for leukæmi2,3. Men, nylige undersøgelser har vist en incidens af 95% af bue hos ældre personer4, gør foreningen med maligniteter mindre klar og rejse spørgsmålet om, hvorfor nogle personer med Arch til sidst gøre eller ikke udvikler maligniteter. Ikke desto mindre, somatiske mutationer i Hspc’er kan udgøre alvorlige sundhedsmæssige risici, som myelodysplastiske lidelser og leukæmi er karakteriseret ved tilstedeværelsen af specifikke Cancer driver mutationer.
For at identificere de mutationer processer og studere blod-clonality, mutation ophobning i individuelle Hspc’er skal karakteriseres. Mutations processer efterlader karakteristiske mønstre i genomet, såkaldte Mutations signaturer, som kan identificeres og kvantificeres i Genome-dækkende samlinger af mutationer5. For eksempel har eksponering for UV-lys, alkylerende midler og defekter i DNA-reparations veje hver især været forbundet med en anden Mutations signatur på6,7. Hertil kommer, på grund af den stokastiske karakter af mutation ophobninger, de fleste (hvis ikke alle) af de erhvervede mutationer er unikke mellem celler. Hvis mutationer deles mellem flere celler af samme person, indikerer det, at disse celler deler en fælles forfader8. Derfor, ved at vurdere fælles mutationer, kan Lineage relationer bestemmes mellem celler og en udviklingsmæssige Lineage træ kan konstrueres filial af gren. Katalogisering af sjældne somatiske mutationer i fysiologisk normale celler er imidlertid teknisk udfordrende på grund af det sunde væsens polyklonale karakter.
Præsenteret her er en metode til præcist at identificere og bestemme somatiske mutationer i genomer af individuelle Hspc’er. Dette indebærer isolation og klonal ekspansion af HSPCs in vitro. Disse klonale kulturer afspejler den genetiske makeup af den oprindelige celle (dvs., mutationer i den oprindelige celle vil blive delt af alle andre celler i kulturen). Denne fremgangsmåde giver os mulighed for at opnå tilstrækkelig DNA til hele genomsekvensering (WGS). Vi har tidligere vist, at mutationer akkumuleret in vitro under klonal kultur vil blive delt af en delmængde af celler. Dette muliggør filtrering af alle in vitro-mutationer, da disse vil være til stede i en mindre brøkdel af læsninger sammenlignet med in vivo erhvervede mutationer9. Tidligere metoder har fået tilstrækkelig DNA fra en enkelt celle til WGS ved hjælp af helgenomome amplifikation (WGA)10. Men den største ulempe ved WGA er dens relativt fejlbehæftede og ubalanceret forstærkning af genomet, hvilket kan resultere i allel dropouts11. Da denne fremgangsmåde imidlertid er baseret på in vitro-udvidelse af enkeltceller, er den begrænset til blodlegemer med et tilstrækkeligt replikerende potentiale, hvilket ikke er tilfældet for WGA-afhængige metoder. Tidligere indsats sekventering klonale kulturer har påberåbt sig ved hjælp af feeder lag for at sikre klonal forstærkning af enkelt HSPCs12. DNA fra feeder-lagene kan dog potentielt forurenes DNA i de klonale kulturer, hvilket er en blanding af de efterfølgende Mutations kald og filtrering. Den metode, der præsenteres her, er udelukkende afhængig af det specificerede medium til at udvide enkelt Hspc’er, og undgår derfor udstedelse af DNA-kontaminering. Indtil nu har vi med succes anvendt denne metode på menneskelige knoglemarv, navlestrengsblod, bæredygtigt frosset knoglemarv, og perifert blod.
Præsenteret her er en metode til at detektere mutationer, der akkumuleres underlivet i individuelle Hspc’er og til at konstruere en tidlig udviklingsmæssige Lineage træ ved hjælp af disse mutation data.
Flere kritiske krav skal opfyldes for at kunne udføre disse assays. For det første skal det sikres, at stikprøven er rentabel. Hurtig håndtering af prøven er nøglen til at sikre effektiviteten af proceduren. For det andet, tab af vækstfaktor styrke vil indvirke negativt på klonal ekspansion af Hspc’er. For at sikre høj vækstfaktor styrke, er det vigtigt at undgå fryse-tø cyklusser og forberede engangs-Aliquots. For det tredje, efter at have udført WGS, mutation Calling og filtrering, er det afgørende at validere den klonale kulturs clonalitet. For at bekræfte den clonalitet af kulturen, VAF af mutationer bør klynge omkring af 0,5 i en karyotypisk normal prøve (figur 3). I celler med en lav Mutations belastning, såsom navlestrengsblod hspc’er, er det vanskeligere at bestemme clonalitet på grund af de lave mutation tal.
Vores tilgang er afhængig af in vitro-udvidelse af enkeltceller for at give mulighed for WGS. Derfor er vores tilgang begrænset til celler, der har det replikerende potentiale til at ekspandere, såsom Hspc’er. I vores hænder, omkring 5%-30% af alle enkelt-sorteret celler er i stand til at ekspandere tilstrækkeligt. Reducerede udvækstsatser kan potentielt resultere i en selektions skævhed. Som diskuteret tidligere, metoder ved hjælp af WGA kan overvinde denne udvælgelse bias som denne teknik er ikke stole på udvidelsen af celler. WGA har dog sine egne mangler, og klonal forstærkning er den eneste metode til præcist at bestemme antallet af mutationer i hele genomet uden alleliske dropouts og lige dækning langs genomet, især i prøver med lav true somatiske Mutations numre.
De data, der genereres ved hjælp af denne metode, kan anvendes til at bestemme fylogenier af det hæmatopoietiske system, da mutationer detekteret i enkeltceller kan bruges til at dissekere celle lineages, som afbildet i figur 6. Typisk kan en eller to mutationer definere hver gren i en sund donor1. Da nedstamningens gren tidligt efter undfangelsen, vil mutationer definere disse første grene også være til stede med en lav VAF i den matchede normale prøve, der blev brugt til filtrering af kimcelle varianter1,18,19. I dette tilfælde er brugen af ikke-hæmatopoietiske celler, såsom MSCs, foretrækkes, da de forventes at adskille meget tidligt under udviklingen fra det hæmatopoietiske system. Da T-celler er af hæmatopoietisk oprindelse, brugen af disse celler som en matchet normal prøve til at filtrere kimcelle varianter kunne derfor forvirre opførelsen af den tidligste forgrening af den udviklingsmæssige Lineage træ. Subklonal tilstedeværelse af gren specifikke mutationer i visse modne blod populationer, som kan måles ved målrettet dyb sekvensering, vil indikere, at afkom af denne gren kan give anledning til denne modne celletype. Desuden giver vores tilgang mulighed for at vurdere de muterede konsekvenser af mutagen eksponering in vivo og i sidste ende, hvordan dette kan bidrage til leukæmi udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af en VIDI Grant af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (no. 016. Vidi. 171.023) til R. v. B.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |