Somatiska Mutations mönster i celler återspeglar tidigare mutagen exponering och kan avslöja utvecklingsmässiga härstamning relationer. Presenteras här är en metod för att katalogisera och analysera somatiska mutationer i enskilda hematopoietiska Stem och stamceller.
Hematopoietisk Stem och stamceller (HSPCs) ackumuleras successivt DNA-mutationer under en livslängd, vilket kan bidra till åldersrelaterade sjukdomar som leukemi. Karakteriserande mutation ackumulering kan förbättra förståelsen för etiologi av åldersrelaterade sjukdomar. Presenteras här är en metod för att katalogisera somatiska mutationer i enskilda HSPCs, som bygger på hela-Genomsekvensering (WGS) av klonala primära cellkulturer. Mutationer som förekommer i den ursprungliga cellen delas av alla celler i den klonala kulturen, medan mutationer som förvärvats in vitro efter cell sortering förekommer i en delmängd celler. Därför, denna metod möjliggör korrekt detektion av somatiska mutationer som finns i genomen av enskilda HSPCs, som ackumuleras under livet. Dessa kataloger av somatiska mutationer kan ge värdefulla insikter i mutationella processer aktiva i den hematopoietiska vävnaden och hur dessa processer bidrar till leukemogenes. Dessutom, genom att bedöma somatiska mutationer som delas mellan flera HSPCs av samma individ, klonala härstamning relationer och populationsdynamik av blod populationer kan bestämmas. Eftersom detta tillvägagångssätt bygger på in vitro-expansion av enskilda celler, metoden är begränsad till hematopoietiska celler med tillräcklig replikativ potential.
Exponering av hematopoietisk stam och stamceller (HSPCs) till endogena eller extrinsic mutagena källor bidrar till den gradvisa ansamling av mutationer i DNA under en livslängd1. Gradvis mutation ackumulering i hspcs1 kan resultera i åldersrelaterade klonala hematopoies (Arch)2,3, vilket är ett icke-symptomatiskt tillstånd som drivs av hspcs transporterar leukemi-driver mutationer. Inledningsvis, det var tänkt att personer med Arch har en ökad risk för leukemi2,3. Emellertid, nyare studier har visat en incidens av 95% av ARCH hos äldre individer4, att göra föreningen med maligniteter mindre tydlig och ta upp frågan om varför vissa individer med Arch så småningom göra eller inte utveckla maligniteter. Icke desto mindre, somatiska mutationer i HSPCs kan innebära allvarliga hälsorisker, som myelodysplastiska störningar och leukemi kännetecknas av närvaron av specifika cancer driver mutationer.
För att identifiera Mutations processer och studera blod clonality, mutation ackumulering i enskilda hspcs måste kännetecknas. Mutations processer lämnar karakteristiska mönster i genomet, så kallade Mutations signaturer, som kan identifieras och kvantifieras i genomomfattande samlingar av mutationer5. Till exempel, exponering för UV-ljus, alkylerande agenter, och defekter i DNA reparations vägar har varje förknippats med en annan Mutations signatur6,7. Dessutom, på grund av den stokastiska karaktären av mutation ackumulationer, de flesta (om inte alla) av de förvärvade mutationer är unika mellan celler. Om mutationer delas mellan flera celler av samma individ, indikerar det att dessa celler delar en gemensam förfader8. Därför, genom att bedöma gemensamma mutationer, härstamning relationer kan bestämmas mellan celler och en utvecklingsmässig härstamning träd kan konstrueras gren för gren. Katalogisering av ovanliga somatiska mutationer i fysiologiskt normala celler är dock tekniskt utmanande på grund av den polyklonala karaktären hos friska vävnader.
Presenteras här är en metod för att korrekt identifiera och bestämma somatiska mutationer i genomen av enskilda HSPCs. Detta innebär isolering och klon expansion av HSPCs in vitro-. Dessa klonala kulturer återspeglar den genetiska makeup av den ursprungliga cellen (dvs, mutationer i den ursprungliga cellen kommer att delas av alla andra celler i kulturen). Detta tillvägagångssätt gör att vi kan få tillräckligt med DNA för hela Genomsekvensering (WGS). Vi har tidigare visat att mutationer som samlats in vitro under klon kulturen kommer att delas av en delmängd av cellerna. Detta möjliggör filtrering av alla in vitro-mutationer, eftersom dessa kommer att förekomma i en mindre del av läsningar jämfört med in vivo förvärvade mutationer9. Tidigare metoder har erhållit tillräckligt med DNA från en enda cell för WGS med hjälp av helarvs-amplifiering (WGA)10. Hur… än, den huvudsaklig nackdel av WGA är dess relativt misstag-liggande och obalanserad förstärkning om genomet, vilken kanna resultera i allel avbrott11. Icke desto mindre, eftersom detta tillvägagångssätt bygger på in vitro-expansion av enskilda celler, är det begränsat till blodkroppar med tillräcklig replikativ potential, vilket inte är fallet för WGA-beroende metoder. Tidigare försök att sekvensera klonala kulturer har förlitat sig på att använda matar skikt för att säkerställa klonala amplifiering av enstaka HSPCs12. Men DNA från matar lagren kan potentiellt förora DNA av de klonala kulturerna, confounding den efterföljande mutationen ringer och filtrering. Den metod som presenteras här enbart förlitar sig på specificerade medium för att klandra expandera enda HSPCs, och därför undviker frågan om DNA-kontaminering. Fram till nu har vi framgångsrikt tillämpat denna metod på mänsklig benmärg, navelsträngsblod, klara sig fryst benmärg, och perifert blod.
Presenteras här är en metod för att upptäcka mutationer som ackumulerats under livet i enskilda HSPCs och att konstruera en tidig utveckling härstamnings träd med hjälp av dessa Mutations data.
Flera kritiska krav måste uppfyllas för att kunna utföra dessa analyser. För det första måste provets genomförbarhet säkerställas. Snabb hantering av provet är nyckeln för att säkerställa effektiviteten i förfarandet. För det andra, förlust av tillväxtfaktor styrka kommer att negativt påverka den klonala expansionen av HSPCs. För att säkerställa hög tillväxtfaktor potens, är det viktigt att undvika frysning-Tina cykler och förbereda engångsanvändning alikvoter. Tredje, efter att ha utfört WGS, mutation ringer och filtrering, är det viktigt att validera clonality av den klonala kulturen. För att bekräfta clonality av kulturen, VAF av mutationerna bör klustret runt av 0,5 i en karyotypiskt normalt prov (figur 3). I celler med en låg mutationell belastning, såsom navelsträngsblod HSPCs, är det svårare att avgöra clonality på grund av de låga Mutations siffrorna.
Vår strategi bygger på in vitro-expansion av enskilda celler att tillåta WGS. Därför är vårt tillvägagångssätt begränsat till celler som har replikativ potential att clalt expandera, till exempel HSPCs. I våra händer, ca 5%-30% av alla ensorterade celler kan expandera tillräckligt. Reducerade uttillväxthastigheter kan potentiellt resultera i en urvals avvikelse. Som diskuterats tidigare, metoder med hjälp av WGA kan övervinna detta val bias eftersom denna teknik är inte beroende av utbyggnaden av celler. Emellertid, WGA har sina egna brister, och klon förstärkning är fortfarande den enda metoden för att exakt bestämma antalet mutationer i hela genomet utan alleliska avbrott och lika täckning längs genomet, särskilt i prover med låg sann somatiska Mutations nummer.
De data som genereras med hjälp av denna metod kan användas för att bestämma fylogenier av det hematopoietiska systemet, eftersom de mutationer som upptäcks i enstaka celler kan användas för att dissekera cell linjer, som avbildas i figur 6. Typiskt, en eller två mutationer kan definiera varje gren i en hälsosam givare1. Eftersom linjer filial tidigt efter befruktningen, mutationer som definierar dessa första grenar kommer också att finnas med en låg VAF i det matchade normala provet som användes för filtrering av köns cells varianter1,18,19. I detta fall, användning av icke-hematopoietiska celler, såsom MSCs, är att föredra eftersom de förväntas separera mycket tidigt under utvecklingen från det hematopoietiska systemet. Som T-celler är av hematopoietiska ursprung, användning av dessa celler som en matchande normal prov för att filtrera köns cells varianter kunde därför blanda ihop byggandet av den tidigaste förgreningen av utvecklings-härstamning träd. Subklonala närvaron av branschspecifika mutationer i vissa mogna blod populationer, som kan mätas genom riktad djupsekvensering, kommer att indikera att avkomman från denna gren kan ge upphov till den mogna celltypen. Dessutom gör vårt tillvägagångssätt för att bedöma de mutationella konsekvenserna av mutagen exponering in vivo och i slutändan hur detta kan bidra till leukemi utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av a a VIDI bevilja av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (nr. 016. Vidi. 171.023) till R. v. B.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |