Summary
Aqui, nós apresentamos protocolos de cultivo de esferoides da pilha do ligamento periodontal humano (PDL) por películas do quitosana. A cultura de esferoides celulares tridimensionais (3D) fornece uma alternativa ao sistema convencional da cultura do poliestireno da cultura do tecido (TCPs).
Abstract
As pilhas do ligamento peridental (PDL) prendem a grande promessa para a regeneração peridental do tecido. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). Entretanto, as mudanças características de pilhas de PDL foram observadas durante a cultura in vitro. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura da pilha 3D, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas do quitosana. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das limitações relativas à cultura convencional da pilha da monocamada 2D, e pode assim ser apropriada produzindo pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.
Introduction
A periodontite, inicializada principalmente pela placa dentária1, caracteriza-se pelo dano dos tecidos periodontais, incluindo o ligamento periodontal (PDL), o osso alveolar e o cementum. Os tratamentos atuais para o periodontite são geralmente bem sucedidos em impedir o progresso da doença ativa, mas a regeneração de tecidos peridentais perdidos permanece um desafio clínico. Recentemente, avanços importantes foram feitos em abordagens baseadas em células para a regeneração tecidual periodontal para superar as desvantagens dos tratamentos atuais2,3,4.
Nossa revisão sistemática prévia revelou que as pilhas de PDL mostraram o grande potencial para a regeneração peridental5. Convencionalmente, as células PDL são cultivadas em substratos bidimensionais (2D), como poliestireno de cultura tecidual (TCPS). No entanto, alterações características das células PDL foram observadas durante a cultura in vitro6. Este fenômeno é provavelmente porque o 2D TCPS difere do in vivo tridimensional (3D) microambiente7. Comparado às células cultivadas em substratos 2D, as células cultivadas em um microambiente 3D exibem mais semelhanças com as células in vivo8. Portanto, os modelos de cultura de células 3D fornecem uma alternativa promissora para a cultura de células monocamada 2D convencional.
O método convencional da cultura 3D está encapsulando pilhas em biomateriais 3D. Comparado com as células encapsuladas em biomateriais 3D, os esferoides celulares imitam a situação in vivo mais de perto porque os esferóides são agregados de células que crescem livres de materiais estranhos9,10,11, 12. é relatado que os esferóides celulares promoveram BIOATIVIDADES do MSC através da preservação dos componentes da matriz extracelular (ECM), incluindo fibronectina e laminina13. Para melhorar os modelos convencionais da cultura de pilha de PDL, nós desenvolvemos recentemente um método da cultura de pilha de 3D PDL, que seja baseado na formação esferóide de pilhas de PDL em películas14do quitosana. A formação de esferóides aumentou a autorenovação e a capacidade de diferenciação osteogênica das células de PDL14. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha de PDL baseados em películas do quitosana. O sistema da cultura 3D de esferoides celulares de PDL supera algumas das deficiências relativas à cultura de pilha convencional de TCPs, e pode assim ser apropriada para produzir pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.
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Protocol
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da escola e hospital de Estomatologia da Universidade de Tongji. Todos os pacientes forneceram o consentimento informado escrito.
1. isolação da pilha de PDL
- Faça meio de proliferação para cultura de células PDL: meio α-MEM suplementado com 10% FCS e 100 U/mL Pen/Strep.
- Prepare um recipiente com gelo para transferir terceiros molares isolados.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos usando uma autoclave.
- Extraia os terceiros molares afetados humanos normais dos adultos (18-28 anos de idade) na clínica dental da escola e do hospital da estomatologia, Universidade de Tongji.
- Coloque os terceiros molares no meio de proliferação e transfira para o laboratório a 4 ° c.
- Coloc o dente extraído em um prato de Petri estéril de 100 milímetros, trabalhando dentro de uma capa laminar do fluxo do Biohazard.
- Adicionar 10 mL de PBS para lavar o dente extraído. Repita o passo de lavagem duas vezes.
- Usando um bisturi estéril, separe suavemente o PDL da raiz.
Nota: o PDL deve ser raspado da terceira parte média da raiz para evitar contaminações dos tecidos gengivais ou apicais. - Mince PDL em fragmentos de 1-2 mm com a ajuda de uma lâmina de bisturi esterilizada.
- Coloque fragmentos de PDL em um balão de cultura T-25, preenchido com 3-4 mL de meio de proliferação.
- Cultura as amostras em uma incubadora em 37 ° c em 5% CO2 com ar humidificado.
- A mudança do meio de cultura após o crescimento das células PDL foi observada. Toma geralmente 1-2 semanas para o conseqüência de pilhas de PDL. Observe o crescimento das células PDL através de um microscópio de contraste de fase inversa.
- Mude o meio de cultura duas vezes por semana depois disso.
- Quando as células PDL atingiram confluência, as células de subcultura na proporção de 1:4 (passagem 1).
- Observe o crescimento celular diariamente e mude o meio de cultura duas vezes por semana.
- Execute cada passagem subseqüente na relação de 1:4 depois que as pilhas alcançam a confluência de 80%. Use a terceira-a quinta geração de células PDL para a propagação de células.
2. preparação de filmes de quitosana
- Para a preparação de uma solução de ácido acético a 1% (v/v), adicione 5 mL de ácido acético a 495 mL de água destilada dupla em uma taça de vidro limpo.
- Para a preparação de 1% w/v solução de quitosana, pesar 5 g de pó de quitosana (peso molecular médio 400 kDa, 85% grau de acetilação) e adicionar a 495 mL de 1% (v/v) solução de ácido acético.
- Mexa a solução preparada durante 24 horas com a barra de agitação e a placa de agitação magnética a 60 ° c.
- Autoclave a solução preparada para garantir a dissolução completa da quitosana.
Observação: o experimento pode ser pausado neste estágio. - Para formar filmes de quitosana, adicione 1% de solução de quitosana de p/v em pratos de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS) a 0,25 mL/cm2. Por exemplo, adicionar 0,5 mL de 1% w/v solução de quitosana para um poço de 24-placa bem.
- Seque pratos TCPS em um forno a 60 ° c por 24 horas para formar filmes de quitosana.
- Preparar 0,5 hidróxido de sódio N (NaOH). Mexa 10 g de NaOH, um pouco de cada vez, em um grande volume de água destilada dupla usando a barra de agitação magnética e, em seguida, diluir a solução para fazer 0,5 L.
Nota: Adicione NaOH à água--não adicione a água ao NaOH contínuo. Não toque NaOH! Pode causar queimaduras químicas. - Neutralize filmes de quitosana com 0,5 N NaOH. Adicionar 0,5 mL de 0,5 N NaOH solução para um poço de 24-bem placa por 2 horas.
- Lave os filmes de quitosana três vezes com água destilada dupla.
Observação: o experimento pode ser pausado neste estágio. - Antes da semeadura de células, esterilizar as placas de 24 poços revestidas com quitosana em 70% de álcool durante a noite à temperatura ambiente.
- Enxague as placas revestidas com quitosana três vezes com PBS à temperatura ambiente.
- Esterilizar placas revestidas com quitosana por tratamento luz ultravioleta durante a noite à temperatura ambiente.
3. semeadura celular
- Solução de PBS de média de proliferação pré-quente e solução de Trypsin/EDTA para 37 ° c.
- Descarte o sobrenadante do balão de cultura celular T-75.
- Lave as células PDL confluentes com 10 mL de solução de PBS.
- Descarte a solução PBS.
- Adicione 1 mL de solução de Trypsin/EDTA ao balão de cultura de células T-75.
- Incubar células com solução de tripsina/EDTA por 3 min a 37 ° c.
- Encerre o processo de digestão da tripsina adicionando 3 mL de meio de proliferação ao balão de cultura de células T-75.
- Transfira a suspensão da célula preparada para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
- Centrifugue a suspensão durante 5 min a 300 x g e a temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante do tubo de centrífuga cônico de 15 mL e resuspenda o pellet celular em 500 μL de meio de proliferação.
- Contagem de células PDL com um Hemocytometer.
- Células de semente PDL nas densidades de 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104e 6 x 104 células/cm2.
- Células de cultura PDL em filmes de quitosana em uma incubadora a 37 ° c em 5% CO2 com ar humidificado.
- Mude o meio de cultura duas vezes por semana depois disso.
- Nos dias 1, 2, 3, 4 e 5, observar a morfologia celular diariamente através de um microscópio de contraste de fase inversa.
4. sobrevivência celular
- Após 1, 3 e 6 dias de cultura, determinar a sobrevida das células usando um kit de viabilidade/citotoxicidade comercial.
- Em um tubo de 15 ml, prepare 2 ml de uma solução fresca de 2 milímetros calcein-am e homodímero do etídio de 4 milímetros no PBS por vortexing por 5 s.
Nota: Mantenha o processo no escuro. - Retire o meio de cultura e lave os esferóides em PBS.
- Incubar esferóides em PBS contendo 2 mm de calceina-am e 4 mm de etídio homodímero por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Enxágüe esferoides duas vezes em PBS. Para esferoides de um poço da placa 24-well, use 2 ml de PBS para cada vez.
- Observe as amostras usando um microscópio de fluorescência usando ampliação de 10x ou 20x.
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Representative Results
Usando o protocolo atual, os esferoides viáveis da pilha de PDL foram dados forma com sucesso. A Figura 1 mostrou que células suspensas ou esferóides em vez de células anexadas foram observadas principalmente em filmes de quitosana. Para a densidade de semeadura de 0,5 x 104 Cells/cm2, as pilhas PDL anexadas foram encontradas ocasionalmente no dia 1 e 3, e os esferoides da pilha de PDL foram observados raramente. Pelo contrário, para as densidades de semeadura de 3 x 104 e 6 x 104 Cells/cm2, os vários tamanhos de esferoides da pilha de PDL foram encontrados desde o dia 1. A formação do esferóide da pilha de PDL foi observada de todas as densidades de semeadura após 3 dias. Como mostrado na Figura 1,3 x 104 Cells/cm2 foi a densidade de semeadura da célula PDL ideal porque o tamanho dos esferóides da célula PDL foi homogêneo nesta densidade de semeadura da célula. Após 5 dias da cultura, os esferoides maiores foram dados forma para todas as densidades de semeadura da pilha. As pilhas suspendidas de PDL foram encontradas raramente no dia 5.
A viabilidade das células PDL em esferóides foi avaliada após 1, 3 e 6 dias. Como mostrado na Figura 2, a maioria das células em esferóides eram células vivas no dia 1, 3 e 6. Enquanto no dia 6, o número de células mortas foi aumentado na parte central.
Figura 1. A morfologia de spheroids celulares PDL.
Para a densidade de semeadura de 0,5 x 104 Cells/cm2, os esferoides da pilha de PDL foram observados raramente nos dias 1 e 3. Para as densidades de semeadura de 3 x 104 e 6 x 104 Cells/cm2, vários tamanhos de esferoides da pilha de PDL foram encontrados desde o dia 1. A formação do esferóide da pilha de PDL foi observada de todas as densidades de semeadura após 3 dias. Após 5 dias da cultura, os esferoides maiores foram dados forma para todas as densidades de semeadura da pilha. As pilhas suspendidas de PDL foram encontradas raramente no dia 5. Barra de escala: 200 μm. Este número foi modificado de Yan et al.14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A viabilidade de esferoides celulares PDL em filmes de quitosana.
A viabilidade das células PDL em esferóides foi avaliada após 1, 3 e 6 dias. Como mostrado aqui, a maioria das células em esferóides eram células vivas no dia 1, 3 e 6. Enquanto no dia 6, o número de células mortas foi aumentado na parte central. Barras de escala: 200 μm. Este número foi modificado de Yan et al.14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente estudo introduziu um sistema de cultura de células 3D para superar algumas limitações relacionadas à cultura de células monocamada 2D convencional. De acordo com o protocolo, os esferoides celulares de PDL foram formados com sucesso cultivando pilhas em películas do quitosana. Nosso estudo prévio relatou que a formação de esferóides aumentou a autorenovação e as capacidades de diferenciação osteogênica das células PDL14. Em vez de usar uma enzima para colher células de TCPs, esferoides de células PDL poderiam ser colhidas a partir de filmes de quitosana simplesmente pipetando o meio algumas vezes14. Assim, a ECM e as junções intercelulares podem ser bem preservadas.
As etapas críticas deste protocolo incluem: (1) certificando-se de que os instrumentos cirúrgicos e os filmes de quitosana são esterilizados para cultura celular; (2) raspando o PDL da terceira parte média da raiz para evitar contaminações dos tecidos gengivais ou apicais; e (3) exigindo densidades mais elevadas da semeadura da pilha (≥ 3 x 104 Cells/cm2) para a formação bem sucedida do esferóide de pilhas de PDL.
Entretanto, uma limitação para este método é que a proliferação diminuída de pilhas de PDL estêve observada após a formação esferóide14, que é similar a alguns estudos precedentes que executaram em pilhas stromal adiposa10 e carcinoma hepatocelular linha celular15. Isso provavelmente é causado pela diferença na regulação dos inibidores da quinase dependente da cicinóide entre as células esferóides e monocamada16. Para beneficiar a aplicação clínica, são necessários estudos adicionais para promover a proliferação de esferóides celulares.
Outra desvantagem do esferóide celular é a difusão inadequada no núcleo. Embora as pilhas de PDL estivessem principalmente vivas na cultura esferóide, o número de pilhas inoperantes estêve aumentado na parte central dos esferoides no dia 6. Este fenômeno era provavelmente porque a difusão do oxigênio e dos nutrientes é comprometida no núcleo esferóide porque os esferoides da pilha de PDL tornam-se maiores17,18.
Outros métodos que relataram induzir esferóides celulares incluem uma superfície não aderente19, micropoços20, frascos Spinner21, superfícies micromodeladas22,23, gotas suspensas24, e um técnica de agregação forçada25. Comparado aos métodos acima mencionados, os filmes de quitosana são relativamente rentáveis e fáceis de reproduzir. Outra vantagem deste método são as propriedades antimicrobianas da quitosana26, o que é significativamente benéfico para a cultura de células in vitro.
Em resumo, aqui nós apresentamos os protocolos detalhados da cultura do esferóide da pilha 3D baseados em películas do quitosana. A cultura de esferoides celulares de PDL supera algumas das limitações relativas à cultura de pilha convencional de 2D TCPs, e pode assim ser apropriada para produzir pilhas de PDL com uma eficácia terapêutica realçada para a regeneração peridental futura do tecido.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi patrocinado pela National natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), fundos de pesquisa fundamental para as universidades centrais (1504219050), Fundação de ciência natural de Xangai (17ZR1432800), e Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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