Summary
ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。
Abstract
RNAには100以上の化学的に異なる修飾があり、そのうちの3分の2はメチル化からなる。RNA修飾、特にメチル化への関心は、疾患や癌に関連する生物学的プロセスでそれらを書き、消去する酵素が果たしている重要な役割のために再浮上しました。ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のRNAメチル化ライタ活性の正確な分析のためのインビトロアッセイに敏感なアッセイが提供される。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンのトリチレートされた形態を使用し、トリチウムを用いてメチル化RNAを直接標識する。トリチウム放射線の低エネルギーは、この方法を安全にし、トリチウム信号増幅の既存の方法により、一般的に人工物になりやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化および可視化することを可能にします。この方法はRNAメチル化のために書かれていますが、14CアセチルコエンザイムA.を用いたRNAアセチル化など、放射性標識が可能な他のRNA修飾の研究に適用可能な調整はほとんどありません。メチル化条件、低分子阻害剤による阻害、またはRNAまたは酵素変異体の効果、および細胞で得られた結果を検証し、拡大するための強力なツールを提供する。
Introduction
DNA、RNAおよびタンパク質は、遺伝子発現1を厳密に調節する修飾の対象となる。これらの修飾の中で、メチル化は3つの生体高分子すべてに起こる。DNAとタンパク質のメチル化は、過去30年間に非常によく研究されています。対照的に、RNAメチル化への関心は、RNAメチル化を書き込み、消去、または結合するタンパク質が発達および疾患2において果たす重要な役割に照らして、最近再燃したばかりである。豊富なリボソームおよび転写RNAにおけるよりよく知られた機能に加えて、RNAメチル化経路は、特異的メッセンジャーRNA安定性3、4、スプライシング5および翻訳6、7を調節する。miRNA処理8、9および転写休止および放出10、11.
ここで、分子生物学研究室の設定におけるRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている(図1に要約)。多くの研究は、目的のRNA修飾に対する抗体を有するドットブロットを介してRNAメチルトランスフェラーゼの活性を評価する。しかしながら、ドットブロットは、RNAメチルトランスフェラーゼとのインキュベーション時にRNAの完全性を検証しない。ヌクレアーゼを用いた組換えタンパク質のわずかな汚染でさえ、部分的なRNA分解と交絡の結果につながる可能性があるため、これは重要です。さらに、非常に特異的なRNA修飾抗体でさえ、特定の配列または構造を持つ未修飾RNAを認識することができます。ここで報告されるインビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー上でトリチレートできるという事実を利用し(図1)、メチル化されたRNAを抗体を使用せずに正確に検出できるようにする.インビトロ転写および目的の酵素による前記転写のメチル化の試験の転写および精製のための指示が提供される。この方法は柔軟で堅牢であり、特定のプロジェクトのニーズに応じて調整できます。例えば、インビトロ転写および精製RNA、化学的に合成されたRNA、ならびに細胞RNAを用いることができる。このアッセイは、シンチレーションカウントの形で定量的な情報を提供するだけでなく、メチル化されたRNAがゲル上で正確に実行される場所を示すことによって定性的情報を提供します。これは、特に細胞RNAを基板として使用する場合に、メチル化の標的となるRNAまたはRNAのサイズを直接観察する方法を提供するため、RNAメチルトランスフェラーゼの機能に関するユニークな洞察を提供することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 標的RNAのインビトロ転写およびゲル精製
- 確立された分子クローニング技術12またはキットを使用してT7および/またはSP6プロモーターを含むプラスミドに目的の配列をクローンする。
- インビトロ転写のためのDNAテンプレートの線形化
- プラスミドのPCRによる関心の配列を、インサートを介してT7プロモーター領域を含むように設計されたプライマーで増幅し、前述の13と同様に上流+20〜30bpアップストリームと下流である。
- あるいは、制限酵素(RE)切断部位を用いてプラスミドのダイジェスト5μgを、REのサプライヤーの指示に従って下流にインサートで利用可能とする。
注: 選択した RE によって挿入がカットされていないことを再確認してください。このステップで使用されるREの選択は、転写物の収率に劇的に影響を与える可能性があります。優先的には、反対側のDNA鎖14上のT7 RNAポリメラーゼのテンプレート切り替えを避けるためにREを製造する鈍いまたは5'-オーバーハングエンドで線形化する。初期歩留まりが不十分な場合は、別の RE を試してください。
- DNAアガロースゲル抽出とクリーンアップのためのキットを使用して得られたDNAを浄化します。30 μLの水でDNAを溶出します。
- 渦、ピペ、1.5 μLでよく混合し、マイクロボリューム分光光度計でDNA濃度を測定します。
- 250 ngのDNAを使用して、1%のアガロースゲル電気泳動の精製DNAの品質と大きさを1x TBEバッファーで4V/cmで1時間移行しました。
- インビトロ転写キットの凍結試薬を解凍する。T7 RNA ポリメラーゼミックスを氷の上に置き、他の試薬を室温でヌタターに置きます。完全な解凍の直後に、5sのrNTPチューブを素早く回転させ、チューブの底部に溶液を集め、氷の上に置きます。沈殿を避けるために、室温で10x反応バッファーを保ちます。
- 1.5 mLチューブにピペットは、指定された順序で室温で20 μL転写反応の次のコンポーネント:水の6 μL、線形DNAテンプレートの2 μL(0.1 - 1 μg)、75 mM GTP溶液の2 μL、75 mM GTP溶液の2 μL、75 mM CTP 溶液の 2 μL、75 mM UTP 溶液の 2 μL、10 倍の反応バッファーの 2 μL、および T7 RNA ポリメラーゼ ミックスの 2 μL。
注:PCRによって生成されたDNAテンプレートの場合は、100~ 200 ng DNAを使用します。プラスミドの制限酵素ダイジェストによって生成されたDNAテンプレートについては、〜1 μg.活性組換えHis6-タグ付きT7 RNAポリメラーゼを大腸菌15で精製することができる。 - チューブを十分に混ぜます。チューブの底部に反応溶液を集めるために5sのクイックスピンを行い、その後2〜4時間37°Cでインキュベートします。
注:すべてのトランスクリプトは、DNAテンプレート、その長さ、その配列または構造に応じて異なる動作をします。最大6時間までの異なるインキュベーション時間をテストすることにより、インビトロ転写条件を最適化します。DNAテンプレート、T7 RNAポリメラーゼ、またはNTPの異なる濃度;またはT7 RNAポリメラーゼミックス中に存在するものに対する補足MgCl2の添加。 - インキュベーション期間の終わりに、20 μL反応あたりDNase Iの1 μLを加え、37°Cで15分間インキュベートする。
注:転写反応は、ポリアクリルアミドゲルの準備ができるまで、一時的に氷の上に保つことができます。 - ポリアクリルアミドゲルによる精製を進めます。
注:RNAはpHおよびRNase汚染に敏感であるため、RNA専用機器とRNaseフリー試薬を使用してください。 - 目的のトランスクリプトのサイズに応じてゲルのポリアクリルアミドの割合を決定する: 100-2000 nt (XC: 460 nt;BB: 100 nt) 5% 80-500 nt (XC: 260 nt;BB: 65 nt) 60-400 nt (XC: 160 nt;BB: 45 nt), 12% 40-200 nt (XC: 70 nt ;BB: 20 nt), 15- 150 nt (XC: 60 nt;BB: 15 nt) および 20% 6-100 nt (XC: 45 nt;BB:12 nt)。
- 50 mL円錐管に以下の試薬を組み合わせて尿素脱電性ポリアクリルアミドゲルを調製する:分子グレード尿素の9.6g、10x TBEの2mL、40%アクリルアミドのx mL:ビスアクリルアミドミックス(29:1)とチューブ上の20mLマークまでの水、x=20 mL/(40%/ゲルパーセンテージ%)。
注意:ポリアクリルアミドゲルは、多くの場合、環境に導入されたときに危険を引き起こす可能性のある有毒物質である非重合化アクリルアミドが含まれています。施設の化学廃棄物プログラムを通じてポリアクリルアミドゲルを処分する。 - 30%の電力で15sのための電子レンジ。室温で10分間、または尿素が完全に溶解するまで、ヌタターの上に置きます。
- ゲル混合物が回転している間、ゲルカセット(18ウェル、厚さ1mm、13.3 x 8.7 cm(W x L))を取り出し、櫛を取り出し、ゲル鋳造用のカセットを配置します。
- 50 mLチューブを50mLのチューブで素早く回転し、チューブの底部にゲル溶液を回収します。10%のペルサル酸アンモニウム溶液(APS)の125 μLを追加します。ナタターの上に約1分間、5sのクイックスピンをもう一度置きます。
- テトラメチレチレンジアミン(TEMED)の25 μLを追加し、気泡を避ける25 mLピペットで5回上下にピペッティングして慎重に混合します。
- パイペットをゲルキャストに入れ、気泡を避けてゲル櫛を慎重に挿入します。
- カセットの上に大きなバインダークリップを追加してシールを締めます。
- ゲルを1時間重合させる。
- ゲルが固まったら、バインダークリップを取り外します。カセットを電気泳動ボックスに挿入します。上部と下部のリザーバに 1x TBE バッファを追加します。
- 転写反応を取得します。最大100 μLの水を加え、2倍ゲルローディングバッファの100 μLを追加します。推奨量を水と混合して、2倍ゲルローディングバッファの10 μLと10 μLを別の1.5 mLチューブに混ぜてラダーを準備します。
- サーモミキサー内のはしごとインビトロ転写反応の両方を70°Cで15分間インキュベートします。
- サンプルが70°Cで脱育している間、慎重に櫛を取り除き、P1000ピペットで各井戸を上下にピペットでウェルをきれいにし、すぐに100Vで10分間事前に実行します。
- サンプルが70°Cで15分の脱退を完了したら、サーモミキサーからチューブを取り出し、すぐに氷の上に置きます。
- P1000ピペットでゲルの各井戸をもう一度きれいにします。最初のウェルに20 μLのラダーを左に、10個の別々のウェルにRNAサンプルの20 μL、未利用ウェルに1xゲルローディングバッファの20 μLをロードします。
- ゲルの%ポリアクリルアミドに応じて、60-240分間100Vでゲルを実行します。
注:ゲルローディングバッファ内の染料は、ゲルを横断する際に2つのバンドに分け、ブロモフェノールブルー(BB)ブルーバンドをゆっくりと移動し、シレンシアノール(XC)シアンバンドを高速に移動します。異なる%ポリアクリルアミドゲルにおけるこれらのバンドの近似移動はよく知られており(ステップ1.11参照)、ゲル中のRNAの移行を推定するために使用することができる。 - ゲルが止まったら、カセットから慎重に取り出します。
- 50 μLの核酸ゲル染色を有する1x TBEバッファーの溶液を含むクリーンボックスにゲルを入れ、ロッカーに5分間インキュベートしてRNAを染色します。
- ゲルイメージングシステム上のゲルのバンド切除前後の画像を撮り、好ましくはUVトランスイルミネーションの代わりに青色光を用いる。
- ヌクレアーゼフリーの使い捨てジェル切断チップを使用して、関心のある各バンドを物品抜き。各ウェルの後、ゲルスライスを含む先端を1.5 mLチューブに移し、簡単に回転してゲルスライスを収集します。すべてのバンドが同じ1.5 mLチューブに集まるまで繰り返します。
- すべてのゲルスライスが収集されたら、1.5 mLチューブに100 μLのヌクレアーゼフリー水またはTEバッファーを追加します。4°C~48時間保存します。これにより、RNAはゲルスライスを溶液中に出します。
- 48時間後、水またはTEバッファを新鮮な1.5 mLチューブにピプテします。残りのゲルスライスを廃棄します。クリーンアップキットを介してRNAを以下のように精製します。
- 少なくとも30分間、室温でスピンカラムを平衡化します。
- ステップ1.32から新しい1.5 mLチューブ内のRNA溶液の100 μLに、RLTバッファーの350 μLを追加し、ヌタター上で2分間よく混ぜます。チューブの底部に溶液を収集するために200 x gで1sのためにスピンします。
- 100%EtOHの675 μLを追加し、ナタター上で2分間よく混ぜます。200 x gで 1 s スピンし、すぐに次の手順に進みます。
- 混合物の565 μLをスピンカラムに移し、15,000 x gで1分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。
- サンプルの後半で前の手順を繰り返します。
- 500 μL の RPE バッファーをカラムに追加し、15,000 x gで 1 分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。
- カラムに80%エタノールの750 μLを加え、15,000 x gで1分間スピンします。吸引によってコレクションチューブを空にします。
- 新しい2 mLコレクションチューブにカラムを入れ、蓋を開けて15,000 x gで5分間回転させます。
- カラムを新しい1.5 mLチューブに移します。
- カラムの中心に17 μLの水を加え、1分間15,000 x gで回転させます。別の17 μLの水を使用して再び溶出します。回収量の合計は 32 μL である必要があります。
- 渦、ピペ、1.5 μLでよく混合し、マイクロボリューム分光光度計を使用してRNAの濃度を測定します。
- 手順1.11-1.29のように尿素脱電ポリアクリルアミドゲルによるRNA精製の品質を確認してください。
2. インビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイ
- 氷上の1.5 mLチューブに100 μL RNAメチルトランスフェラーゼアッセイをセットアップします: 23 μL の水, 10x TBS の 10 μL (500 mM トリス-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 2 μL の 0.05 M EDTA, 5 μL の 10M MT,50%グリセロールの40μL、58μM 3H-SAMの4μL、20倍プロテアーゼ阻害剤カクテルの5μL、RNaseOUTの1μL(オプション)、5μLのRNAおよび5 μLのメチルトランスフェラーゼ。
注意:放射性トリチド材料は危険であり、手袋、ラボコート、その他必要なPPEを着用している間のみ取り扱う必要があります。放射性物質と接触するすべてのピペットの先端および管は固体放射性廃棄物と見なされる。ラボの承認された放射性廃棄物プロトコルに従って、すべての固体および液体放射性廃棄物を処分する。
注:メチルトランスフェラーゼなしで、RNAなしでコントロールサンプルを含めます。試薬濃度は、MgCl2、またはラベルなしのSAMなどの二価陽イオン塩の最適化および/または包含を必要とする場合があります。最終的なRNA濃度の最適な範囲は50nMから1 μMであり、メチルトランスフェラーゼ濃度は25nMから300nMです。 - チューブをそっと渦にして十分に混ぜます。200 x gで5sをスピンし、チューブの底部に溶液を集えます。チューブを37°Cで2時間インキュベートします。
- ステップ 1.32 のようにカラム精製を使用して反応をクリーンアップします。
注意:特にカラム洗い(回収管から廃棄物を吸引する代わりにピペット)の間に、放射性物質を適切に処分するように非常に注意してください。 - 液体シンチレーションカウントの実行
- サンプルごとに1つのバイアル、バックグラウンド測定用のバイアル、スワイプテスト用のバイアルを備えたシンチレーションカウントラックを設定します。シンチレーション計数溶液の5 mLでバイアルを充填します。
- 1バイアルに各eleの放射性RNAサンプルの10 μLを追加し、蓋を締め、穏やかに混ぜます。
- スワイプ テスト バイアルを準備します。プロトコル中に使用されるすべての表面および装置に綿棒を徹底的にこする。5 mLのシンチレーション溶液で満たされたバイアルに綿棒を追加し、蓋を締めます。
- シンチレーション カウンタでサンプルを次のように実行します。カウンタフードを開き、ラックをマシンに挿入し、フードを閉じます。 [単一ラックをカウント] を選択します。[ユーザー プログラムの選択] を選択します。60 s. ヒットカウントラックのトリチウム (3 H) を測定するプログラムを選択または作成します。シンチレーションカウントを3回繰り返します。
注:装置は各サンプルのシンチレーション数を測定し、画面とプリントアウトの両方に出力します。必要に応じて、プロトコルはここで一時停止できます。ステップ2.3からの残りのRNAサンプルは、後で使用するために-80 °Cで凍結する必要があります。
- オートラジオグラムに進む
- ステップ1.11-1.20のように、ポリアクリルアミドゲルを脱帰する尿素を準備し、前に実行します。
- 2xゲルローディングバッファの20 μLを含む新しい1.5 mLチューブに放射性RNA材料のピペット20 μL。よく混ぜる。手順 1.21 のようにはしごを準備します。70°Cで15分間サンプルをインキュベートします。
- サンプルロードの直前にもう一度ゲルの井戸を洗います。準備されたはしごの20 μL、サンプルの20 μL、残りのレーンに1xゲルローディングバッファの20 μLをロードします。ポリアクリルアミドのパーセンテージに応じて、60〜180分間100Vでゲルを実行します。
- ゲルが走り終わったら、カセットからゲルを取り出し、5μLの超高感度核酸ゲル染色で50mLの1x TBEバッファーを含む箱に入れます。
- ロッカーで5分間インキュベートしてRNAを染色します。
- 慎重に箱からゲルを取り出し、ウェルを上にして左側のはしごでゲルイメージングシステムのUVトランシルミニエーターに置きます。
- カメラをゲルに集中させ、紫外線を点灯させ、信号強度に応じて50ミリ秒から1秒に露出してゲルの画像を撮ります。
- 紫外線露光をオフにし、画像を Tiff ファイルとして保存します。
- ゲルを箱に戻します。TBE を削除します。50 mLの固定液(50%メタノール、10%酢酸、40%超純水)でゲルをロッカーの室温で30分間固定します。
- 自己無線撮影強化溶液の25 mLを含む新鮮なブラックボックスに再びゲルを静かに移動します。ブラックボックスがない場合は、ボックスをアルミホイルで覆い、溶液を光から保護します。
- ロッカーの室温で30分間インキュベートします。
- ゲルをそっと持ち上げ、井戸を上にして右側のはしごを持ったプラスチックラップのシートの上に顔を下に置きます。ゲルの背面にクロマトグラフィー用紙を2枚置きます。スタック全体をゆっくりと反転します。
- ゲル乾燥機を80°Cに予熱します。ゲル乾燥機のプラスチックカバーを戻します。プラスチックカバーの下にラップ、ゲル、クロマトグラフィーの紙スタックを挿入し、プラスチックカバーを下に戻してシールを作成します。
- ゲル乾燥機で80°Cで1時間乾燥させます。
- ゲル乾燥機の電源を切り、スタックを静かに取り外します。ラップと2枚目のクロマトグラフィー用紙を取り外します。オートラジオグラムカセット中の乾燥ゲルを用いたテープ残留クロマトグラフィー紙。
- 暗い部屋に自動無線フィルムの1枚を追加します。
- カセットを-80 °Cに置き、以前に測定されたシンチレーションカウントに基づいて判断できる信号強度に応じて1時間から4週間後にフィルムを開発する:250-1,000 cpmの場合は1~4週間、1,000~10,000cpmの場合は24~1週間、>1000000000h.000hは1時間から24時間M。
- フィルムが開発されたら、カセットの上にフィルムを置き、慎重にラボマーカーでゲルの4つのエッジ、各ウェル、およびXCとBB染料の位置をマークします。
- フィルムを 1 インチあたり 300 ピクセルまたは 600 ピクセルの解像度でスキャンし、画像を Tiff ファイルとして保存します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
インビトロ転写反応
図 2Aは、比較的短い(331 nt)および高度に構造化されたRNAである7SK snRNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的な実行を表す。その生の画像に示すように、7SKより短く、長い両方の複数の望ましくないバンドがあり、おそらくランダム転写開始または終了イベントから生じる。このため、インビトロ転写反応に続くゲル精製は、図2Bに示すようにクリーンなRNA試料を得ることが重要である。この時点で、目的のRNAは、はしごに対するその位置によって識別され、ゲル精製によって精製することができる。
前述したように、ゲル精製工程の前に転写反応の長さを最適化する必要がある場合がある。あまりにも長く実行される転写反応は、非常に大量のRNA産生をもたらし、正しい転写物の下流の同定を困難にする。また、特定のプライマーを使用して、逆転写および定量PCR(RTqPCR)による精製転写物の同一性を確認することも重要です。
インビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイ
図3は、推奨されるRNAおよびタンパク質濃度の下限を用いてプロトコルに記載されたRNAメチルトランスフェラーゼアッセイの代表的な結果を示す。このアッセイは、シンチレーションカウントからの定量的な結果と、オートラジオグラムからの定性的な結果の両方を可能にします。ここで、MePCEは、メチル酸7SK10に知られているRNAメチルトランスフェラーゼを、U6もメチル化できることを示した。さらに、最近示すように、7SK16に示すように、ヒストンH4とMePCEへの結合もU6メチル化を阻害する。シンチレーションカウント(図3C)とオートラジオグラム(図3B)の両方でこれを観察することができ、このプロトコルの堅牢性を示した。
図 1.典型的なRNAメチルトランスフェラーゼアッセイワークフローおよび期待される結果の概略表現。Sinefunginは、競争力のあるメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。L: はしご;WT: 野生のタイプ;M: 触媒変異体;cpm: 分あたりのカウントは、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.(A)及び(B)核酸染色で染色された無電化尿素ポリアクリルアミド8%ゲルに対するインビトロ転写の産物を示す代表的な実験。矢印はゲル精製前後の7SK転写物を指す。L:はしご。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.インビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイは、U6に対してMePCEと共に行った。組換えGST-MePCE(25nM)を用いたインビトロメチルトランスフェラーゼアッセイでは、メチル基ドナーとして3H-放射性SAMを、インビトロでU6 RNA(50nM)を基板として転写した。オートラジオグラムは、+Histone H4サンプル中の残留活性(250cpm)を検出するために2週間曝露した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで、特定の転写物に向けたRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー(図1)でトリチレートできるという事実を利用して、メチル化RNAを抗体を使用せずに正確に検出することができます。しかし、このアッセイは、どの残基または化学基が酵素によってメチル化されるかを示すことができないことに注意することが重要です。特定の残基がメチル化されていることを特定または検証するために、変異解析、逆転転写ブロックまたはRNA基質の質量分析分析などの他の方法を、RNAメチルトランスフェラーゼアッセイと組み合わせて使用することができる。
RNAの選択とその合成モードは、RNAのサイズによって異なります。18と120 ntの間のサイズの特定のRNAは、多くの評判の高い核酸プロバイダーから便利にカスタム合成することができます。しかし、最も一般的には、様々なサイズの特定のRNAはインビトロ転写される。インビトロ転写のためのDNAテンプレートは、様々な方法で生成することができ、T7またはSP6プロモーターの下流に位置する目的のシーケンスを必要とします。RNAの正確な終端が重要な場合、pRZプラスミドは17を推奨する。アッセイ(図3)の高感度はまた、精製されたRNAを細胞RNAの混合物、例えば総またはメッセンジャーRNAのいずれかに置換することを可能にする。実際、ゲルおよびオートラジオグラムは、メチル化を標的とするRNAの大きさを直接観察する方法を提供する。
プロトコルのステップ2.1でここで報告された条件は、ヒトに2つのホモログを有するメチルトランスフェラーゼのBIN3ファミリーに最適です, MePCE10とBCDIN3D9.アッセイ条件は、目的とする特定のタンパク質およびRNAに調整する必要があることを強調することが重要です。例えば、MgCl2の存在がBCDIN3D活性18を減少させることが示されたが、MgCl2はRNA構造の重要なコーディネーターであり、したがって他のRNAのアッセイの重要な構成要素を構成し得る。 メチルトランスフェラーゼ。
長期間露出できるオートラジオグラムを使用する利点は、シンチレーションアッセイでは検出されない非常に弱い活性を検出できることです。通常、これはタンパク質がメチルトランスフェラーゼであることを示していますが、1つ以上の反応条件または試薬を最適化する必要があることを示しています: 酵素;基板、コファクター、バッファー条件など9.例えば、酵素精製は、タグの位置を除去または変更するために改善する必要がある場合がある。また、基質として使用されるRNAを適切に折りたたんだり、酵素によってメチル化される別のタンパク質またはRNA因子と相互作用する必要があるかもしれません。したがって、細胞における既存の文献および/または独自の結果は、目的とする酵素およびRNAのアッセイ条件を設定するために慎重に検討する必要があります。
アッセイも非常に柔軟です。例えば、放射性メチル化されたRNAが定量および定性的脱メチラーゼアッセイ11に使用されるような別のタイプのアッセイへの前駆体ステップであり得る、またはRNA結合アッセイにおいて、特異的に挙動を可視化することを可能にする。未改変RNAと比較してメチル化されたRNA。アッセイはまた、RNAアセチル化19、20の研究のためのアセチルコエンザイムAなどの放射性標識することができるコエンザイムを使用するRNAの修飾を分析するために軽く調整することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者たちは、ChemDrawに対する彼の助けに対して、トゥルジャ・カンティ・デブナート博士に感謝したいと思います。Xhemalçeラボでの研究は、国防総省によってサポートされています - 議会指向医学研究プログラム - 乳癌ブレークスルー賞(W81XWH-16-1-0352)、NIHグラントR01 GM127802および細胞研究所からのスタートアップ資金と米国オースティンのテキサス大学の分子生物学と自然科学のカレッジ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
