Summary
Her beskrives en antistoff-fri in vitro-analyse for direkte analyser av methyltransferase aktivitet på syntetiske eller in vitro-er.
Abstract
Det er mer enn 100 kjemisk distinkte modifikasjoner av RNA, hvorav to tredjedeler består av methylations. Interessen for RNA modifikasjoner, og spesielt methylations, har re-dukket opp på grunn av de viktige rollene som spilles av enzymer som skriver og sletter dem i biologiske prosesser som er relevante for sykdom og kreft. Her, en følsom in vitro-analyse for nøyaktig analyse av RNA metylering forfatter aktivitet på syntetiske eller in vitro-RNAs er gitt. Denne analysen bruker en tritiated form av S-adenosyl-metionin, noe som resulterer i direkte merking av denaturert RNA med tritium. Den lave energien av tritium stråling gjør metoden trygg, og eksisterende metoder for tritium signal forsterkning, gjør det mulig å kvantifisere og visualisere denaturert RNA uten bruk av antistoffer, som vanligvis er utsatt for artefakter. Selv om denne metoden er skrevet for RNA-metylering, gjør noen tilpasninger det gjeldende for studiet av andre RNA-modifikasjoner som kan radioaktivt merket, for eksempel RNA-acetylering med 14C acetyl koenzym A. Overall, gjør denne analysen for å raskt vurdere RNA metylering forhold, hemming med små molekyl hemmere, eller effekten av RNA eller enzym mutanter, og gir et kraftig verktøy for å validere og utvide resultatene som oppnås i celler.
Introduction
DNA, RNA og proteiner er gjenstand for modifikasjoner som strengt regulerer genuttrykk1. Blant disse modifikasjoner, methylations forekomme på alle tre biopolymerer. DNA og protein methylations har vært svært godt studert i løpet av de siste tre ti årene. Interessen for RNA-metylering har derimot nylig vært reignited i lys av de viktige rollene som proteiner som skriver, sletter eller binder RNA-methylations spill i utvikling og sykdom2. I tillegg til bedre kjente funksjoner i rikelig ribosomal og overføring RNAs, RNA metylering trasé regulere spesifikke Messenger RNA stabilitet3,4, skjøting5 og oversettelse6,7, miRNA prosessering8,9 og transcriptional pause og slipp10,11.
Her rapporteres en enkel og robust metode for in vitro-verifisering av RNA methyltransferase aktivitet i innstillingen av et molekylærbiologi laboratorium (oppsummert i figur 1). Mange studier vurderer aktiviteten til en RNA-methyltransferase gjennom dot-blot med et antistoff mot RNA-endringen av interesse. Men dot-blot kontrollerer ikke integriteten til RNA-en ved inkubasjons med RNA-methyltransferase. Dette er viktig fordi selv mindre forurensninger av rekombinant proteiner med nukleaser kan føre til delvis RNA degradering og forvirrende resultater. Videre kan selv svært spesifikke RNA modifisering antistoffer gjenkjenne uendret RNAs med spesifikke sekvenser eller strukturer. In vitro RNA methyltransferase-analysen som rapporteres her, utnytter det faktum at S-adenosyl-metionin kan tritiated på metyl-gruppen (figur 1), noe som åpner for at denaturert RNA blir nøyaktig oppdaget uten bruk av antistoffer . Instruksjoner er gitt for in vitro transkripsjon og rensing av en transkripsjon av interesse og testing av metylering av sa transkripsjon av enzymet av interesse. Denne metoden er fleksibel og robust, og kan justeres i henhold til behovene til et gitt prosjekt. For eksempel, in vitro transkribere og renset RNAs, kjemisk syntetisert RNAs, men også cellulære RNAs kan brukes. Denne analysen gir kvantitativ informasjon i form av scintillation teller, samt kvalitativ informasjon ved å vise hvor nøyaktig denaturert RNA kjører på en gel. Dette kan gi unik innsikt i funksjonen til en RNA-methyltransferase, spesielt ved bruk av mobil RNAs som et substrat, da det gir en metode for direkte å observere størrelsen på RNA-eller RNAs-en som er målrettet for metylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in vitro transkripsjon og gel rensing av målet RNA
- Klon sekvensen av interesse i plasmider inneholder T7 og/eller SP6 arrangører bruker etablerte molekylær kloning teknikker12 eller kits.
- Linearizing DNA mal for in vitro transkripsjon
- Forsterke sekvensen av interesse av PCR av plasmider med primere utformet for å inkludere T7 promoter regionen gjennom innsatsen, + 20-30 BP oppstrøms og nedstrøms som tidligere beskrevet13.
- Alternativt, fordøye 5 μg av plasmider ved hjelp av et Begrensnings enzym (RE) kutt området tilgjengelig nedstrøms innsatsen i henhold til instruksjonene gitt av leverandøren av RE.
Merk: Husk å dobbeltsjekke at innsatsen ikke er kuttet av den valgte RE. Valg av RE brukes i dette trinnet kan dramatisk påvirke utbyttet av transkripsjon. Fortrinnsvis, linearize med en stump eller 5 '-overhengende ende som produserer RE for å unngå mal veksling av T7 RNA-polymerase på motsatt DNA strand14. Prøv forskjellige RE hvis første avkastning er utilstrekkelig.
- Rens den resulterende DNA ved hjelp av Kit for DNA agarose gel utvinning og opprydding. Eluere DNA med 30 μL vann.
- Bland godt med virvlingen, Pipet 1,5 μL og måle DNA-konsentrasjon med en microvolume spektrofotometer.
- Bruk 250 ng av DNA for å sjekke kvaliteten og størrelsen på renset DNA på en 1% agarose gel elektroforese i 1x TBE buffer migrert for 1 t ved 4 V/cm.
- Tin de frosne reagensene i den in vitro transkripsjon Kit. Plasser T7 RNA polymerase Mix på is, og de andre reagensene på en nutator ved romtemperatur. Umiddelbart etter fullstendig tine, rask spinne rNTP rør for 5 s for å samle løsning på bunnen av rørene og plass på isen. Hold 10x reaksjons buffer ved romtemperatur for å unngå nedbør.
- Pipet inn i en 1,5 mL tube følgende komponenter av den 20 μL transkripsjon reaksjonen ved romtemperatur i den indikerte rekkefølgen: 6 μL vann, 2 μL (0,1-1 μg) av lineær DNA mal, 2 μL av 75 mM ATP løsning, 2 μL av 75 mM GTP løsning , 2 μL av 75 mM CTP-løsning, 2 μL av 75 mM UTP-oppløsning, 2 μL av 10x reaksjons buffer og 2 μL av T7 RNA polymerase mix.
Merk: for DNA-mal generert av PCR, bruk 100-200 ng DNA; for DNA mal generert av restriksjon enzym Sammendrag av en plasmider, bruk ~ 1 μg. aktiv rekombinant hans6-Tagged T7 RNA polymerase kan bli renset i E. coli15. - Bland røret grundig. Quick spin for 5 s for å samle reaksjons løsning på bunnen av røret, deretter ruge ved 37 ° c for 2-4 h.
Merk: hver transkripsjon vil oppføre seg forskjellig avhengig av DNA malen, dens lengde, dens sekvens eller struktur. Optimaliser-transkripsjon forhold ved å teste ulike inkubasjons ganger opp til 6 h; ulike konsentrasjoner av DNA-mal, T7 RNA polymerase, eller NTP; eller tillegg av supplerende MgCl2 til hva som er til stede i T7 RNA polymerase mix. - På slutten av inkubasjonsperioden, tilsett 1 μL av DNase I per 20 μL reaksjon og ruge ved 37 ° c i 15 min.
Merk: den transkripsjon reaksjonen kan midlertidig holdes på isen til polyakrylamid gel er klar. - Fortsett med rensing av polyakrylamid gel.
Merk: siden RNA er følsom for pH-og RNase-forurensning, bruk RNA-utstyr og RNase-reagenser. - Bestem prosentandelen av polyakrylamid for gel avhengig av størrelsen på transkripsjon av interesse: 3,5% for 100-2000 NT (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 5% for 80-500 NT (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 8% for 60-400 NT (XC: 160 NT; BB: 45 NT), 12% for 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT), 15% for 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT), og 20% for 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
- Klargjør urea denaturering polyakrylamid gel ved å kombinere følgende reagenser i et 50 mL konisk rør: 9,6 g molekyl grad urea, 2 mL 10x TBE, x mL 40% akrylamid: BIS-akrylamid mix (29:1) og vann opp til 20 mL merket på røret , der x = 20 mL/(40%/gel prosent%).
FORSIKTIG: polyakrylamid gels inneholder ofte un-polymerisert akrylamid som er et giftig materiale som kan gi en fare når det innføres i miljøet. Kast polyakrylamid gels gjennom institusjonens kjemiske avfalls program. - Mikrobølgeovn for 15 s på 30% strøm. Plasser på nutator i 10 minutter ved romtemperatur eller til urea har helt oppløst.
- Mens gel-blandingen roterer, Hent en gel-kassett (18-brønn, 1 mm tykk; 13,3 x 8,7 cm (b x L)), Fjern kammen og plasser kassetten for gel-støping.
- Quick spin 50 mL rør for 5 s for å samle gel løsning på bunnen av røret. Tilsett 125 μL av 10% ammonium natriumpersulfat oppløsning (APS). Plasser på nutator for ~ 1 min. Quick spin igjen for 5 s.
- Tilsett 25 μL av tetrametyletylendiamin (TEMED) og bland forsiktig ved pipettering opp og ned 5 ganger med en 25 mL pipette unngå bobler.
- Pipetter inn i gel cast og forsiktig sette gel kam unngå bobler.
- Stram forseglingen ved å legge en stor binders over toppen av kassetten.
- La gelen polymeres i 1 time.
- Når gelen har befestet, fjerne bindemiddel klippet. Sett kassetten inn i elektroforese-boksen. Legg 1x TBE buffer i øvre og nedre reservoarer.
- Hent transkripsjon reaksjon. Tilsett vann opptil 100 μL, legg deretter til 100 μL av 2x gel loading buffer. Klargjør stigen ved å blande den anbefalte mengden med vann til 10 μL og 10 μL av 2x gel loading buffer til et separat 1,5 mL rør.
- Ruge både stigen og in vitro transkripsjon reaksjon i thermomixer ved 70 ° c i 15 min.
- Mens prøvene er denaturering ved 70 ° c, forsiktig fjerne kam, rengjør brønnene ved pipettering opp og ned hver brønn med en P1000 pipette, og umiddelbart pre-Run for 10 min på 100 V.
- Når prøvene har fullført 15 min denaturering ved 70 ° c, Fjern rørene fra thermomixer og plasser dem umiddelbart på isen.
- Rengjør hver brønn av gelen igjen med P1000 pipette. Last 20 μL av stigen på den første brønnen til venstre, 20 μL av RNA-prøven på 10 separate brønner, og 20 μL av 1x gel loading buffer på de unutilized brønnene.
- Kjør gelen på 100 V for 60-240 min, avhengig av% polyakrylamid av gel.
Merk: fargestoffer i gel loading buffer vil skille seg i to band som de Travers gelen, en langsom migrering Bromophenol Blue (BB) Blue band, og en rask migrering xylen Cyanol (XC) cyan band. Omtrentlig migrering av disse bandene i forskjellige% polyakrylamid gels er godt kjent (se trinn 1,11) og kan brukes til å anslå migrasjon av RNA i gelen. - Når gelen er stoppet, forsiktig fjerne gel fra kassetten.
- Plasser gelen i en ren eske som inneholder en oppløsning på 50 mL 1x TBE buffer med 50 μL av nukleinsyre yre gel beis og ruge i 5 minutter på en rocker til å farge på RNA.
- Ta en før og etter bandet forbruker bilde av gel på gel Imaging system, fortrinnsvis ved hjelp av blått lys i stedet for UV transillumination.
- Avgiftsdirektoratet hvert bånd av interesse ved hjelp av en nuklease-fri en gangs gel kutte spissen. Etter hver brønn, Overfør spissen som inneholder gel Slice til en 1,5 mL rør og kort spinn for å samle gel skive. Gjenta til alle bandene er samlet i samme 1,5 mL tube.
- Når alle gel skiver er samlet inn, tilsett 100 μL av nuklease vann eller TE buffer til 1,5 mL røret. Oppbevares ved 4 ° c for ~ 48 h. Dette gjør at RNA-en kan avslutte gel-skivene i løsningen.
- Etter 48 h, Pipet vann eller TE buffer til et friskt 1,5 mL rør. Kast de resterende gel skiver. Rens RNA-en via oppryddings settet som følger.
- Likevekt i romtemperatur i minst 30 minutter.
- Til 100 μL av RNA-løsning i det nye 1,5 mL rør fra trinn 1,32, tilsett 350 μL av RLT buffer og bland godt i 2 minutter på en nutator. Spin for 1 s på 200 x g for å samle løsning på bunnen av røret.
- Tilsett 675 μL av 100% EtOH og bland godt i 2 minutter på nutator. Spin for 1 s på 200 x g og umiddelbart gå videre til neste trinn.
- Overfør 565 μL av blandingen på spin-søylen og snurr i 1 min ved 15 000 x g. Tøm oppsamlings røret ved aspirasjon.
- Gjenta forrige trinn med den andre halvdelen av prøven.
- Tilsett 500 μL av RPE buffer til kolonnen og spinn i 1 min ved 15 000 x g. Tøm oppsamlings røret ved aspirasjon.
- Tilsett 750 μL av 80% etanol til søylen og spinn i 1 min ved 15 000 x g. Tøm oppsamlings røret ved aspirasjon.
- Plasser kolonnen i et nytt 2 mL oppsamlings rør med lokket åpent og snurr på 15 000 x g i 5 minutter.
- Overfør kolonnen til en ny 1,5 mL tube.
- Tilsett 17 μL vann på midten av søylen og snurr ved 15 000 x g i 1 min til eluere. Eluere igjen med ytterligere 17 μL vann. Det totale gjenopprettede volumet bør være 32 μL.
- Bland godt med virvlingen, Pipet 1,5 μL og mål konsentrasjonen av RNA ved hjelp av en microvolume spektrofotometer.
- Sjekk kvaliteten på RNA rensing av urea denaturering polyakrylamid gel som i trinn 1.11-1.29.
2. in vitro RNA methyltransferase-analysen
- Sett opp 100 μL RNA methyltransferase-analysen i et 1,5 mL rør på isen som følger: 23 μL vann, 10 μL av 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL av 0,05 M EDTA, 5 μL av 100 mM DTT , 40 μL av 50% glyserol, 4 μL av 58 μM 3H-Sam, 5 μL av 20X protease inhibitor cocktail, 1 ΜL av RNaseOUT (valgfritt), 5 ΜL av RNA og 5 μL av Methyltransferase.
FORSIKTIG: radioaktivt tritiated materiale er farlig og bør bare håndteres mens du bruker hansker, en Laboratoriefrakk og andre nødvendige PPE. Alle pipette-spisser og-rør i kontakt med radioaktivt materiale betraktes som solid radioaktivt avfall. Kasser alt fast og flytende radioaktivt avfall i henhold til laboratorie godkjente radioaktive avfalls protokoller.
Merk: ta med kontroll prøver uten methyltransferase og uten RNA. Reagens konsentrasjonen kan kreve optimalisering og/eller inkludering av divalent, for eksempel MgCl2, eller umerkede Sam. Den optimale rekkevidden av endelig RNA-konsentrasjon er fra 50 nM til 1 μM, mens methyltransferase konsentrasjon er fra 25 nM til 300 nM. - Bland godt ved å forsiktig virvlingen røret. Spin 5 s på 200 x g for å samle løsningen på bunnen av røret. Ruge røret (e) ved 37 ° c for 2 h.
- Rydd opp reaksjonen ved hjelp av kolonnen rensing som i trinn 1,32.
FORSIKTIG: Vær nøye med å kvitte deg med radioaktive materialer, spesielt i spalte vasken (pipette ut i stedet for aspirating avfall fra oppsamlings rørene). - Utfør flytende scintillation telling
- Sett opp scintillation telle rack med ett hetteglass per prøve, ett hetteglass for bakgrunns måling og ett hetteglass for sveipe testen. Fyll hetteglassene med 5 mL scintillation telle oppløsning.
- Tilsett 10 μL av hver eluert radioaktive RNA prøve i 1 hetteglass, og stram lokket og bland forsiktig.
- Forbered Swipe test hetteglassene. Gni bomullspinner grundig på alle overflater og utstyr som brukes under protokollen. Legg til servietter til hetteglassene fylt med 5 mL scintillation oppløsning og stram lokket.
- Kjør prøvene på scintillation telleren som følger. Åpne mot panseret, sett stativet inn i maskinen og Lukk hetten. Velg Tell enkelt rack. Velg Velg bruker program. Velg eller Opprett et program som måler tritium (3H) for 60 s. antall treff rack. Gjenta scintillation teller tre ganger.
Merk: utstyret vil måle scintillation telling av hver prøve og utgang til både skjermen og en utskrift. Protokoll kan stanses midlertidig her hvis ønskelig. Gjenværende RNA-prøver fra trinn 2,3 skal fryses ved-80 ° c for senere bruk.
- Fortsett med autoradiogram
- Forbered og pre-Run urea denaturering polyakrylamid gel som i trinn 1.11-1.20.
- Pipetter 20 μL av radioaktivt RNA-materiale i et nytt 1,5 mL rør som inneholder 20 μL av 2x gel loading buffer. Bland godt. Forbered stigen som i trinn 1,21. Ruge prøvene ved 70 ° c i 15 min.
- Vask brønnene på gelen en gang til umiddelbart før prøven lastes. Last 20 μL av den preparerte stigen, 20 μL av prøvene, og 20 μL av 1x gel loading buffer på gjenværende kjørefelt. Kjør gelen på 100 V for 60-180 min, avhengig av polyakrylamid prosent.
- Når gelen er ferdig, fjerner du gelen fra kassetten og legger den i en eske som inneholder 50 mL 1x TBE buffer med 5 μL av ultrasensitive nukleinsyre yre gel beis.
- Ruge i 5 minutter på vippebryteren for å farge på RNA-en.
- Forsiktig ta gel ut av esken og legg den på UV transilluminator av gel Imaging system med brønnene opp og stigen til venstre.
- Fokuser kameraet på gelen, slå på UV-lyset og ta et bilde av gelen ved å utsette fra 50 MS til 1 s avhengig av signal intensiteten.
- Slå av UV-eksponering, og lagre bildet som TIFF-fil.
- Plasser gelen tilbake i esken. Fjern TBE. Fix gelen med 50 mL feste løsning (50% metanol, 10% eddiksyre, 40% ultra-rent vann) i 30 min ved romtemperatur på en rocker.
- Beveg gelen forsiktig på nytt til en frisk, svart boks som inneholder 25 mL av autoradiografi styrke løsning. I fravær av en svart boks, dekk boksen med aluminiumsfolie for å beskytte løsningen mot lys.
- Ruge i 30 minutter ved romtemperatur på vippebryteren.
- Løft gelen forsiktig og sett den med forsiden ned på et ark med plastfolie med brønnene opp og stigen på høyre side. Plasser to ark med kromatografi papir på baksiden av gelen. Vend hele stabelen forsiktig.
- Før varme opp gel tørketrommelen til 80 ° c. Gå tilbake plastdekselet på gel tørketrommelen. Sett inn wrap, gel og kromatografi papirstabelen under plastdekselet og flytte plastdekselet ned igjen for å skape en forsegling.
- Tørk i 1 time ved 80 ° c i gel-tørketrommelen.
- Slå av gel tørketrommelen og fjern bunken forsiktig. Fjern wrap og andre kromatografi papir. Tape gjenværende kromatografi papir med tørket gel i en autoradiogram kassett.
- Tilsett 1 ark med autoradiografi film i mørket rommet.
- Plasser kassetten ved-80 ° c og utvikle filmen etter 1 time til 4 uker avhengig av signal intensitet, som kan bedømmes basert på tidligere målte scintillation teller: 1-4 uker for 250-1000 CPM, 24 timer til 1 uke for 1000-10000 CPM og 1 t til 24 h for > 10000 CP M.
- Når filmen er utviklet, plasserer filmen på toppen av kassetten og nøye merke med en lab markør de 4 kantene av gel, hver brønn, og plasseringen av XC og BB fargestoffer.
- Skann filmen på 300 eller 600 piksler per tomme oppløsning og lagre bildet som TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro transkripsjon reaksjon
Figur 2 A representerer en typisk kjøre fra en in vitro transkripsjon reaksjon med T7 RNA POLYMERASE av 7SK snRNA, som er en relativt kort (331 NT) og svært strukturert RNA. Idet vist opp på det ømt punkt image, der er mangfoldig uønsket bånd, begge to kortere vei og lengere enn 7SK, sannsynligvis forårsaket fra tilfeldig transcriptional innvielsen eller avslutning begivenheter. På grunn av dette, gel rensing etter in vitro transkripsjon reaksjonen er viktig å få en ren RNA prøve som vist i figur 2B. På dette punktet, kan RNA av interesse identifiseres ved sin plassering i forhold til stigen og renset ved gel rensing.
Som nevnt tidligere, kan det være nødvendig å optimalisere lengden på transkripsjon reaksjonen før gel rensing trinn. Transkripsjon reaksjoner som kjører for lenge kan resultere i ekstremt store mengder RNA produksjon, noe som gjør nedstrøms identifisering av riktig transkripsjon vanskelig. Det er også viktig å verifisere identiteten til renset transkripsjon av Reverse transkripsjon og kvantitative PCR (RTqPCR) ved hjelp av spesifikke primere.
In vitro RNA methyltransferase-analysen
Figur 3 viser et representativt resultat av en RNA methyltransferase-analyse som er beskrevet i protokollen, ved hjelp av den nedre grensen for våre anbefalte RNA-og protein konsentrasjoner. Denne analysen gjør det mulig for både kvantitative resultater fra scintillation teller, så vel som kvalitative resultater fra autoradiogram. Her ble MePCE, en RNA-methyltransferase kjent for å methylate 7SK10, vist å kunne også methylate U6. Videre, som nylig vist for 7SK16, binding av histone H4 til MePCE hemmer også U6 metylering. Vi var i stand til å observere dette i både scintillation Count (Figur 3C) og autoradiogram (Figur 3B), som viser robusthet av denne protokollen.
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av en typisk RNA methyltransferase analyse arbeidsflyt og forventede resultater. Sinefungin er en konkurransedyktig methyltransferase inhibitor. L: stigen; WT: vill type; M: katalysator; CPM: teller per min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Representative eksperiment som viser produktet av in vitro transkripsjon før (A) og etter (B) rensing på en denaturering urea-polyakrylamid 8% gel beiset med nukleinsyre syre flekken. Pilene peker på 7SK transkripsjon før og etter gel rensing. L: stigen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . In vitro RNA methyl-glutamyltransferase analysen utført med MePCE mot U6. In vitro-methyltransferase analysen ved hjelp av REKOMBINANT GST-MePCE (25 nM), 3H-radioaktivt Sam som metyl-gruppe giver og in vitro U6 RNA (50 nM) som substrat. Autoradiogram ble eksponert i 2 uker for å oppdage den resterende aktiviteten (250 CPM) i + histone H4-prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporteres en enkel og robust metode for in vitro-verifisering av RNA methyltransferase aktivitet mot spesifikke transkripsjoner. Analysen utnytter det faktum at S-adenosyl metionin kan tritiated på metyl-gruppen donor (figur 1), slik at denaturert RNA å være nøyaktig oppdages uten bruk av antistoffer. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne analysen ikke kan indikere hvilke rester eller kjemisk gruppe er denaturert av enzymet. Å identifisere eller bekrefte at en bestemt rest er denaturert, andre metoder som mutational analyse, omvendt transkripsjon blokk eller masse massespektrometri analyse av RNA underlaget kan brukes i forbindelse med RNA methyltransferase analysen.
Valget av RNAs og deres modus for syntese avhenger av størrelsen på RNA. Spesifikke RNAs av størrelser mellom 18 og 120 NT kan enkelt tilpasset syntetisert fra mange anerkjente nukleinsyre acid tilbydere. Men vanligvis er spesifikke RNAs i forskjellige størrelser in vitro. DNA maler for in vitro transkripsjon kan genereres på ulike måter, og krever sekvensen av interesse å være plassert nedstrøms for en T7 eller SP6 promoter. Når nøyaktige endene av RNAs er viktige, anbefales pRZ plasmider17. Den høye følsomheten til analysen (Figur 3) gjør det også mulig å erstatte en renset RNA med en blanding av mobilnettet RNA, enten total eller Messenger RNAs for eksempel. Faktisk, gel og autoradiogram gir en metode for å direkte observere størrelsen på RNA (s) målrettet for metylering.
Forholdene som rapporteres her i trinn 2,1 av protokollen er optimale for BIN3-familien av methyltransferases, som har to homologs hos mennesker, MePCE10 og BCDIN3D9. Det er viktig å understreke at analysen forholdene må justeres til den spesifikke protein og RNA av interesse. For eksempel ble det vist at tilstedeværelsen av MgCl2 avtar BCDIN3D aktivitet18, men MgCl2 kan være en viktig koordinator for RNA struktur, og kan dermed utgjøre en viktig del av analysen for andre RNA methyltransferases.
Fordelen av benytter en autoradiogram, hvilke kan utsatt for en utbygget perioden, er det alt den kanne tillate å merker meget svak aktivitet det er ikke oppdaget inne det scintillation analysen. Vanligvis indikerer dette at proteinet er en methyltransferase, men at en eller flere av reaksjons betingelsene eller reagensene må optimaliseres: enzym; substrat, kofaktor, buffer forhold, etc9. For eksempel kan enzymet rensing må forbedres for å fjerne eller endre plasseringen av koden. Det kan også være at RNA-en som brukes som substrat må brettes riktig eller til å samhandle med et annet protein eller RNA-faktor som skal denaturert av enzymet. Dermed, pre-eksisterende litteratur og/eller egne resultater i cellene må nøye gjennomgås for å sette opp analysen forhold for enzymet og RNA av interesse.
Analysen er også ekstremt fleksibel. For eksempel kan det være et forløper trinn til en annen type analyse, slik at radioaktivt denaturert RNA brukes i kvantitative og kvalitative demethylase analyser11, eller i RNA bindende analyser som tillater å spesifikt visualisere atferden til denaturert RNA-en i forhold til den uendrede. Analysen kan også lett justeres til å analysere modifikasjon av RNAs som bruker koenzymer som kan være radioaktivt merket, for eksempel acetyl koenzym A for studiet av RNA acetylering19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. turja Kanti Debnath for hans hjelp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe laboratoriet er støttet av Department of Defense-Congressionally regissert Medical Research program-brystkreft gjennombrudd Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 og oppstart midler fra Institute of Cellular og Molekylærbiologi og College of Natural Sciences ved University of Texas i Austin, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
