Summary
여기에서, 우리는 키토산 필름에 의하여 인간 치주 인대 (PDL) 세포 스페로이드를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 3차원(3D) 세포 스페로이드의 배양은 기존의 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 배양 시스템에 대한 대안을 제공한다.
Abstract
치주 인대 (PDL) 세포는 치주 조직 재생에 대한 큰 약속을 보유하고. 종래, PDL 세포는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)과 같은 2차원(2D) 기판에 배양된다. 그러나, PDL 세포의 특징적인 변화는 시험관 내 배양 동안 관찰되었다. 이러한 현상은 아마도 2D TCPS가 생체 내 3차원(3D) 미세 환경과 다르기 때문일 것이다. 2D 기질에서 배양된 세포에 비해, 3D 미세환경에서 자란 세포는 생체내 세포와 더 유사성을 나타낸다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 기존의 2D 단층 세포 배양에 대한 유망한 대안을 제공한다. 기존의 PDL 세포 배양 모델을 개선하기 위해, 우리는 최근에 키토산 필름에 PDL 세포의 스페로이드 형성을 기반으로 하는 3D 세포 배양 방법을 개발했습니다. 여기에서, 우리는 키토산 필름에 근거를 둔 상세한 세포 스페로이드 배양 프로토콜을 제시합니다. PDL 세포 스페로이드의 3D 배양 시스템은 기존의 2D 단층 세포 배양과 관련된 몇 가지 한계를 극복하고, 따라서 향후 치주 조직 재생을 위한 향상된 치료 효능을 가진 PDL 세포를 생산하는데 적합할 수 있다.
Introduction
치주염은 주로 치석 1에의해 초기화되며 치주 인대 (PDL), 폐포 뼈 및 시멘트를 포함한 치주 조직의 손상을 특징으로합니다. 치주염에 대한 현재의 치료법은 일반적으로 활성 질환의 진행을 예방하는 데 성공적이지만 손실 된 치주 조직의 재생은 임상 적 과제로 남아 있습니다. 최근, 현재 치료2,3,4의 단점을 극복하기 위해 치주조직 재생을 위한 세포기반 접근법에서 중요한 진전이 이루어지고 있다.
우리의 이전 체계적인 검토는 PDL 세포가 치주재생을 위한 중대한 잠재력을 보였다는 것을 밝혔습니다 5. 종래, PDL 세포는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)과 같은 2차원(2D) 기판에 배양된다. 그러나, PDL 세포의 특징적인 변화는 시험관내 배양 동안 관찰되었다 6. 이러한 현상은 아마도 2D TCPS가 생체 내 3차원(3D) 미세환경7과다르기 때문일 것이다. 2D 기질에서 배양된 세포에 비해, 3D 미세환경에서 성장한 세포는생체내 세포8과 더 유사성을 나타낸다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 기존의 2D 단층 세포 배양에 대한 유망한 대안을 제공한다.
기존의 3D 배양 방법은 3D 생체 재료로 세포를 캡슐화하는 것입니다. 3D 생체 재료에 캡슐화 된 세포와 비교하여, 세포 스페로이드는 이물질이 없는 세포의 응집체이기 때문에 생체 내상황을 더 밀접하게 모방9,10,11, 12. 세포 스페로이드는 섬유넥틴 및 라미닌(13)을 포함하는 세포외 매트릭스(ECM) 성분의보존을 통해 MSC 생체활동을 촉진한 것으로 보고된다. 종래의 PDL 세포 배양 모델을 개선하기 위해, 우리는 최근에 키토산필름(14)에PDL 세포의 스페로이드 형성을 기반으로 하는 3D PDL 세포 배양 방법을 개발하였다. 스페로이드 형성은 PDL세포(14)의자가 재생 및 골성 분화 용량을 증가시킵니다. 여기서, 키토산 필름에 기초한 상세한 PDL 세포 스페로이드 배양 프로토콜을 제시한다. PDL 세포 스페로이드의 3D 배양 시스템은 기존의 TCPS 세포 배양과 관련된 몇 가지 단점을 극복하고, 따라서 향후 치주 조직 재생을 위한 향상된 치료 효능을 가진 PDL 세포를 생산하는데 적합할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
연구 프로토콜은 동지대학교 학교및병원윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자는 서면 에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. PDL 세포 격리
- PDL 세포 배양을 위한 증식 배지를 만드세요: α-MEM 배지에 10% FCS와 100 U/mL 펜/스트렙을 보충했습니다.
- 얼음이 담긴 용기를 준비하여 고립된 세 번째 어금니를 옮김을 옮김을 옮김을 준비합니다.
- 오토클레이브를 사용하여 수술 기구를 살균하십시오.
- 일반 인체는 동지시대학교 치과병원 과 병원에서 성인(18-28세)으로부터 3번째 어금니를 추출합니다.
- 세 번째 어금니를 증식 배지에 넣고 4 °C에서 실험실로 옮니다.
- 추출된 치아를 멸균 된 100mm 페트리 접시에 놓고 생물학적 위험 층류 흐름 후드 내에서 작동합니다.
- 추출된 치아를 세척하기 위해 10 mL의 PBS를 추가합니다. 세탁 단계를 두 번 반복합니다.
- 멸균 메스를 사용하여 PDL을 뿌리에서 부드럽게 분리합니다.
참고 : PDL은 치은 또는 정점 조직에서 오염을 방지하기 위해 뿌리의 중간 세 번째 부분에서 긁어해야합니다. - 멸균 된 메스 블레이드의 도움으로 1-2mm 조각으로 PDL을 다듬습니다.
- PDL 단편을 3-4 mL의 증식 배지로 채워진 T-25 배양 플라스크에 놓습니다.
- 가습공기와 함께 5% CO2에서 37°C에서 인큐베이터에서 샘플을 배양하였다.
- PDL 세포의 자성장 후 배양 배지를 변화시큐어가 관찰하였다. 그것은 일반적으로 소요 1-2 PDL 세포의 파생주. 역상 대조 현미경을 통해 PDL 세포의 성장을 관찰하십시오.
- 그 후 일주일에 두 번 배양 매체를 변경합니다.
- PDL 세포가 합류에 도달했을 때, 1:4의 비율로 배양 된 세포 (대원 1).
- 매일 세포 성장을 관찰하고 일주일에 두 번 배양 배지를 변경합니다.
- 세포가 80 % 합류를 달성 한 후 1 :4의 비율로 각 후속 통로를 수행합니다. 세포 파종을 위해 3-5세대 PDL 세포를 사용한다.
2. 키토산 필름 준비
- 1% (v/v) 아세트산 용액을 준비하려면 깨끗한 유리 비커에 이중 증류수 495 mL에 5 mL의 아세트산을 추가하십시오.
- 1 % w / v 키토산 용액의 제조를 위해 5g의 키토산 분말 (평균 분자량 400 kDa, 85 % 아세틸화)을 측정하고 1 % (v / v) 아세트산 용액의 495 mL를 추가하십시오.
- 60°C에서 교반 막대 및 자기 교반 플레이트로 준비된 용액을 24시간 동안 저어줍니다.
- 키토산의 완전한 용해를 보장하기 위해 제조된 용액을 오토클레이브한다.
참고: 이 단계에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. - 키토산 필름을 형성하려면 0.25 mL / cm 2에서 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)접시에 1 % w / v 키토산 용액을 추가하십시오. 예를 들어, 0.5 mL의 1% w/v 키토산 용액을 24 –well 플레이트 중 하나에 추가합니다.
- TCPS 접시를 60°C에서 오븐에서 24시간 동안 건조하여 키토산 필름을 형성한다.
- 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH)을 준비하십시오. 한 번에 조금씩 NaOH 10 g을 마그네틱 교반 막대를 사용하여 대량의 이중 증류수로 저은 다음 용액을 희석하여 0.5 L을 만듭니다.
참고: 물에 NaOH를 추가하십시오- 단단한 NaOH에 물을 추가하지 마십시오. NaOH를 만지지 마십시오! 그것은 화학 화상을 일으킬 수 있습니다. - 0.5 N NaOH로 키토산 필름을 중화. 0.5 mL의 0.5 n NaOH 용액을 2시간 동안 24웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다.
- 이중 증류수로 키토산 필름을 세 번 씻으소서.
참고: 이 단계에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. - 세포 파종 에 앞서, 실온에서 밤새 70 % 알코올에 키토산 코팅 24 웰 플레이트를 살균.
- 실온에서 PBS로 키토산 코팅 플레이트를 3회 헹구어 줍니다.
- 실온에서 밤새 자외선 하에서 처리하여 키토산 코팅 플레이트를 살균합니다.
3. 셀 시딩
- 37°C에 예온 증식 배지 PBS 용액 및 트립신/EDTA 용액.
- T-75 세포 배양 플라스크로부터 상급체를 버린다.
- 10 mL의 PBS 용액으로 동수 PDL 세포를 세척하십시오.
- PBS 솔루션을 폐기합니다.
- T-75 세포 배양 플라스크에 트립신/EDTA 용액 1mL를 추가합니다.
- 37 °C에서 3 분 동안 트립신 / EDTA 용액으로 세포를 배양하십시오.
- T-75 세포 배양 플라스크에 3 mL의 증식 배지를 추가하여 트립신의 소화 과정을 종료합니다.
- 제조된 세포 현탁액을 15 mL 원점 원심분리관으로 옮김.
- 300 x g 및 실온에서 5 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다.
- 15 mL 원점 원심 분리관에서 상급자를 버리고 증식 배지의 500 μL에서 세포 펠릿을 다시 현탁시합니다.
- 혈세포계로 PDL 세포를 세다.
- 종자 PDL 세포는 0.5 x 104,1 x 104,3 x 104,및 6 x 104 세포 /cm2의 밀도에서.
- 가습공기와 함께 5% CO2에서 37°C에서 인큐베이터에서 키토산 필름상에 PDL 세포를 배양하였다.
- 그 후 일주일에 두 번 배양 매체를 변경합니다.
- 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일에는 역상 대조 현미경을 통해 세포 형태를 매일 관찰합니다.
4. 세포 생존
- 배양 후 1, 3, 및 6일 후, 상업적 생존/세포 독성 키트를 사용하여 세포의 생존을 결정한다.
- 15 mL 튜브에서, 5s에 대한 소용돌이에 의해 PBS에서 2 mM의 칼세인-AM 및 4 mM의 신선한 용액의 2 mL을 준비한다.
참고 : 어둠 속에서 프로세스를 유지합니다. - 배양 배지를 제거하고 PBS에서 스페로이드를 세척합니다.
- 2 mM calcein-AM 및 4 mM 에티듐 호모디머를 포함하는 PBS의 인큐베이트 스페로이드를 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- PBS에서 스페로이드를 두 번 헹구세요. 24웰 플레이트 중 한 우물에서 나온 스페로이드의 경우 매번 2 mL의 PBS를 사용하십시오.
- 10x 또는 20배 배율을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 샘플을 관찰합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
본 프로토콜을 사용하여, 생존 가능한 PDL 세포 스페로이드가 성공적으로 형성되었다. 도 1은 부착된 세포 대신에 부유세포 또는 스페로이드가 주로 키토산 막에서 관찰되었다는 것을 보여주었다. 0.5 x 104 세포/cm2의파종 밀도의 경우, 부착된 PDL 세포는 1일째와 3일에 때때로 발견되었고, PDL 세포 스페로이드는 거의 관찰되지 않았다. 반대로, 3 x 104 및 6 x 104 세포/cm2의파종 밀도에 대해, PDL 세포 스페로이드의 다양한 크기는 1 일째부터 발견되었다. PDL 세포 스페로이드 형성은 3일 후 모든 파종 밀도로부터 관찰되었다. 도1에 나타낸 바와 같이, 3 x 104 세포/cm2는 PDL 세포 파종 밀도에서 PDL 세포 파종 밀도가 균질했기 때문에 최적의 PDL 세포 파종 밀도였다. 배양의 5 일 후에, 더 큰 스페로이드는 모든 세포 파종 밀도를 형성했다. 일시 중단된 PDL 세포는 5일째에 거의 발견되지 않았다.
스페로이드에서 PDL 세포의 생존능력은 1일, 3일 및 6일 후에 평가되었다. 도2에 나타낸 바와 같이, 스페로이드에 있는 세포의 대다수는 1일째, 3일 및 6일째에 살아있는 세포였다. 6 일째에 죽은 세포의 수는 중앙 부분에서 증가했습니다.
그림 1. PDL 세포 스페로이드의 형태.
0.5 x 104 세포 /cm2의파종 밀도의 경우, PDL 세포 스페로이드는 1 일째와 3 일에 거의 관찰되지 않았습니다. 3 x 104 및 6 x 104 세포 /cm2의파종 밀도의 경우, PDL 세포 스페로이드의 다양한 크기는 1 일째부터 발견되었습니다. PDL 세포 스페로이드 형성은 3일 후 모든 파종 밀도로부터 관찰되었다. 배양의 5 일 후에, 더 큰 스페로이드는 모든 세포 파종 밀도를 형성했다. 일시 중단된 PDL 세포는 5일째에 거의 발견되지 않았다. 스케일 바: 200 μm. 이 수치는 Yan et al.14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 키토산 필름에 대한 PDL 세포 스페로이드의 생존가능성.
스페로이드에서 PDL 세포의 생존능력은 1일, 3일 및 6일 후에 평가되었다. 여기에 도시된 바와 같이, 스페로이드에 있는 세포의 대다수는 1일, 3, 및 6일에 살아있는 세포이었습니다. 6 일째에 죽은 세포의 수는 중앙 부분에서 증가했습니다. 스케일 바: 200 μm. 이 수치는 Yan et al.14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 연구는 기존의 2D 단층 세포 배양과 관련된 몇 가지 한계를 극복하기 위해 3D 세포 배양 시스템을 도입하였다. 프로토콜에 따르면, PDL 세포 스페로이드는 키토산 필름상에 세포를 배양함으로써 성공적으로 형성되었다. 우리의 이전 연구는 스페로이드 형성이 PDL 세포의 자기 갱신 및 골성 분화 능력을 증가시키는 것을 보고했다14. TCPS에서 세포를 수확하는 효소를 사용하는 대신, PDL 세포 스페로이드는 단순히 배지를 몇 번14번피펫팅하여 키토산 필름에서 수확할 수 있었다. 따라서, ECM 및 세포간 접합부는 잘 보존될 수 있다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: (1) 수술 기구 및 키토산 필름이 세포 배양을 위해 살균되는지 확인; (2) 치은질 또는 정점 조직에서 오염을 피하기 위해 뿌리의 중간 세 번째 부분에서 PDL을 긁어; (3) PDL 세포의 성공적인 스페로이드 형성을 위해 더 높은 세포 파종 밀도 (≥3 x 104 세포 / cm2)를 요구합니다.
그러나, 이 방법에 대한 한 가지 제한은 PDL 세포의 증식 감소가 스페로이드 형성(14) 후에 관찰되었다는 것입니다. 세포주15. 이는 아마도 스페로이드 세포와 단층세포(16)사이의 사이클린 의존성 키나아제 억제제의 조절의 차이에 기인한다. 임상 적용에 도움이 되기 위해 세포 스페로이드의 증식을 촉진하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
세포 스페로이드의 또 다른 단점은 코어에서 부적절한 확산이다. PDL 세포는 주로 스페로이드 배양에서 살아 있었지만, 죽은 세포의 수는 6일째에 스페로이드의 중앙 부분에서 증가하였다. 이러한 현상은 PDL 세포 스페로이드가17,18로커짐에 따라 스페로이드 코어에서 산소와 영양분의 확산이 손상되기 때문일 것이다.
세포 스페로이드를 유도하기 위해 보고된 다른 방법은 비부착면19,마이크로웰20,스피너 플라스크21,마이크로패턴 표면22,23,매달기 방울24,및 강제 집계 기술25. 앞서 언급한 방법에 비해 키토산 필름은 비교적 비용 효율적이고 재현하기 쉽습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 키토산(26)의 항균 성질이며, 이는 시험관 내 세포 배양에 상당히 유익하다.
요약하자면, 여기서 우리는 키토산 필름을 기반으로 상세한 3D 세포 스페로이드 배양 프로토콜을 제시한다. PDL 세포 스페로이드의 배양은 통상적인 2D TCPS 세포 배양과 관련된 몇 가지 한계를 극복하고, 따라서 향후 치주 조직 재생을 위한 향상된 치료 효능을 가진 PDL 세포를 생산하는데 적합할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC 81700978), 중앙 대학 (1504219050), 상하이 자연 과학 재단 (17ZR1432800), 상하이 의료 탐사 프로젝트 ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
