Summary
ここでは、ヒト歯周靭帯(PDL)細胞スフェロイドをキトサン膜で培養するプロトコルを紹介する。三次元(3D)細胞スフェロイドの培養は、従来の組織培養ポリスチレン(TCPS)培養システムに代わるものとなる。
Abstract
歯周靭帯(PDL)細胞は、歯周組織再生に大きな期待を持っています。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養中にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境と異なるためと考えられます。2D基板で培養した細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞とより類似性を示します。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D細胞培養法を最近開発した。ここでは、キトサンフィルムに基づく詳細な細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来の2D単層細胞培養に関連する制限の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。
Introduction
歯周炎は、主に歯垢1によって初期化され、歯周靭帯(PDL)、肺胞骨、およびセメントを含む歯周組織の損傷によって特徴付けされる。歯周炎の現在の治療は、通常、活動性疾患の進行を防ぐことに成功しているが、失われた歯周組織の再生は臨床的な課題のままである。近年、歯周組織再生のための細胞ベースのアプローチにおいて、現在の治療2、3、4の欠点を克服するための重要な進歩がなされている。
我々の以前の系統的レビューは、PDL細胞が歯周再生5に大きな可能性を示したことを明らかにした。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養6の間にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境7と異なるためと考えられます。2D基板上で培養された細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞8とより類似性を示す。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。
従来の3D培養法は、細胞を3Dバイオマテリアルに封入する。3Dバイオマテリアルに封入された細胞と比較して、細胞スフェロイドは、異物9、10、11を含まない細胞の凝集体であるため、生体内の状況をより密接に模倣する。12.細胞スフェロイドは、フィブロネクチンおよびラミニン13を含む細胞外マトリックス(ECM)成分の保存を介してMSC生物活性を促進したと報告されている。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム14上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D PDL細胞培養法を最近開発した。スフェロイド形成は、PDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させた。ここでは、キトサン膜に基づく詳細なPDL細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来のTCPS細胞培養に関連する欠点の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。
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Protocol
研究プロトコルは、トンジ大学の学校と胃科の病院の倫理委員会によって承認されました.すべての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
1. PDLセル分離
- PDL細胞の培養のための増殖培地を作る:10%FCSおよび100 U/mLペン/ストレップを補充したα-MEM培地。
- 隔離された第3モルを転送するために氷で容器を準備します。
- オートクレーブを使用して手術器具を殺菌します。
- トンジ大学の医学部・病院の歯科医院で、成人(18~28歳)から正常なヒトに影響を受けた第3の臼歯を抽出する。
- 増殖培地に第3モルを入れ、4°Cで実験室に移す。
- 抽出した歯を無菌の100mmペトリ皿に入れ、バイオハザード層流フード内で作業します。
- 抽出した歯を洗浄するためにPBSの10 mLを追加します。洗浄手順を2回繰り返します。
- 無菌メスを使用して、PDLを根元から穏やかに分離します。
注:PDLは、歯肉または頂点組織からの汚染を避けるために、根の中央の3番目の部分から削り取る必要があります。 - 殺菌されたメスの刃の助けを借りて1-2-mmの断片にミンチPDL。
- PDLフラグメントをT-25培養フラスコに入れ、増殖培地の3〜4mLで満たします。
- 加湿空気で5%CO2で37°Cのインキュベーターでサンプルを培養する。
- PDL細胞の増殖後に培養培地を変化させた。PDL細胞の増殖には通常1~2週間かかります。逆相コントラスト顕微鏡を介してPDL細胞の増殖を観察します。
- その後、培養培地を週2回変更する。
- PDL細胞が合流に達すると、サブ培養細胞の比は1:4(経通路1)である。
- 毎日細胞の増殖を観察し、週に2回培養培地を変更する。
- 細胞が80%の合流を達成した後、1:4の比率で各後続の通過を行います。セルシードには、第 3 世代から第 5 世代の PDL セルを使用します。
2. キトサンフィルムの製作
- 1%(v/v)酢酸溶液の調製のために、きれいなガラスビーカーに495 mLの二重蒸留水に酢酸の5 mLを追加します。
- 1%w/vキトサン溶液の調製のために、キトサン粉末の5g(平均分子量400kDa、アセチル化の85%程度)を重量を量り、1%(v/v)酢酸溶液の495 mLに添加する。
- 60°Cで攪拌バーと磁気攪拌プレートで24時間調理した溶液をかき混ぜます。
- キトサンの完全な溶解を確実にするために、準備された溶液をオートクレーブします。
注: 実験は、この段階で一時停止できます。 - キトサンフィルムを形成するには、0.25 mL/cm2で組織培養ポリスチレン(TCPS)皿に1%w/vキトサン溶液を加えます。例えば、1%w/vキトサン溶液の0.5 mLを24ウェルプレートの1つのウェルに加えます。
- 60°Cのオーブンで24時間TCPS皿を乾燥し、キトサンフィルムを形成します。
- 0.5N N水酸化ナトリウム(NaOH)を調調します。10gのNaOHを少しずつ、磁気攪拌棒を用いて大量の二重蒸留水にかき混ぜ、溶液を希釈して0.5Lにする。
注:水にNaOHを追加する -- 固体NaOHに水を追加しないでください。ナオに触らないで!化学的な火傷を引き起こす可能性があります。 - 0.5 N NaOHでキトサンフィルムを中和します。0.5 N NaOH溶液の0.5 mLを24ウェルプレートの1つのウェルに2時間加えます。
- キトサンフィルムを二重蒸留水で3回洗います。
注: 実験は、この段階で一時停止できます。 - 細胞播種の前に、室温で一晩70%アルコールでキトサンコーティングされた24ウェルプレートを殺菌します。
- 室温でPBSで3回キトサンコーティングプレートを洗い出します。
- 室温で一晩紫外線下で処理することにより、キトサンコーティングプレートを殺菌します。
3. 細胞播種
- 37°Cに対する予め温拡散培地PBS溶液およびトリプシン/EDTA溶液。
- 上清をT-75細胞培養フラスコから廃棄する。
- 10 mLのPBS溶液でコンフルエントPDL細胞を洗浄します。
- PBS ソリューションを破棄します。
- T-75細胞培養フラスコに1mLのトリプシン/EDTA溶液を添加する。
- トリプシン/EDTA溶液で細胞を37°Cで3分間インキュベートします。
- T-75細胞培養フラスコに3mLの増殖培地を添加してトリプシンの消化プロセスを終了する。
- 調製したセル懸濁液を15 mLの円錐遠心管に移します。
- 300 x gおよび室温で5分間懸濁液を遠心分離する。
- 15 mLの円錐遠心管から上清を廃棄し、増殖培地の500μLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 血球計でPDL細胞を数えます。
- 0.5 x 10 4、1 x 104、3x 104、および 6 x 104セル/cm2の密度でシード PDL 細胞 。
- 加湿空気を含む5%CO2で37°Cのインキュベーター中のキトサンフィルム上の培養PDL細胞。
- その後、培養培地を週2回変更する。
- 1日目、2日目、3日目、4日目、5日目に、逆相コントラスト顕微鏡を介して毎日細胞形態を観察する。
4. 細胞生存率
- 1、3、および6日間の培養後、市販の生存率/細胞傷害性キットを用いて細胞の生存を決定する。
- 15mLチューブで、5秒の渦でPBS中の2mMカルセインAMおよび4 mMエチジウムホモジマーの新鮮な溶液の2 mLを調製する。
注:暗闇の中でプロセスを維持します。 - 培養培地を取り出し、PBSでスフェロイドを洗浄します。
- 暗闇の中で室温で30分間2mMカルセインAMおよび4 mMエチジウムホモジマーを含むPBSの中でスフェロイドをインキュベートする。
- PBSで2回スフェロイドをすすいでくす。24ウェルプレートの1つのウェルからのスフェロイドの場合は、毎回2 mLのPBSを使用します。
- 10倍または20倍の倍率を使用して蛍光顕微鏡を使用してサンプルを観察します。
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Representative Results
本プロトコルを用いて、生存可能なPDL細胞スフェロイドが正常に形成された。図1は、付着した細胞の代わりに懸濁細胞またはスフェロイドが主にキトサンフィルムで観察されたことを示した。0.5 x 104細胞/cm2の播種密度については、1日目と3日目に付着したPDL細胞が時折見つかり、PDL細胞スフェロイドはめったに観察されなかった。それどころか、3 x 104および6 x 104細胞/cm2の播種密度については、1日目以降、様々なサイズのPDL細胞スフェロイドが見出された。PDL細胞スフェロイド形成は、3日後に全ての播種密度から観察された。図1に示すように、PDL細胞スフェロイドの大きさがこの細胞播種密度において均質であったため、3 x 104細胞/cm2が最適なPDL細胞種分密度であった。培養の5日後、すべての細胞播種密度についてより大きなスフェロイドが形成された。中断されたPDL細胞は5日目にめったに見つからなかった。
スフェロイド中のPDL細胞の生存率を1、3、6日後に評価した。図2に示すように、スフェロイド中の細胞の大部分は1日目、3日目、6日目に生細胞であった。6日目には、中央部で死細胞の数が増加した。
図 1.PDL細胞球体スフェロイドの形態。
0.5 x 104細胞/cm2の播種密度については、PDL細胞スフェロイドが1日目と3日目にめったに観察されなかった。3 x 104および6 x 104細胞/cm2の播種密度については、1日目以降、様々なサイズのPDL細胞スフェロイドが見出された。PDL細胞スフェロイド形成は、3日後に全ての播種密度から観察された。培養の5日後、すべての細胞播種密度についてより大きなスフェロイドが形成された。中断されたPDL細胞は5日目にめったに見つからなかった。スケールバー:200 μm。この図は Yan et al.14から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.キトサンフィルム上のPDL細胞スフェロイドの生存率
スフェロイド中のPDL細胞の生存率を1、3、6日後に評価した。ここに示すように、スフェロイド中の細胞の大半は1日目、3日目、6日目に生きた細胞であった。6日目には、中央部で死細胞の数が増加した。スケールバー:200 μm。この図は Yan et al.14から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、従来の2D単層細胞培養に関するいくつかの制限を克服するために、3D細胞培養システムを導入した。プロトコルによると、PDL細胞スフェロイドはキトサンフィルム上の細胞を培養することによって正常に形成された。我々の以前の研究は、スフェロイド形成がPDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させたことを報告した。TCPSから細胞を採取するために酵素を使用する代わりに、PDL細胞スフェロイドは、単に培地を数回14回ピペッティングすることによってキトサンフィルムから収穫することができる。したがって、ECMおよび細胞間接合部は十分に保存することができる。
このプロトコルの重要なステップは、(1)手術器具とキトサンフィルムが細胞培養のために殺菌されていることを確認します。(2) 歯肉または頂点組織からの汚染を避けるために、根の中央の3番目の部分からPDLを削り取る;そして(3)PDL細胞の正常なスフェロイド形成のために、より高い細胞播種密度(≥3 x 104細胞/cm2)を必要とする。
しかし、この方法の1つの制限は、肝細胞形成14の後にPDL細胞の増殖の減少が観察されたことです, これは脂肪間質細胞10と肝細胞癌に行われたいくつかの以前の研究に類似していますセルライン15.これはおそらく、スフェロイドと単層細胞16との間のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤の調節の違いによって引き起こされる。臨床応用に役立つには、細胞スフェロイドの増殖を促進するためのさらなる研究が必要である。
細胞球体のもう一つの欠点は、コアの不十分な拡散である。PDL細胞は主にスフェロイド培養において生きていたが、6日目にスフェロイドの中央部で死細胞の数が増加した。この現象は、PDL細胞スフェロイドが大きくなるにつれて、酸素と栄養素の拡散がスフェロイドコアで損なわれるため、おそらく17,18であった。
細胞スフェロイドを誘導すると報告された他の方法は、非付着面19、マイクロウェル20、スピナーフラスコ21、マイクロパターン表面22、23、吊り下げ24、および強制集約手法25.前述の方法に比べ、キトサンフィルムは比較的費用対効果が高く、再現が容易です。この方法のもう一つの利点は、チトサン26の抗菌特性であり、これはインビトロ細胞培養に有意に有益である。
要約すると、ここではキトサンフィルムに基づく詳細な3D細胞スフェロイド培養プロトコルを提示する。PDL細胞スフェロイドの培養は、従来の2D TCPS細胞培養に関連するいくつかの制限を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC 81700978)、中央大学基礎研究基金(1504219050)、上海自然科学財団(17ZR1432800)、上海医療探査プロジェクト()17411972600)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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