Summary
Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.
Abstract
Es gibt mehr als 100 chemisch unterschiedliche Modifikationen der RNA, von denen zwei Drittel aus Methylierungen bestehen. Das Interesse an RNA-Modifikationen, insbesondere Methylierungen, ist aufgrund der wichtigen Rolle der Enzyme, die sie schreiben und löschen, in biologischen Prozessen, die für Krankheiten und Krebs relevant sind, wieder aufgetaucht. Hierbei wird ein empfindlicher In-vitro-Assay zur genauen Analyse der RNA-Methylierungs-Writer-Aktivität an synthetischen oder in vitro transkribierten RNAs bereitgestellt. Dieser Test verwendet eine tritiated Form von S-Adenosyl-Methionin, was zu einer direkten Etikettierung von methylierter RNA mit Tritium führt. Die geringe Energie der Tritiumstrahlung macht die Methode sicher, und bereits bestehende Methoden der Tritiumsignalverstärkung ermöglichen es, die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern, die häufig anfällig für Artefakte sind, zu quantifizieren und zu visualisieren. Während diese Methode für die RNA-Methylierung geschrieben ist, machen wenige Optimierungen es für die Untersuchung anderer RNA-Modifikationen anwendbar, die radioaktiv markiert werden können, wie z. B. RNA-Acetylierung mit 14C Acetyl-Coenzym A. Insgesamt ermöglicht dieser Assay eine schnelle Bewertung der RNA Methylierungsbedingungen, Hemmung mit kleinen Molekülinhibitoren oder die Wirkung von RNA- oder Enzymmutanten und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die in Zellen erhaltenen Ergebnisse zu validieren und zu erweitern.
Introduction
DNA, RNA und Proteine unterliegen Modifikationen, die die Genexpression1streng regulieren. Unter diesen Modifikationen treten Methylierungen auf allen drei Biopolymeren auf. DNA- und Proteinmethylierungen wurden in den letzten drei Jahrzehnten sehr gut untersucht. Im Gegensatz dazu wurde das Interesse an der RNA-Methylierung erst vor kurzem angesichts der wichtigen Rolle neu entfacht, die Proteine, die RNA-Methylierungen schreiben, löschen oder binden, in Entwicklung und Krankheit2spielen. Neben bekannteren Funktionen in den reichlich ribosomalen und Transfer-RNAs regulieren RNA-Methylierungswege die spezifische Boten-RNA-Stabilität3,4, spleißen5 und Translation6,7, miRNA-Verarbeitung8,9 und Transkriptionspausimierung und Freigabe10,11.
Hier wird eine einfache und robuste Methode zur In-vitro-Verifizierung der RNA-Methyltransferase-Aktivität bei der Einstellung eines molekularbiologischen Labors berichtet (zusammengefasst in Abbildung 1). Viele Studien bewerten die Aktivität einer RNA-Methyltransferase durch Dot-Blot mit einem Antikörper gegen die RNA-Modifikation von Interesse. Dot-Blot überprüft jedoch nicht die Integrität der RNA bei der Inkubation mit der RNA-Methyltransferase. Dies ist wichtig, da schon geringfügige Kontaminationen rekombinanter Proteine mit Nukleasen zu einem partiellen RNA-Abbau und verwirrenden Ergebnissen führen können. Darüber hinaus können selbst hochspezifische RNA-Modifikationsantikörper unveränderte RNAs mit spezifischen Sequenzen oder Strukturen erkennen. Der hier berichtete In-vitro-RNA-Methyltransferase-Assay nutzt die Tatsache aus, dass das S-Adenosylmethionin auf den Methylgruppenspender tritiiert werden kann (Abbildung 1), so dass die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern genau nachgewiesen werden kann. . Es werden Anweisungen für die In-vitro-Transkription und die Reinigung einer Voninteresses-Transkription und die Prüfung der Methylierung dieser Transkription durch das Enzym von Interesse bereitgestellt. Diese Methode ist flexibel und robust und kann an die Bedürfnisse eines bestimmten Projekts angepasst werden. Zum Beispiel können in vitro transkribierte und gereinigte RNAs, chemisch synthetisierte RNAs, aber auch zelluläre RNAs verwendet werden. Dieser Assay liefert quantitative Informationen in Form von Szintillationszahlen sowie qualitative Informationen, indem er zeigt, wo genau die methylierte RNA auf einem Gel läuft. Dies kann einen einzigartigen Einblick in die Funktion einer RNA-Methyltransferase bieten, insbesondere bei verwendung von zellulären RNAs als Substrat, da es eine Methode bietet, um die Größe der RNA oder RNAs, die für die Methylierung bestimmt sind, direkt zu beobachten.
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Protocol
1. In-vitro-Transkription und Gelreinigung der Ziel-RNA
- Klonen Sie die Abfolge des Interesses in Plasmiden, die T7- und/oder SP6-Promotoren enthalten, indem Sie etablierte molekulare Klontechniken12 oder Kits verwenden.
- Linearisieren der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription
- Verstärken Sie die Interessensfolge durch PCR des Plasmids mit Primern, die den T7-Promotorbereich durch den Einsatz, +20-30 bp vor- und nachgelagert, wie zuvor beschrieben13,einschließen sollen.
- Alternativ können Sie 5 g des Plasmids mit hilfe einer Restriktionsenzym-Schnittstelle nach dem Einsatz nach dem Einsatz gemäß den Anweisungen des Lieferanten des RE verdauen.
HINWEIS: Denken Sie daran, zu überprüfen, ob die Einlage nicht durch den ausgewählten RE geschnitten wird. Die Auswahl des in diesem Schritt verwendeten RE kann die Ausbeute des Transkripts dramatisch beeinflussen. Bevorzugt linearisieren Sie mit einem stumpfen oder 5'-überhängenden Ende, das RE erzeugt, um eine Schablonenumschaltung der T7-RNA-Polymerase auf den gegenüberliegenden DNA-Strang14zu vermeiden. Probieren Sie verschiedene RE aus, wenn die Anfänglichen Ausbeute nicht ausreicht.
- Reinigen Sie die resultierende DNA mit dem Kit für DNA-Agarose-Gel-Extraktion und Reinigung. Elute die DNA mit 30 l Wasser.
- Mischen Sie gut durch Wirbeln, Pipetten 1,5 l und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
- Verwenden Sie 250 ng DNA, um die Qualität und Größe der gereinigten DNA auf einer 1% Agarose-Gel-Elektrophorese in 1x TBE-Puffer zu überprüfen, der für 1 h bei 4 V/cm migriert wurde.
- Die gefrorenen Reagenzien des In-vitro-Transkriptionskits auftauen. Legen Sie den T7 RNA Polymerase Mix auf Eis und die anderen Reagenzien bei Raumtemperatur auf einen Nutator. Unmittelbar nach dem vollständigen Auftauen, drehen Sie die rNTP-Rohre für 5 s, um Lösung an der Unterseite der Rohre zu sammeln und auf Eis zu legen. Halten Sie den 10x Reaktionspuffer bei Raumtemperatur, um Niederschläge zu vermeiden.
- Pipetten Sie in ein 1,5 ml-Rohr die folgenden Komponenten der 20-L-Transkriptionsreaktion bei Raumtemperatur in der angegebenen Reihenfolge: 6 l Wasser, 2 l (0,1 - 1 g) lineare DNA-Schablone, 2 l 75 mM ATP-Lösung, 2 l 75 mM GTP-Lösung , 2 l von 75 mM CTP-Lösung, 2 l 75 mM UTP-Lösung, 2 l 10x Reaktionspuffer und 2 l T7-RNA-Polymerase-Mix.
HINWEIS: Für DNA-Vorlage von PCR erzeugt, verwenden Sie 100 - 200 ng DNA; für DNA-Schablone durch Restriktionsenzym-Digest eines Plasmids erzeugt,verwenden Sie 1 g. Aktives Rekombinantes Seine 6-tagged T7 RNA Polymerase kann in E. coli15gereinigt werden. - Mischen Sie das Rohr gründlich. Schnellspin für 5 s, um Reaktionslösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln, dann bei 37 °C für 2-4 h inkubieren.
HINWEIS: Jedes Transkript verhält sich je nach DNA-Vorlage, Seiner Länge, seiner Sequenz oder Struktur unterschiedlich. Optimierung der In-vitro-Transkriptionsbedingungen durch Die Prüfung verschiedener Inkubationszeiten bis zu 6 h; unterschiedliche Konzentrationen von DNA-Schablonen, T7-RNA-Polymerase oder NTP; oder Ergänzung von zusätzlichem MgCl2 zu dem, was im T7 RNA Polymerase Mix vorhanden ist. - Am Ende der Inkubationszeit 1 l DNase I pro 20-L-Reaktion hinzufügen und bei 37 °C für 15 min inkubieren.
HINWEIS: Die Transkriptionsreaktion kann vorübergehend auf Eis gehalten werden, bis das Polyacrylamid-Gel fertig ist. - Mit der Reinigung durch Polyacrylamid-Gel fortfahren.
HINWEIS: Da RNA empfindlich auf pH- und RNase-Kontamination reagiert, verwenden Sie RNA-dedizierte Geräte und RNase-freie Reagenzien. - Bestimmen Sie den Prozentsatz von Polyacrylamid für das Gel in Abhängigkeit von der Größe der Transkriptvon: 3,5% für 100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt), 5% für 80-500 nt (XC: 260 nt ; BB: 65 nt), 8% für 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% für 40-200 nt (XC: 70 nt ; BB: 20 nt), 15% für 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt) und 20% für 6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).
- Bereiten Sie das Harnstoff-denaturierendes Polyacrylamid-Gel vor, indem Sie folgende Reagenzien in einem 50 ml konischen Röhrchen kombinieren: 9,6 g harnstoffförmiger Harnstoff, 2 ml 10x TBE, x ml 40% Acrylamid:bis-Acrylamid-Mischung (29:1) und Wasser bis zur 20 ml-Marke auf der Tube , wobei x=20 ml/(40%/Gel-Prozentsatz %).
VORSICHT: Polyacrylamid-Gele enthalten oft nicht polymerisiertes Acrylamid, das ein giftiges Material ist, das eine Gefahr darstellen kann, wenn es in die Umwelt eingeführt wird. Entsorgen Sie Polyacrylamid-Gele über das chemische Abfallprogramm der Institution. - Mikrowelle für 15 s bei 30% Leistung. 10 min bei Raumtemperatur oder bis sich Der Harnstoff vollständig aufgelöst hat, auf den Nutator legen.
- Während sich die Gelmischung dreht, eine Gelkassette (18-well, 1 mm dick; 13,3 x 8,7 cm (B x L)) abrufen, den Kamm entfernen und die Kassette für den Gelguss positionieren.
- Drehen Sie das 50 ml Rohr für 5 s schnell, um Gellösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Fügen Sie 125 L 10% Ammoniumpersulfatlösung (APS) hinzu. Legen Sie auf den Nutator für 1 min. Schnelldrehung wieder für 5 s.
- Fügen Sie 25 l Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie 5 Mal mit einer 25 ml Pipette, die Blasen vermeidet, auf und ab pfeifen.
- Pipette in das Gel gegossen und vorsichtig setzen Sie den Gelkamm Vermeidung von Blasen.
- Ziehen Sie die Dichtung fest, indem Sie einen großen Binderclip über der Oberseite der Kassette hinzufügen.
- Lassen Sie das Gel für 1 h polymerisieren.
- Sobald sich das Gel verfestigt hat, entfernen Sie den Bindemittelclip. Legen Sie die Kassette in die Elektrophorese-Box ein. Fügen Sie 1x TBE-Puffer in die oberen und unteren Reservoirs.
- Transkriptionsreaktion abrufen. Fügen Sie Wasser bis zu 100 l hinzu, und fügen Sie dann 100 L 2x Gel Loading Buffer hinzu. Bereiten Sie die Leiter vor, indem Sie die empfohlene Menge mit Wasser auf 10 l und 10 l 2x Gel-Ladepuffer in ein separates 1,5 ml-Rohr mischen.
- Inkubieren Sie sowohl die Leiter als auch die In-vitro-Transkriptionsreaktion im Thermomixer bei 70 °C für 15 min.
- Während die Proben bei 70 °C denaturieren, den Kamm vorsichtig entfernen, die Brunnen reinigen, indem Sie jeden Brunnen mit einer P1000 Pipette auf und ab pfeifen und sofort 10 min bei 100 V vorlaufen.
- Sobald die Proben ihre 15 min Denaturierung bei 70 °C abgeschlossen haben, entfernen Sie die Rohre aus dem Thermomixer und legen Sie sie sofort auf Eis.
- Reinigen Sie jeden Brunnen des Gels erneut mit der P1000 Pipette. Laden Sie 20 l der Leiter auf den ersten Brunnen links, 20 l der RNA-Probe auf 10 separate Bohrgutunden und 20 l 1x Gel-Ladepuffer auf die nicht genutzten Bohrungen.
- Führen Sie das Gel bei 100 V für 60 -240 min, abhängig von der % Polyacrylamid des Gels.
HINWEIS: Die Farbstoffe im Gel-Ladepuffer trennen sich in zwei Bänder, während sie das Gel durchqueren, ein langsam migrierendes Bromophenol Blue (BB) blaues Band und ein schnell migrierendes Xylencyanol (XC) Cyan-Band. Die ungefähre Migration dieser Bänder in verschiedenen % Polyacrylamid-Gelen ist bekannt (siehe Schritt 1.11) und kann verwendet werden, um die Migration von RNA im Gel abzuschätzen. - Nachdem das Gel angehalten wurde, entfernen Sie das Gel vorsichtig von der Kassette.
- Legen Sie das Gel in eine saubere Box mit einer Lösung von 50 ml 1x TBE Puffer mit 50 l Nukleinsäure-Gel-Färbung und inkubieren Sie für 5 min auf einem Rocker, um die RNA zu färben.
- Nehmen Sie ein Vor- und Nachbandexzessbild des Gels auf dem Gel-Bildgebungssystem, vorzugsweise mit blauem Licht anstelle von UV-Transillumination.
- Verbrauchen Sie jedes Zinsband mit einer nukleasefreien Einweg-Gelschneidespitze. Nach jedem Brunnen die Spitze mit der Gelscheibe in ein 1,5 ml-Rohr geben und kurz drehen, um die Gelscheibe zu sammeln. Wiederholen Sie dies, bis alle Bänder in derselben 1,5 ml-Röhre gesammelt wurden.
- Nachdem alle Gelscheiben gesammelt wurden, fügen Sie dem 1,5 ml-Rohr 100 l nukleasefreies Wasser oder TE-Puffer hinzu. Bei 4 °C für 48 h lagern. Dadurch kann die RNA die Gelscheiben in die Lösung verlassen.
- Nach 48 h das Wasser oder den TE-Puffer in ein frisches 1,5 ml-Rohr pfeifen. Entsorgen Sie die restlichen Gelscheiben. Reinigen Sie die RNA wie folgt über das Clean-up-Kit.
- Die Spinsäule bei Raumtemperatur mindestens 30 min ausdemieren.
- Zu den 100 l RNA-Lösung in der neuen 1,5 ml-Röhre ab Schritt 1,32 350 l RLT-Puffer hinzufügen und 2 min auf einem Nutator gut mischen. Drehen Sie für 1 s bei 200 x g, um Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
- Fügen Sie 675 l von 100% EtOH hinzu und mischen Sie gut für 2 min auf dem Nutator. Drehen Sie 1 s bei 200 x g und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- 565 l des Gemischs auf die Spinsäule übertragen und 1 min bei 15.000 x gdrehen. Leeren Sie das Sammelrohr durch Aspiration.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit der zweiten Hälfte der Stichprobe.
- Fügen Sie der Spalte 500 l RPE-Puffer hinzu und drehen Sie 1 min bei 15.000 x g. Leeren Sie das Sammelrohr durch Aspiration.
- 750 l 80% Ethanol in die Säule geben und 1 min bei 15.000 x gdrehen. Leeren Sie das Sammelrohr durch Aspiration.
- Legen Sie die Säule in ein neues 2 ml Sammelrohr mit geöffnetem Deckel und drehen Sie bei 15.000 x g für 5 min.
- Übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5 ml Rohr.
- Fügen Sie 17 l Wasser in der Mitte der Säule hinzu und drehen Sie bei 15.000 x g für 1 min zu elute. Elute wieder mit einem weiteren 17 l Wasser. Das gesamte wiedergewonnene Volumen sollte 32 l betragen.
- Mischen Sie gut durch Wirbeln, Pipetten 1,5 l und messen Sie die Konzentration der RNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
- Überprüfen Sie die Qualität der RNA-Reinigung durch Harnstoff-Denaturierung von Polyacrylamid-Gel wie in den Schritten 1.11-1.29.
2. In-vitro-RNA-Methyltransferase-Assay
- Richten Sie den 100-L-RNA-Methyltransferase-Assay in einem 1,5 ml-Röhrchen auf Eis wie folgt ein: 23 l Wasser, 10 l 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 l 0,05 m EDTA, 5 l 100 mM DTT , 40 l von 50 % Glycerin, 4 l von 58 °C 3H-SAM, 5 l 20x Protease-Inhibitor-Cocktail, 1 l RNaseOUT (optional), 5 l RNA und 5 l Methyltransferase.
VORSICHT: Radioaktives tritiiertes Material ist gefährlich und sollte nur mit Handschuhen, laboriertem Mantel und anderen notwendigen PSA behandelt werden. Alle Pipettenspitzen und Rohre, die mit radioaktivem Material in Berührung kommen, gelten als fester radioaktiver Abfall. Entsorgen Sie alle festen und flüssigen radioaktiven Abfälle gemäß dem vom Labor genehmigten Protokoll für radioaktive Abfälle.
HINWEIS: Kontrollproben ohne Methyltransferase und ohne RNA einschließen. Die Reagenzienkonzentrationen können eine Optimierung und/oder Einbeziehung von divalenten Kationssalzen wie MgCl2 oder unbeschrifteten SAM erfordern. Der optimale Bereich der endgültigen RNA-Konzentration liegt zwischen 50 nM und 1 m, während die Methyltransferase-Konzentration zwischen 25 nM und 300 nM liegt. - Mischen Sie gründlich, indem Sie das Rohr sanft wirbeln. Drehen Sie 5 s bei 200 x g, um die Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C für 2 h.
- Bereinigen Sie die Reaktion mit der Säulenreinigung wie in Schritt 1.32.
VORSICHT: Achten Sie sehr darauf, radioaktive Materialien ordnungsgemäß zu entsorgen, insbesondere während der Säulenwaschungen (Pipette aus, anstatt Abfälle aus Sammelrohren zu ankleben). - Flüssigkeitsszintillationsanzahl durchführen
- Richten Sie das Szintillations-Zähl-Rack mit einer Durchstechflasche pro Probe, einer Durchstechflasche für die Hintergrundmessung und einer Durchstechflasche für den Wischtest ein. Füllen Sie die Durchstechflaschen mit 5 ml Szintillationszähllösung.
- Fügen Sie 10 l jeder eluierten radioaktiven RNA-Probe in 1 Durchstechflasche hinzu, und ziehen Sie den Deckel fest und mischen Sie sanft.
- Bereiten Sie die Wischtest-Durchstechflaschen vor. Reiben Sie Wattestäbchen gründlich auf alle Oberflächen und Geräte, die während des Protokolls verwendet werden. Fügen Sie Tupfer zu den Fläschchen mit 5 ml Szintillationslösung gefüllt und ziehen Sie den Deckel.
- Führen Sie die Samples auf dem Szintillationszähler wie folgt aus. Öffnen Sie die Gegenhaube, stecken Sie das Rack in die Maschine und schließen Sie die Haube. Wählen Sie Count Single Rack. Wählen Sie Benutzerprogramm auswählen. Wählen oder erstellen Sie ein Programm, das Tritium (3H) für 60 s misst. Hit Count Rack. Wiederholen Sie die Szintillationsanzahl dreimal.
HINWEIS: Das Gerät misst die Szintillationsanzahl jeder Probe und Ausgabe sowohl auf dem Bildschirm als auch auf einem Ausdruck. Das Protokoll kann hier auf Wunsch angehalten werden. Verbleibende RNA-Proben aus Schritt 2.3 sollten zur späteren Verwendung bei -80 °C eingefroren werden.
- Fahren Sie mit dem Autoradiogramm fort
- Prägebereitung und vorgeführte Harnstoff-Denaturierung Polyacrylamid-Gel wie in den Schritten 1.11-1.20.
- Pipetten 20 l radioaktives RNA-Material in ein neues 1,5 ml-Rohr mit 20 l 2x Gel-Ladepuffer. Gut mischen. Bereiten Sie die Leiter wie in Schritt 1.21 vor. Inkubieren Sie die Proben bei 70 °C für 15 min.
- Waschen Sie die Brunnen des Gels unmittelbar vor dem Probenladen noch einmal. Laden Sie 20 l der vorbereiteten Leiter, 20 l der Proben und 20 l 1x Gel-Ladepuffer auf die verbleibenden Bahnen. Führen Sie das Gel bei 100 V für 60-180 min, abhängig von Polyacrylamid-Prozentsatz.
- Sobald das Gel mit dem Lauf abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gel aus der Kassette und legen Sie es in eine Box mit 50 ml 1x TBE-Puffer mit 5 l ultraempfindlichem Nukleinsäure-Gel-Färbung.
- Inkubieren Sie für 5 min auf dem Rocker, um die RNA zu färben.
- Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Box und legen Sie es auf den UV-Transilluminator des Gel-Bildgebungssystems mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der linken Seite.
- Fokussieren Sie die Kamera auf das Gel, schalten Sie das UV-Licht ein und nehmen Sie dann ein Bild des Gels auf, indem Sie je nach Signalintensität 50 ms bis 1 s freisetzen.
- Deaktivieren Sie die UV-Bestrahlung, und speichern Sie das Bild als Tiff-Datei.
- Legen Sie das Gel wieder in die Box. Entfernen TBE. Fixieren Sie das Gel mit 50 ml Befestigungslösung (50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% reines Reinstwasser) für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe.
- Bewegen Sie das Gel vorsichtig wieder in eine frische Blackbox mit 25 ml der Autoradiographie-Verbesserungslösung. In Ermangelung einer Blackbox, decken Sie die Box mit Aluminiumfolie, um die Lösung vor Licht zu schützen.
- 30 min bei Raumtemperatur auf der Wippe inkubieren.
- Heben Sie das Gel vorsichtig an und legen Sie es mit den Brunnen nach oben und der Leiter auf der rechten Seite nach unten auf eine Plastikfolie. Legen Sie zwei Blätter Chromatographiepapier auf die Rückseite des Gels. Drehen Sie vorsichtig den gesamten Stapel.
- Den Geltrockner auf 80 °C vorheizen. Bewegen Sie die Kunststoffabdeckung auf dem Geltrockner zurück. Legen Sie Wrap, Gel und Chromatographie Papier stapeln unter der Kunststoffabdeckung und bewegen Sie die Kunststoffabdeckung wieder nach unten, um eine Dichtung zu schaffen.
- 1 h bei 80 °C im Geltrockner trocknen.
- Schalten Sie den Geltrockner aus und entfernen Sie den Stapel vorsichtig. Entfernen Sie das Wickel- und zweites Chromatographiepapier. Klebepapier mit dem getrockneten Gel in einer Autoradiogrammkassette.
- Fügen Sie 1 Blatt Autoradiographie-Film im dunklen Raum hinzu.
- Stellen Sie die Kassette bei -80 °C auf und entwickeln Sie den Film nach 1 h bis 4 Wochen, abhängig von der Signalintensität, die anhand der zuvor gemessenen Szintillationszahlen beurteilt werden kann: 1-4 Wochen für 250-1.000 cpm, 24 h bis 1 Woche für 1.000-10.000 cpm und 1 h bis 24 h für >10.000 cp m.
- Sobald der Film entwickelt ist, legen Sie den Film auf die Kassette und markieren Sie vorsichtig mit einem Labormarker die 4 Kanten des Gels, jeden Brunnen, und die Position der XC- und BB-Farbstoffe.
- Scannen Sie den Film mit einer Auflösung von 300 oder 600 Pixeln pro Zoll und speichern Sie das Bild als Tiff-Datei.
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Representative Results
In-vitro-Transkriptionsreaktion
Abbildung 2 A stellt einen typischen Lauf einer In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der T7-RNA-Polymerase der 7SK snRNA dar, die eine relativ kurze (331 nt) und hochstrukturierte RNA ist. Wie auf diesem Rohbild gezeigt, gibt es mehrere unerwünschte Bänder, sowohl kürzer als auch länger als 7SK, wahrscheinlich als Ergebnis zufälliger transkriptionsiellen Initiierungs- oder Beendigungsereignisse. Aus diesem Grund ist die Gelreinigung nach der In-vitro-Transkriptionsreaktion wichtig, um eine saubere RNA-Probe zu erhalten, wie in Abbildung 2Bdargestellt. An diesem Punkt kann die RNA von Interesse durch ihre Position relativ zur Leiter identifiziert und durch Gelreinigung gereinigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann es notwendig sein, die Länge der Transkriptionsreaktion vor dem Gelreinigungsschritt zu optimieren. Transkriptionsreaktionen, die zu lange dauern, können zu extrem hohen Mengen an RNA-Produktion führen, was die nachgelagerte Identifizierung des richtigen Transkripts erschwert. Es ist auch wichtig, die Identität des gereinigten Transkripts durch Reverse Transcription und quantitative PCR (RTqPCR) mit spezifischen Primern zu überprüfen.
In-vitro-RNA-Methyltransferase-Assay
Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Ergebnis eines im Protokoll beschriebenen RNA-Methyltransferase-Assays unter Verwendung der unteren Grenze unserer empfohlenen RNA- und Proteinkonzentrationen. Dieser Test ermöglicht sowohl quantitative Ergebnisse aus den Szintillationszahlen als auch qualitative Ergebnisse aus dem Autoradiogramm. Hier wurde gezeigt, dass MePCE, eine dem Methylat 7SK10bekannte RNA-Methyltransferase, auch U6 methylieren kann. Darüber hinaus hemmt, wie kürzlich für 7SK16gezeigt, die Bindung von Histon H4 an MePCE auch die U6-Methylierung. Wir konnten dies sowohl in der Szintillationszahl (Abbildung 3C) als auch im Autoradiogramm (Abbildung 3B)beobachten, das die Robustheit dieses Protokolls zeigt.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung eines typischen RNA-Methyltransferase-Assay-Workflows und erwartete Ergebnisse. Sinefungin ist ein wettbewerbsfähiger Methyltransferase-Inhibitor. L: Leiter; WT: wilder Typ; M: katalytischer Mutant; cpm: zählt pro Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 . Repräsentatives Experiment, das das Produkt der In-vitro-Transkription vor (A) und nach (B) Reinigung an einem denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamid 8% Gel zeigt, das mit Nukleinsäurefleck gefärbt ist. Die Pfeile zeigen auf das 7SK-Transkript vor und nach der Gelreinigung. L: Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 . In-vitro-RNA-Methyltransferase-Assay mit MePCE gegen U6 durchgeführt. In-vitro-Methyltransferase-Assay mit rekombinanter GST-MePCE (25 nM), 3H-radioaktivem SAM als Methylgruppenspender und in vitro transkribierter U6-RNA (50 nM) als Substrat. Das Autoradiogramm wurde 2 Wochen lang freigelegt, um die Restaktivität (250 cpm) in der Probe +Histone H4 zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hierwird wird eine einfache und robuste Methode zur In-vitro-Verifizierung der RNA-Methyltransferase-Aktivität in Richtung spezifischer Transkripte berichtet. Der Test nutzt die Tatsache aus, dass S-Adenosylmethionin auf den Methylgruppenspender tritiiert werden kann (Abbildung 1), so dass die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern genau nachgewiesen werden kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieser Test nicht darauf hinweisen kann, welcher Rückstand oder welche chemische Gruppe durch das Enzym methyliert wird. Um zu identifizieren oder zu überprüfen, ob ein bestimmter Rückstand methyliert ist, können andere Methoden wie Mutationsanalyse, Reverse-Transkriptionsblock oder Massenspektrometrie-Analyse des RNA-Substrats in Verbindung mit dem RNA-Methyltransferase-Assay verwendet werden.
Die Wahl der RNAs und ihre Syntheseweise hängt von der Größe der RNA ab. Spezifische RNAs mit Größen zwischen 18 und 120 nt können bequem von vielen bekannten Nukleinsäureanbietern synthetisiert werden. Am häufigsten werden jedoch spezifische RNAs unterschiedlicher Größe in vitro transkribiert. Die DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription können auf verschiedene Weise erzeugt werden und erfordern, dass die Sequenz des Interesses nach einem T7- oder SP6-Promotor lokalisiert wird. Wenn genaue Enden von RNAs wichtig sind, wird das pRZ-Plasmidempfohlen 17. Die hohe Empfindlichkeit des Assays (Abbildung 3) ermöglicht es auch, eine gereinigte RNA durch eine Mischung aus zellulärer RNA zu ersetzen, entweder total oder Boten-RNAs zum Beispiel. Tatsächlich bieten das Gel und das Autoradiogramm eine Methode, um die Größe der rna(s) direkt zu beobachten, die für die Methylierung bestimmt ist.
Die hier in Schritt 2.1 des Protokolls gemeldeten Bedingungen sind optimal für die BIN3-Familie von Methyltransferasen, die zwei Homologe beim Menschen hat, MePCE10 und BCDIN3D9. Es ist wichtig zu betonen, dass die Assay-Bedingungen an das spezifische Protein und die RNA von Interesse angepasst werden müssen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von MgCl2 die BCDIN3D-Aktivität18verringert, mgCl2 jedoch ein wichtiger Koordinator der RNA-Struktur sein kann und somit einen wichtigen Bestandteil des Assays für andere RNA- Methyltransferasen.
Der Vorteil der Verwendung eines Autoradiogramms, das über einen längeren Zeitraum ausgesetzt werden kann, besteht darin, dass es sehr schwache Aktivitäten erkennen kann, die im Szintillationstest nicht erkannt werden. In der Regel deutet dies darauf hin, dass das Protein eine Methyltransferase ist, aber dass eine oder mehrere der Reaktionsbedingungen oder Reagenzien optimiert werden müssen: Enzym; Substrat, Cofaktor, Pufferbedingungen usw.9. Beispielsweise muss die Enzymreinigung möglicherweise verbessert werden, um die Position des Tags zu entfernen oder zu ändern. Es kann auch sein, dass die RNA, die als Substrat verwendet wird, richtig gefaltet werden muss oder mit einem anderen Protein oder RNA-Faktor interagieren muss, um durch das Enzym methyliert zu werden. Daher müssen bereits vorhandene Literatur und/oder eigene Ergebnisse in Zellen sorgfältig überprüft werden, um die Assay-Bedingungen für das Enzym und die RNA von Interesse einzurichten.
Der Test ist auch extrem flexibel. Zum Beispiel kann es ein Vorläuferschritt zu einer anderen Art von Assay sein, so dass die radioaktiv methylierte RNA in quantitativen und qualitativen Demethylase-Assays11oder in RNA-Bindungs-Assays verwendet wird, die es ermöglichen, das Verhalten der methylierte RNA im Vergleich zur unveränderten. Der Assay kann auch leicht angepasst werden, um die Modifikation von RNAs zu analysieren, die Coenzyme verwenden, die radioaktiv markiert werden können, wie Acetylcoenzym A für die Untersuchung der RNA-Acetylierung19,20.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Turja Kanti Debnath für seine Hilfe bei ChemDraw. Die Forschung im Xhemalé-Labor wird vom Department of Defense - Congressionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 und Start-up-Fonds des Institute of Cellular and Molecular Biology and the College of Natural Sciences at the University of Texas at Austin, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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