Summary
Ici, nous présentons des protocoles de culture des sphéroïdes cellulaires du ligament parodontal humain (PDL) par des films chitosan. La culture des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) offre une alternative au système de culture de polystyrène de culture de tissu conventionnel (TCPS).
Abstract
Les cellules parodontales de ligament (PDL) tiennent la grande promesse pour la régénération parodontale de tissu. Traditionnellement, les cellules PDL sont cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D) tels que le polystyrène de culture tissulaire (TCPS). Cependant, des changements caractéristiques des cellules de PDL ont été observés pendant la culture in vitro. Ce phénomène est probablement dû au fait que le TCPS 2D diffère du microenvironnement tridimensionnel in vivo (3D). Comparées aux cellules cultivées sur des substrats 2D, les cellules cultivées dans un microenvironnement 3D présentent plus de similitudes aux cellules in vivo. Par conséquent, les modèles de culture de cellules 3D fournissent une alternative prometteuse pour la culture cellulaire 2D conventionnelle de monocouche. Pour améliorer les modèles conventionnels de culture cellulaire PDL, nous avons récemment développé une méthode de culture cellulaire 3D, qui est basée sur la formation sphéroïde de cellules PDL sur les films chitosan. Ici, nous présentons les protocoles détaillés de culture sphéroïde de cellules basés sur des films de chitosan. Le système de culture 3D des sphéroïdes cellulaires de PDL surmontent quelques-unes des limitations liées à la culture cellulaire conventionnelle de monocouche 2D, et peut ainsi être approprié pour produire des cellules de PDL avec une efficacité thérapeutique augmentée pour la régénération parodontale future de tissu.
Introduction
La parodontite, paraphée principalement par la plaque dentaire1, est caractérisée par les dommages des tissus parodontaux comprenant le ligament parodontal (PDL), l'os alvéolaire, et le ciment. Les traitements actuels pour la parodontite sont habituellement réussis à empêcher le progrès de la maladie active, mais la régénération des tissus parodontaux perdus demeure un défi clinique. Récemment, des progrès importants ont été réalisés dans les approches cellulaires pour la régénération des tissus parodontaux pour surmonter les inconvénients des traitements actuels2,3,4.
Notre examen systématique précédent a indiqué que les cellules dePDL ont montré le grand potentiel pour la régénération parodontale 5. Traditionnellement, les cellules PDL sont cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D) tels que le polystyrène de culture tissulaire (TCPS). Cependant, des changements caractéristiques des cellules dePDL ont été observés pendant la culture in vitro 6. Ce phénomène est probablement dû au fait que le TCPS 2D diffère du microenvironnement tridimensionnel in vivo (3D)7. Comparé aux cellules cultivées sur des substrats 2D, les cellules cultivéesdans un microenvironnement 3D présentent plus de similitudes aux cellules in vivo 8. Par conséquent, les modèles de culture de cellules 3D fournissent une alternative prometteuse pour la culture cellulaire 2D conventionnelle de monocouche.
La méthode conventionnelle de culture 3D consiste à encapsuler les cellules dans des biomatériaux 3D. Comparé aux cellules encapsulées dans les biomatériaux 3D, les sphéroïdes cellulaires imitent la situation in vivo plus étroitement parce que les sphéroïdes sont des agrégats des cellules se développant exemptes des matériaux étrangers9,10,11, 12.Il est rapporté que les sphéroïdes cellulaires ont favorisé des bioactivités de MSC par la conservation des composants extracellulaires de matrice (ECM) comprenant la fibronectine et la laminin1. Pour améliorer les modèles conventionnels de culture cellulaire De PDL, nous avons récemment développé une méthode de culture de cellules 3D PDL, qui est basée sur la formation sphéroïde des cellules de PDL sur des films de chitosan14. La formation de Sphéroïdes a augmenté les capacités d'auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique des cellules de PDL14. Ici, nous présentons les protocoles détaillés de culture sphéroïde de cellules de PDL basés sur des films de chitosan. Le système de culture 3D des sphéroïdes cellulaires de PDL surmontent quelques-unes des lacunes liées à la culture conventionnelle de cellules de TCPS, et ainsi peut être approprié pour produire des cellules de PDL avec une efficacité thérapeutique augmentée pour la régénération parodontale future de tissu.
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Protocol
Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de l'école et de l'hôpital de stomatologie de l'Université Tongji. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit.
1. Isolement cellulaire PDL
- Faire le milieu de prolifération pour la culture des cellules de PDL : moyen de '-MEM complété avec 10% FCS et 100 stylo/streptocoque d'U/mL.
- Préparer un récipient avec de la glace pour transférer les troisièmes molaires isolées.
- Stériliser les instruments chirurgicaux à l'aide d'un autoclave.
- Extraire les troisièmes molaires humaines normales d'adultes (18-28 ans) à la clinique dentaire de l'école et de l'hôpital de stomatologie, Université tongji.
- Placer les troisièmes molaires dans le milieu de prolifération et les transférer en laboratoire à 4 oC.
- Placer la dent extraite dans un plat stérile de 100 mm de Petri, en travaillant dans une hotte à flux laminaire à risque biologique.
- Ajouter 10 ml de PBS pour laver la dent extraite. Répétez l'étape de lavage deux fois.
- En utilisant un scalpel stérile, séparer délicatement le PDL de la racine.
REMARQUE : Le PDL doit être gratté à partir de la troisième partie moyenne de la racine pour éviter les contaminations par les tissus gingivals ou aphiles. - Émincer la PDL en fragments de 1-2 mm à l'aide d'une lame de scalpel stérilisée.
- Placer les fragments de PDL dans un flacon de culture T-25, rempli de 3-4 mL de milieu de prolifération.
- Culture des échantillons dans un incubateur à 37 oC dans 5 % de CO2 avec de l'air humidifié.
- Changer le milieu de culture après que la croissance des cellules de PDL ait été observée. Il faut habituellement 1-2 semaines pour la excroissance des cellules PDL. Observez la excroissance des cellules PDL via un microscope de contraste de phase inverse.
- Changer le milieu de culture deux fois par semaine par la suite.
- Lorsque les cellules PDL ont atteint la confluence, les cellules de sous-culture à un rapport de 1:4 (passage 1).
- Observez la croissance cellulaire tous les jours et modifiez le milieu de culture deux fois par semaine.
- Effectuer chaque passage suivant à un rapport de 1:4 après que les cellules atteignent 80% de confluence. Utilisez la troisième à la cinquième génération de cellules PDL pour l'ensemencement cellulaire.
2. Préparation de films chitosan
- Pour la préparation d'une solution d'acide acétique de 1 % (v/v), ajouter 5 ml d'acide acétique à 495 ml d'eau double distillée dans un bécher en verre propre.
- Pour la préparation de 1% w/v solution chitosan, peser 5 g de poudre de chitosan (poids moléculaire moyen 400 kDa, 85% degré d'acétylation) et ajouter à 495 mL de 1% (v/v) solution d'acide acétique.
- Remuer la solution préparée pendant 24 heures avec la barre en remuant et la plaque de remuement magnétique à 60 oC.
- Autoclave la solution préparée pour assurer la dissolution complète du chitosan.
REMARQUE : L'expérience peut être interrompue à ce stade. - Pour former des films de chitosan, ajoutez 1% de solution de chitosan w/v dans les plats de polystyrène de culture tissulaire (TCPS) à 0.25 mL/cm2. Par exemple, ajoutez 0,5 mL de 1% de solution de chitosan w/v à un puits de 24 assiettes de puits.
- Sécher les plats TCPS dans un four à 60 oC pendant 24 heures pour former des films de chitosan.
- Préparer l'hydroxyde de sodium de 0,5 N (NaOH). Remuer 10 g de NaOH, un peu à la fois, dans un grand volume d'eau double distillée à l'aide de la barre magnétique, puis diluer la solution pour faire 0,5 L.
REMARQUE : Ajoutez NaOH à l'eau - n'ajoutez pas d'eau à NaOH solide. Ne touchez pas à NaOH ! Il pourrait causer des brûlures chimiques. - Neutraliser les films chitosan avec 0.5 NaOH. Ajouter 0,5 mL de solution NaOH de 0,5 N à un puits de 24 puits pendant 2 heures.
- Laver les films de chitosan trois fois avec de l'eau double distillée.
REMARQUE : L'expérience peut être interrompue à ce stade. - Avant l'ensemencement cellulaire, stériliser les plaques de 24 puits recouvertes de chitosan dans 70 % d'alcool pendant la nuit à température ambiante.
- Rincer les assiettes recouvertes de chitosan trois fois avec PBS à température ambiante.
- Stériliser les plaques enduites de chitosan par traitement sous la lumière ultraviolette pendant la nuit à température ambiante.
3. Ensemencement cellulaire
- Solution PBS de prolifération pré-chaude et solution trypsine/EDTA à 37 oC.
- Jeter le supernatant du flacon de culture cellulaire T-75.
- Laver les cellules PDL confluentes avec 10 mL de solution PBS.
- Jetez la solution PBS.
- Ajouter 1 mL de solution trypsine/EDTA au flacon de culture cellulaire T-75.
- Incuber les cellules avec la solution trypsine/EDTA pendant 3 min à 37 oC.
- Terminer le processus de digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de prolifération à T-75 flacon de culture cellulaire.
- Transférer la suspension cellulaire préparée dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml.
- Centrifugelant la suspension pendant 5 min à 300 x g et température ambiante.
- Jetez le supernatant du tube conique de 15 ml de centrifugeuse et suspendez de nouveau le granule de cellule dans 500 L de milieu de prolifération.
- Comptez les cellules PDL avec un hémocytomètre.
- Cellules de PDL de graine aux densités de 0.5 x 104, 1 x 104, 3 x 104, et 6 x 104 cellules/cm2.
- Culture PDL cellules sur les films de chitosan dans un incubateur à 37 oC dans 5% CO2 avec de l'air humidifié.
- Changer le milieu de culture deux fois par semaine par la suite.
- Les jours 1, 2, 3, 4 et 5, observez la morphologie cellulaire quotidiennement par l'intermédiaire d'un microscope de contraste de phase inverse.
4. Survie cellulaire
- Après 1, 3 et 6 jours de culture, déterminer la survie des cellules à l'aide d'un kit de viabilité commerciale/cytotoxicité.
- Dans un tube de 15 ml, préparer 2 ml d'une solution fraîche de 2 mM de calcéine-AM et 4 mM d'homodimère d'éhidium en PBS en vortexant pendant 5 s.
REMARQUE : Maintenez le processus dans l'obscurité. - Retirez le milieu de culture et lavez les sphéroïdes dans le PBS.
- Incuber les sphéroïdes dans de PBS contenant 2 mM calcein-AM et 4 mM d'homodimère d'éthidium pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Rincer les sphéroïdes deux fois dans PBS. Pour les sphéroïdes d'un puits de 24 puits, utiliser 2 mL de PBS pour chaque fois.
- Observez les échantillons à l'aide d'un microscope à fluorescence à l'aide d'un grossissement de 10x ou de 20x.
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Representative Results
Utilisant le protocole actuel, les sphéroïdes viables de cellules de PDL ont été avec succès formés. La figure 1 a montré que les cellules suspendues ou les sphéroïdes au lieu des cellules attachées étaient principalement observées sur des films de chitosan. Pour la densité d'ensemencement de 0,5 x 104 cellules/cm2, des cellules PDL attachées ont été occasionnellement trouvées le jour 1 et 3, et des sphéroïdes de cellules de PDL ont été rarement observés. Au contraire, pour les densités d'ensemencement de 3 x 104 et 6 x 104 cellules/cm2, différentes tailles de sphéroïdes de cellules PDL ont été trouvées depuis le jour 1. La formation de sphéroïdes de cellules de PDL a été observée de toutes les densités d'ensemencement après 3 jours. Comme indiqué dans la figure 1, 3 x 104 cellules/cm2 était la densité optimale d'ensemencement de cellules de PDL parce que la taille des sphéroïdes de cellules de PDL était homogène à cette densité d'ensemencement de cellules. Après 5 jours de culture, de plus grands sphéroïdes ont été formés pour toutes les densités d'ensemencement de cellules. Des cellules suspendues de PDL ont été rarement trouvées le jour 5.
La viabilité des cellules de PDL dans les sphéroïdes a été évaluée après 1, 3 et 6 jours. Comme le montre la figure 2, la majorité des cellules des sphéroïdes étaient des cellules vivantes le jour 1, 3 et 6. Alors que le jour 6, le nombre de cellules mortes a été augmenté dans la partie centrale.
Figure 1. La morphologie des sphéroïdes cellulaires PDL.
Pour la densité d'ensemencement de 0,5 x 104 cellules/cm2, les sphéroïdes cellulaires PDL ont rarement été observés le jour 1 et 3. Pour les densités d'ensemencement de 3 x 104 et 6 x 104 cellules/cm2, diverses tailles de sphéroïdes de cellules PDL ont été trouvées depuis le jour 1. La formation de sphéroïdes de cellules de PDL a été observée de toutes les densités d'ensemencement après 3 jours. Après 5 jours de culture, de plus grands sphéroïdes ont été formés pour toutes les densités d'ensemencement de cellules. Des cellules suspendues de PDL ont été rarement trouvées le jour 5. Barre d'échelle : 200 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Yan et coll.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. La viabilité des sphéroïdes cellulaires De PDL sur des films de chitosan.
La viabilité des cellules de PDL dans les sphéroïdes a été évaluée après 1, 3 et 6 jours. Comme indiqué ici, la majorité des cellules dans les sphéroïdes étaient des cellules vivantes le jour 1, 3, et 6. Alors que le jour 6, le nombre de cellules mortes a été augmenté dans la partie centrale. Barres à l'échelle : 200 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Yan et coll.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La présente étude a introduit un système de culture de cellules 3D pour surmonter certaines limitations liées à la culture cellulaire monocouche 2D conventionnelle. Selon le protocole, les sphéroïdes cellulaires de PDL ont été avec succès formés par des cellules de culture sur des films de chitosan. Notre étude précédente a rapporté que la formation de sphéroïdes a augmenté les capacités d'auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique des cellules de PDL14. Au lieu d'utiliser une enzyme pour récolter les cellules de TCPS, les sphéroïdes de cellules de PDL pourraient être moissonnés des films de chitosan en pipetting simplement le milieu quelques fois14. Ainsi, les jonctions ECM et intercellulaires peuvent être bien préservées.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent : (1) s'assurer que les instruments chirurgicaux et les films de chitosan sont stérilisés pour la culture cellulaire ; (2) raclant le PDL de la troisième partie moyenne de la racine pour éviter les contaminations des tissus gingivals ou aphiles; et (3) nécessitant des densités d'ensemencement cellulaires plus élevées (3 x 104 cellules/cm2) pour la formation réussie de cellules Sphéroïdes.
Cependant, une limitation pour cette méthode est que la prolifération diminuée des cellules de PDL a été observée après la formation de sphéroïde14,qui est semblable à quelques études précédentes qui ont exécuté sur les cellules stromales adipeuses10 et le carcinome hépatocellulaire ligne cellulaire15. Ceci est probablement causé par la différence dans la régulation des inhibiteurs de kinase cyclin-dépendants entre les cellules sphéroïdes et monocouches16. Pour bénéficier de l'application clinique, d'autres études pour favoriser la prolifération des sphéroïdes cellulaires sont nécessaires.
Un autre inconvénient du sphéroïde cellulaire est la diffusion inadéquate dans le noyau. Bien que les cellules de PDL aient été principalement vivantes dans la culture sphéroïde, le nombre de cellules mortes a été augmenté dans la partie centrale des sphéroïdes le jour 6. Ce phénomène était probablement parce que la diffusion de l'oxygène et des éléments nutritifs est compromise dans le noyau sphéroïde pendant que les sphéroïdes de cellules de PDL deviennent plus grands17,18.
D'autres méthodes qui ont rapporté induire des sphéroïdes cellulaires incluent une surface non-adhérente19, micropuitss20, flacons de filature21, surfaces micromodelées22,23, gouttes suspendues24, et un technique d'agrégation forcée25. Par rapport aux méthodes susmentionnées, les films chitosan sont relativement rentables et faciles à reproduire. Un autre avantage de cette méthode est les propriétés antimicrobiennes de chitosan26, qui est significativement bénéfique pour la culture cellulaire in vitro.
En résumé, nous présentons ici des protocoles détaillés de culture sphéroïde de cellules 3D basés sur des films de chitosan. La culture des sphéroïdes cellulaires de PDL surmontent quelques-unes des limitations liées à la culture conventionnelle de cellules de TCPS 2D, et peut donc être appropriée pour produire des cellules de PDL avec une efficacité thérapeutique augmentée pour la régénération parodontale future de tissu.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été parrainée par la National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (1504219050), la Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800) et le Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
