Summary
כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.
Abstract
ישנם יותר מ 100 שינויים כימיים ברורים של RNA, שני שלישים מהם מורכבים של מתיכי. עניין בשינויים RNA, ובעיקר מתיכי, התפתחה מחדש בשל התפקידים החשובים ששיחקו אנזימים הכותבים ומוחקים אותם בתהליכים ביולוגיים הרלוונטיים למחלות ולסרטן. כאן, רגיש בתוך שיטת החוץ הגופית לניתוח מדויק של פעילות כותב RNA מתילציה על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית RNAs מסופק. שיטת הפעולה משתמשת בצורה מלאכותית של S-אדנוסיל-מתיונין, וכתוצאה מכך תיוג ישיר של RNA מתיל עם טריציום. האנרגיה הנמוכה של קרינת טריטיום עושה את השיטה בטוחה, ושיטות הקיימות מראש של טריציום הגברה האות, לאפשר לכמת ולהמחיש את רנ א מתיליום ללא שימוש של נוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים. בעוד שיטה זו נכתבת עבור RNA מתילציה, מנופך מעטים לעשות את זה רלוונטי למחקר של שינויים אחרים RNA שיכול להיות מתויג רדיואקטיבית, כגון מרחרחון RNA עם 14C מרחלן מסוג A. בסך הכל, שיטת זה מאפשרת להעריך במהירות RNA מתילציה תנאים, עיכוב עם מעכבי מולקולה קטנה, או את ההשפעה של RNA או מוטציות אנזים, ומספק כלי רב עוצמה כדי לאמת ולהרחיב את התוצאות המתקבלות בתאים.
Introduction
DNA, RNA ו חלבונים כפופים שינויים כי בחוזקה לווסת ביטוי גנים1. בין השינויים הללו מתרחשים הbiopolymers בכל שלוש הפעמים. . בשלושת העשורים האחרונים לעומת זאת, העניין ב-RNA מתילציה הוצת רק לאחרונה לאור התפקידים החשובים שחלבונים הכותבים, מוחקים או מאגד את מחלות ה-RNA של המשחק בפיתוח ובמחלות2. בנוסף לפונקציות ידועות יותר בריבוזומיום שופע והעברת rnas, RNA מתילציה מסלולים להסדיר שליח ספציפי RNA יציבות3,4, החדרת5 ותרגום6,7, מירנה עיבוד8,9 ו הפסקה ושחרור10,11.
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מתיליראז ' פעילות בהגדרה של מעבדת ביולוגיה מולקולרית מדווחת (מסוכם באיור 1). מחקרים רבים להעריך את הפעילות של RNA מmethyltransferase באמצעות נקודה בכתם עם נוגדן נגד RNA שינוי של עניין. עם זאת, נקודה בכתם אינו מאמת את היושרה של RNA על הדגירה עם ה-RNA מmethyltransferase. זה חשוב כי אפילו זהום קטין של חלבונים רקומביננטי עם נוקלאוסים יכול להוביל חלקי RNA השפלה ותוצאות מייסדים. יתר על כן, אפילו מאוד ספציפי שינוי RNA נוגדנים יכול לזהות RNAs שאינם מוגדרים עם רצפים או מבנים ספציפיים. ה-RNA מתיל מתילאז שדווח כאן מנצל את העובדה כי מתיונין S-אדנוסיל יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילמת להיות מזוהה במדויק ללא שימוש בנוגדנים . הוראות מסופקות לתמלול ולטיהור של תעתיק של עניין ובדיקות של מתילציה של התמליל האמור על ידי אנזים הריבית. שיטה זו גמישה ואיתנה, וניתן להתאימו בהתאם לצרכיו של כל פרוייקט נתון. לדוגמה, בתוך מבחנה ומטוהרים RNAs, מסונתז כימית RNAs, אבל גם RNAs הסלולר ניתן להשתמש. הדבר מספק מידע כמותי בצורה של ספירות שניות, כמו גם מידע איכותני על-ידי הצגת היכן בדיוק ה-RNA המתיל פועל על ג'ל. זה יכול לספק תובנה ייחודית לתפקוד של RNA מmethyltransferase, במיוחד בעת שימוש RNAs הסלולר כמו מצע, כפי שהוא מספק שיטה ישירות להתבונן בגודל של RNA או RNAs כי הם מיועדים מתילציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בתמלול והפריה חוץ גופית של ה-RNA של היעד
- שיבוט רצף העניין לפלמידים המכילים T7 ו/או SP6 באמצעות שכפול מולקולרי של טכניקות12 או ערכות.
- שורה על תבנית הדי. אנ. איי. לתמלול שעתוק מחוץ לחומרים
- להגביר את רצף העניין על ידי ה-PCR של הפלביניים עם התחל שנועד לכלול את אזור המקדם T7 באמצעות הכנס, + 20-30 bp במעלה הזרם כפי שתוארה בעבר13.
- לחילופין, לעכל 5 μg של הפלבאמצע באמצעות אנזים הגבלה (RE) לחתוך באתר להיות זמין במורד הכנס על פי ההוראות שסופקו על ידי הספק של RE.
הערה: זכור לבדוק כפול שההוספה אינה נחתכת על-ידי RE הנבחר. בחירת הRE המשמשת בשלב זה עלולה להשפיע באופן דרמטי על התשואה של התמליל. מעדיפים, לשנות עם בוטה או 5 '-overhanging לייצר RE כדי למנוע מיתוג תבנית של T7 RNA פולימראז על ההיפך ה-DNA סטרנד14. נסה שונה RE אם התשואות הראשוניות אינן מספיקות.
- לטהר את ה-DNA שנוצר באמצעות הערכה של הפקת ג. א. נ. ג. ג'ל וניקיון. . בדיקת דנ א עם 30 μL של מים
- מערבבים היטב על ידי vortexing, pipet 1.5 μL ולמדוד ריכוז DNA עם ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.
- השתמש 250 ng של ה-DNA כדי לבדוק את האיכות והגודל של ה-DNA מטוהרים על 1% האגנה ג'ל אלקטרופורזה ב-1x מאגר TBE הועבר 1 h ב 4 V/cm.
- להפשיר את הראקטיבים הקפואים. של ערכת התמלול מניחים את T7 RNA פולימראז מיקס על קרח, והריאגנטים האחרים על הטמפרטורה בחדר. מיד לאחר הפשרה מלאה, לסובב מהר את צינורות rNTP עבור 5 s כדי לאסוף את הפתרון בחלק התחתון של צינורות ומקום על הקרח. לשמור על מאגר התגובה 10x בטמפרטורת החדר כדי למנוע משקעים.
- Pipet לתוך שפופרת 1.5 mL את הרכיבים הבאים של 20 μL תגובת שעתוק בטמפרטורת החדר לפי הסדר המצוין: 6 μL של מים, 2 μL (0.1-1 μg) של תבנית DNA לינארית, 2 μL של 75 mM הפתרון ATP, 2 μL של 75 mM פתרון GTP , 2 μL של 75 mM הפתרון CTP, 2 μL של 75 mM פתרון UTP, 2 μL של מאגר התגובה 10x ו 2 μL של T7 RNA פולימראז מיקס.
הערה: עבור תבנית DNA שנוצר על ידי ה-PCR, השתמש 100-200 ng DNA; עבור תבנית DNA שנוצר על ידי תקציר אנזים הגבלה של פלבאמצע, להשתמש ~ 1 μg. Active רקומביננטי שלו6-מתויג T7 RNA פולימראז ניתן לטהר ב -E. coli15. - ערבב את הצינורית ביסודיות. ספין מהיר עבור 5 s כדי לאסוף פתרון התגובה בתחתית הצינור, ולאחר מכן הדגירה ב 37 ° c עבור 2-4 h.
הערה: כל תעתיק יתנהג בצורה שונה בהתאם לתבנית ה-DNA, אורכו, הרצף או המבנה שלו. למטב את התנאים שעתוק מחוץ לגופית על ידי בדיקות הדגירה שונים עד 6 h; ריכוזים שונים של תבנית DNA, T7 RNA פולימראז, או NTP; או תוספת MgCl משלימים2 למה שקיים T7 RNA פולימראז מיקס. - בסוף תקופת הדגירה, להוסיף 1 μL של DNase I לבין 20 μL תגובה ו דגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות.
הערה: ניתן לשמור את תגובת התמלול באופן זמני על הקרח עד שהפוליאקרילמיד ג'ל מוכן. - המשך בטיהור ע י פוליאקרילאמיד ג'ל.
הערה: מאז RNA רגיש ל-pH ו-RNase זיהום, להשתמש בציוד ייעודי RNA RNase-ריאגנטים חינם. - קבע את אחוז פוליאקרילאמיד עבור הג בהתאם לגודל תעתיק הריבית: 3.5% עבור 100-2000 nt (XC: 460 nt; BB: 100 nt), 5% עבור 80-500 nt (XC: 260 nt; BB: 65 nt), 8% עבור 60-400 nt (XC: 160 nt; BB: 45 nt), 12% עבור 40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% עבור 25-150 nt (XC: 60 nt; BB: 15 nt) ו-20% עבור 6-100 nt (XC: 45 nt; BB: 12 nt).
- הכינו את האוריאה דנאקריל ג'ל פוליאקרילי על ידי שילוב הריאגנטים הבאים ב 50 מ"ל שפופרת חרוט: 9.6 g של שתנן כיתה מולקולרית, 2 מ ל 10x TBE, x mL של 40% אקרילאמיד: bis-אקרילאמיד מיקס (29:1) ומים עד לסימון 20 מ ל בשפופרת , כאשר x = 20 מ ל/(40%/gel אחוז%).
אזהרה: ג'ל פוליאקרילמיד מכיל לעתים קרובות אקרילאמיד שהוא חומר רעיל שיכול ליצור סיכון כאשר הוא מוצג לסביבה. היפטר מג פוליאקרילאמיד דרך תוכנית הפסולת הכימית של המוסד. - . מיקרוגל ל-15% בעוצמה של 30 אחוז מקום על הנוטור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר או עד אוריאה התפרקה לחלוטין.
- בעוד תערובת ג'ל מסתובבת, לאחזר קלטת ג'ל (18-ובכן, 1 מ"מ עובי; 13.3 x 8.7 ס"מ (W x L)), להסיר את המסרק ולמקם את הקלטת עבור הליהוק ג'ל.
- מהיר לסובב את שפופרת 50 mL עבור 5 s כדי לאסוף פתרון ג'ל בתחתית הצינור. הוסף 125 μL של 10% אמוניום (APS). מניחים על הנוטור במשך ~ 1 דקות. סיבוב מהיר שוב עבור 5 s.
- הוסף 25 μL של טטרהמתיונין (TEMED) ובזהירות לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 פעמים עם צינורות 25 מ ל הימנעות בועות.
- פיפטה לתוך ג'ל יצוק בזהירות להכניס את המסרק ג'ל הימנעות בועות.
- הדק את החותם על-ידי הוספת אטב אוגדן גדול מעל לחלק העליון של הקלטת.
- . הניחו לג לפולימו במשך 1 שעות
- , ברגע שהג התחזק. הסר את אטב האוגדן הכנס את הקלטת לתוך תיבת האלקטרופורזה. הוסף מאגר 1x TBE לתוך המאגרים העליונים והתחתונים.
- . אחזר תגובת שעתוק להוסיף מים עד 100 μL, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של מאגר טעינה 2x ג'ל. להכין את הסולם על ידי ערבוב את הסכום המומלץ עם מים עד 10 μL ו 10 μL של מאגר טעינה של 2x ג'ל לצינור נפרד 1.5 mL.
- מודטה הן את הסולם והן את התגובה שעתוק מבחנה בthermomixer ב 70 ° c עבור 15 דקות.
- בעוד הדגימות הן מP1000 ° c, 70 בזהירות להסיר את המסרק, לנקות את הבארות על ידי ליטוף למעלה ולמטה כל טוב עם tte, ומיד לרוץ מראש עבור 10 דקות ב 100 V.
- ברגע שהדגימות השלימו את ה -15 דקות שלהם ב-70 ° c, הסירו את הצינורות מthermomixer ומייד על הקרח.
- נקה כל באר של הג שוב עם הפיפטה P1000. טען 20 μL של הסולם על הבאר הראשונה שמאלה, 20 μL של המדגם RNA על 10 בארות נפרדות, ו 20 μL של מאגר טעינה של 1x ג'ל על בארות בלתי מנוצל.
- הפעל את ג'ל ב 100 V עבור 60-240 דקות, בהתאם ל-% אלקטרופורזה של ג'ל.
הערה: הצבעים במאגר ההעמסה של ג'ל יפרידו לשתי להקות כאשר הם החוצה את הג, ברואופנול כחול מעביר איטי (BB) להקה כחולה, וכן מגירה מהירה Xylene Cyanol (XC) ציאן להקה. הגירה משוער של להקות אלה ב% אלקטרופורזה ג'ל מוכר היטב (ראה שלב 1.11) והוא יכול לשמש כדי להעריך את הגירה של RNA ב ג'ל. - לאחר שהג הופסק, הסר בזהירות את הג מתוך הקלטת.
- מניחים את הג בתיבה נקייה המכילה פתרון של 50 mL של 1 x TBE מאגר עם 50 μL של חומצה הגרעין ג'ל הכתם ו דגירה עבור 5 דקות על הנדנדה כדי להכתים את ה-RNA.
- קח לפני ואחרי הלהקה תמונת הכריתה של ג'ל על מערכת הדמיה ג'ל, רצוי להשתמש באור כחול במקום בתאורת UV.
- בלו כל להקה של עניין בעזרת nuclease-בחינם ג'ל חד פעמי חיתוך. לאחר כל הטוב, להעביר את הקצה המכיל את הפרוסה ג'ל לצינור 1.5 mL ובקצרה ספין לאסוף את הפרוסה ג'ל. חזור על הפעולה עד שכל הלהקות ייאספו באותו צינור 1.5 mL.
- לאחר כל פרוסות ג'ל נאספו, להוסיף 100 μL של nuclease-מים חינם או מאגר TE לצינור 1.5 mL. חנות ב-4 ° c עבור ~ 48 h. הדבר מאפשר ל-RNA לצאת מפרוסות ג'ל לתוך התמיסה.
- לאחר 48 h, ללטף את המים או מאגר TE לצינור חדש 1.5 mL. היפטר מפרוסות הג'ל הנותרות. לטהר את ה-RNA באמצעות ערכת הניקוי כדלקמן.
- באופן מתכלה את עמודת הספין בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.
- כדי ל100 μL של פתרון RNA בצינור החדש 1.5 mL משלב 1.32, להוסיף 350 μL של מאגר RLT ולערבב היטב עבור 2 דקות על הנטור. ספין עבור 1 s ב 200 x g כדי לאסוף את הפתרון בתחתית השפופרת.
- הוסף 675 μL של 100% אטוח וערבב היטב עבור 2 דקות על הנטור. ספין עבור 1 s ב 200 x g ומיד להמשיך לשלב הבא.
- העבר 565 μL של התערובת על העמודה ספין וספין עבור 1 דקות ב 15,000 x g. רוקן את צינור הגבייה על-ידי השאיפה.
- חזור על השלב הקודם עם המחצית השניה של המדגם.
- הוסף 500 μL של מאגר RPE לעמודה וספין עבור 1 דקות ב-15,000 x g. רוקן את צינור הגבייה על-ידי השאיפה.
- הוסף 750 μL של 80% אתנול לעמודה ו ספין עבור 1 דקות ב 15,000 x g. רוקן את צינור הגבייה על-ידי השאיפה.
- מניחים את העמודה בצינור חדש 2 mL של אוסף עם המכסה פתוח ספין ב 15,000 x g עבור 5 דקות.
- העבר את העמודה לצינור 1.5 mL חדש.
- הוסף 17 μL של מים על מרכז העמודה וספין ב 15,000 x g עבור 1 דקות עד elute. שוב שימוש בעוד 17 μL של מים. אמצעי האחסון המשוחזר הכולל צריך להיות 32 μL.
- מערבבים היטב על ידי vortexing, pipet 1.5 μL ולמדוד את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.
- בדוק את האיכות של טיהור ה-RNA על-ידי האוריאה הדאקרילאמיד ג'ל בשלבים 1.11-1.29.
2. בתוך מחוץ לשנת RNA מתילאז שיטת
- הגדרת 100 μL RNA מmethyltransferase בתוך שפופרת 1.5 mL על הקרח כדלקמן: 23 μL של מים, 10 μL של 10 x TBS (500 mM טריס-HCl, pH 7.5; 1.5 M הנאל), 2 μL של 0.05 M EDTA, 5 μL של 100 mM DTT , 40 μL של 50% גליצרול, 4 μL של 58 μM 3H-SAM, 5 μl של מעכבי הפרוטאז 20x, 1 Μl של RNaseOUT (אופציונלי), 5 ΜL של RNA ו-5 μl של מתילטרנספז.
התראה: חומר משולש רדיואקטיבי הוא מסוכן ויש לטפל בו רק כאשר לובשים כפפות, מעיל מעבדה וכל PPE נחוץ אחר. כל הפיפטה והצינורות במגע עם חומר רדיואקטיבי נחשבים לפסולת רדיואקטיבית מוצקה. היפטר מכל פסולת רדיואקטיבית מוצקה ונוזלית בהתאם לפרוטוקול הפסולת הרדיואקטיבית המאושרת במעבדה.
הערה: כלול דגימות בקרה ללא מתילאז ובלי RNA. ריכוזי האגריזם עשויים לדרוש אופטימיזציה ו/או הכללה של מלחי קטיון מדידים, כגון MgCl2, או SAM ללא תווית. הטווח האופטימלי של ריכוז RNA הסופי הוא מ 50 nM כדי 1 μM, בעוד ריכוז מתילאז הוא מ 25 ננומטר כדי 300 nM. - מערבבים ביסודיות על ידי העברת הצינור בעדינות. ספין 5 s ב 200 x g כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור. הרכבת מודטה את הצינורות ב 37 ° c עבור 2 h.
- נקה את התגובה באמצעות טיהור טור כמו בשלב 1.32.
התראה: להיות זהיר מאוד כדי להיפטר כראוי של כל החומרים הרדיואקטיביים, במיוחד במהלך שוטף הטור (פיפטה החוצה במקום לבזבז פסולת מצינורות איסוף). - ביצוע מספר הטעמים הנוזליים
- הגדר את ארון התקשורת לספירה עם בקבוקון אחד לכל מדגם, בקבוקון אחד למדידת רקע ובקבוקון אחד עבור מבחן הסחוב. ממלאים את הבקבוקונים ב-5 מ ל בתמיסה של ספירת הטעמים.
- הוסף 10 μL של כל אחד מדגימות ה-RNA הרדיואקטיבי לתוך בקבוקון אחד, והדקו את המכסה וערבבו בעדינות.
- . הכן את בדיקת המבחנות לשפשף ביסודיות משטחי כותנה על כל המשטחים והציוד המשמש במהלך הפרוטוקול. הוסיפו דגימות לבקבוקונים מלאות ב-5 מ ל של תמיסת שיבוץ והדקו את המכסה.
- הפעל את הדגימות על מונה הטעמים כדלקמן. פתח את מכסה המנוע, הכנס את המתלה לתוך המחשב וסגור את המכסה. בחר מונה ארון תקשורתבודד. בחר תוכניתמשתמש בחר . בחר או צור תוכנית המודד טריציום (3שעות) עבור 60 s.. מתקןהתנקשות חזור על הניקוד. שלוש פעמים
הערה: הציוד ימדוד את הספירה של כל מדגם ופלט למסך ולתדפיס. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן במידת הצורך. דגימות RNA שנותרו משלב 2.3 אמורות להיות קפואות ב-80 ° c לשימוש מאוחר יותר.
- המשיכו עם הautoradiogram
- היכון והפעל מראש אוריאה-שתנן באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד כמו בשלבים 1.11-1.20.
- פיפטה 20 μL של חומר רנ א רדיואקטיבי לתוך צינור חדש 1.5 mL המכיל 20 μL של מאגר הטעינה 2x ג'ל. . תערבב היטב . הכן את הסולם כמו בשלב 1.21 מודקון את הדגימות ב 70 ° c עבור 15 דקות.
- לשטוף את הבארות של הג פעם נוספת מיד לפני טעינת המדגם. טען 20 μL של הסולם המוכן, 20 μL של הדגימות, ו -20 μL של מאגר טעינה של 1x ג'ל על הנתיבים הנותרים. הפעל את הג ב-100 V עבור 60-180 דקות, בהתאם לאחוז אלקטרופורזה.
- לאחר הג מסיים לרוץ, להסיר את הג מתוך הקלטת ולמקם אותו בתיבה המכילה 50 mL של מאגר 1x TBE עם 5 μL של כתמי הגרעין הרגיש באולטרסאונד ג'ל.
- דגירה עבור 5 דקות על הנדנדה כדי להכתים את ה-RNA.
- בזהירות להוציא את הג מהקופסה ולמקם אותו על המשגר UV של מערכת הדמיה ג'ל עם הבארות למעלה ואת הסולם בצד שמאל.
- למקד את המצלמה על ג'ל, להדליק את אור UV ולאחר מכן לקחת תמונה של הג על ידי חשיפת מ 50 ms ל 1 s בהתאם לעוצמת האות.
- כבו את החשיפה לקרני UV, ושמרו תמונה כקובץ Tiff.
- . הניחו את הג בחזרה לקופסה הסר את הקובץ TBE. תקן את ג'ל עם 50 mL של תיקון פתרון (50% מתנול, 10% חומצה אצטית, 40% אולטרה טהור מים) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
- הזיזו בעדינות את הג שוב לקופסה שחורה טרייה המכילה 25 מ ל של פתרון האדיגרפיה האוטומטית. בהעדר קופסה שחורה, לכסות את התיבה עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הפתרון מפני אור.
- דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
- הרימו בעדינות את הג והניחו אותו בפנים כלפי מטה על סדין של ניילון נצמד עם הבארות למעלה והסולם בצד ימין. הניחו שני גיליונות של נייר כרומטוגרפיה על גב הג. הפוך בעדינות את הערימה כולה.
- מחממים את מייבש הג עד 80 ° c. הזיזו את המכסה הפלסטי על מייבש הג. הכנס לעטוף, ג'ל ומחסנית נייר כרומטוגרפיה מתחת למכסה פלסטיק ולהעביר את עטיפת פלסטיק בחזרה למטה כדי ליצור חותם.
- יבשים 1 h ב 80 מעלות צלזיוס במייבש ג'ל.
- כבו את מייבש הג והסירו בעדינות את המחסנית. הסר את נייר הכרומטוגרפיה והעטיפה השני. הקלטת את הנייר כרומטוגרפיה שנותר עם הג היבש בקסטה autoradiogram.
- הוסף גיליון 1 של סרט האדיגרפיה האוטומטי בחדר החשוך.
- מניחים את הקלטת ב-80 ° c ולפתח את הסרט לאחר 1 h כדי 4 שבועות בהתאם לעוצמת האות, אשר ניתן להישפט על בסיס הספירות בעבר נמדד שנמדדו: 1-4 שבועות עבור 250-1000 cpm, 24 h עד 1 שבוע עבור 1000-10000 cpm ו 1 h כדי 24 h עבור > 10000 cp m.
- לאחר הסרט מפותח, למקם את הסרט על גבי הקלטת ולסמן בזהירות עם סמן מעבדה 4 הקצוות של ג'ל, כל טוב, ואת המיקום של ה-XC ו-BB צבע.
- סרוק את הסרט ב 300 או 600 פיקסלים לרזולוציה אינץ ' ולשמור את התמונה כמו קובץ Tiff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תגובת שעתוק מחוץ לגופית
איור 2 A מייצגת הפעלה טיפוסית מתוך תגובת שעתוק מבחנה עם T7 RNA פולימראז של 7Sk snrna, שהוא קצר יחסית (331 nt) ו-RNA מובנה מאוד. כפי שמוצג על התמונה הגולמית, ישנן מספר להקות לא רצויות, הן קצרות יותר ויותר מ-7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירוע חניכה או הפסקת אירועים אקראיים. בגלל זה, ג'ל טיהור לאחר התגובה בתמלול החוץ חשוב לקבל מדגם RNA נקי כמו המוצג באיור 2ב. בשלב זה, ה-RNA של העניין יכול להיות מזוהה על ידי מיקומו יחסית לסולם ומטוהרים על ידי ג'ל טיהור.
כפי שהוזכר קודם לכן, ייתכן שיהיה צורך למטב את אורך תגובת התמלול לפני שלב הטיהור ג'ל. תגובות תמלול הפועלות במשך זמן רב מדי יכול לגרום כמויות גבוהות מאוד של ייצור RNA, מה שהופך זיהוי המטה של התמליל הנכון קשה. חשוב גם לאמת את זהותו של התעתיק הטהור על-ידי תמלול הפוכה ו-PCR כמותי (RTqPCR) באמצעות צבעי יסוד ספציפיים.
בשנת הפריה חוץ גופית RNA מתילאז שיטת
איור 3 מראה תוצאה של נציג rna מתילמוליאז שתוארה בפרוטוקול באמצעות הגבול התחתון של ה-rna וריכוזי החלבון המומלצים שלנו. היכולת הזאת מאפשרת גם תוצאות כמותית מהטעמים הללו, כמו גם תוצאות איכותיות מautoradiogram. כאן, MePCE, ה-RNA מתיל מתילאז ידוע מתיונין 7SK10, הוכח להיות מסוגל גם Methylate מאוחר. יתר על כן, כפי שמוצג לאחרונה עבור 7sk16, הכריכה של היסטון H4 כדי mepce גם מעכב U6 מתילציה. הצלחנו להתבונן בשתי הספרות (איור 3ג) ובautoradiogram (איור 3ב), המציגה את החוסן של פרוטוקול זה.
איור 1 . ייצוג סכמטי של שיטת ה-RNA האופיינית למתילאז והתוצאות הצפויות. Sinefungin היא מעכבי מתילאז תחרותי. L: סולם; WT: סוג פראי; M: מוטציה קטליטית; cpm: ספירות לדקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 . הניסוי המייצג מראה את המוצר של תמלול בלתי מתורבת לפני (א) ואחרי (ב) טיהור על הרפתקאות אוריאה-פוליאקרילאמיד 8% ג'ל מוכתם בכתם חומצת גרעין. החיצים מצביעים על התעתיק השביעי לפני ואחרי ג'ל טיהור. L: סולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 . בשנת הפריה חוץ גופית RNA מתיל-העברת היצע עם MePCE נגד U6. בתוך מתיל מתיל מתילאז באמצעות רקומביננטי gt-MePCE (25 ננומטר), 3H-רדיואקטיבי SAM כמו הקבוצה ממתיל התורם בחוץ מבחנה U6 RNA (50 nM) כמצע. הautoradiogram נחשף לשבועיים על מנת לאתר את הפעילות השיורית (250 cpm) במדגם + Histone H4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מmethyltransferase פעילות כלפי התעתיקים הספציפיים מדווחים. הצורך מנצל את העובדה כי S-אדנוסיל מתיונין יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילאז להיות מזוהה במדויק ללא שימוש של נוגדנים. עם זאת, חשוב לציין שאין אפשרות לציין איזה שאריות או קבוצה כימית ממתיכה על-ידי האנזים. כדי לזהות או לוודא כי שאריות ספציפיים הוא מתילזה, שיטות אחרות כגון ניתוח מועד, בלוק תמלול הפוכה או ניתוח ספקטרומטר המסה של המצע RNA ניתן להשתמש בשילוב עם הטיפול RNA מתילמיראז.
הבחירה של RNAs ומצב הסינתזה שלהם תלוי בגודל של ה-RNA. RNAs ספציפיים של גדלים בין 18 ו 120 nt יכול להיות בנוחות מותאם אישית-מסונתז מספקים רבים חומצות גרעין נחשב. עם זאת, ה-RNAs הנפוץ ביותר בגדלים שונים, משועתק מחוץ למבנה. תבניות ה-DNA עבור שעתוק מבחנה ניתן ליצור בדרכים שונות, ודורשים את רצף העניין להיות ממוקם במורד הזרם של T7 או מקדם SP6. כאשר קצוות מדויקים של RNAs הם חשובים, מומלץ pRZ פלמיד17. הרגישות הגבוהה של השיטת (איור 3) גם מאפשר להחליף rna מטוהרים עם תערובת של rna הסלולר, סה כ או שליח rnas למשל. אכן, ג'ל ו autoradiogram לספק שיטה ישירות להתבונן בגודל של RNA (s) מיועד מתילציה.
התנאים שדווחו כאן בשלב 2.1 של הפרוטוקול הם אופטימליים עבור משפחת BIN3 של מתילפיסים, אשר יש שני הומויומנים בבני אדם, MePCE10 ו BCDIN3D9. חשוב להדגיש כי יש לכוונן את תנאי הצריכה הניתנים להתאמה לחלבון הספציפי ולרנ א של הריבית. לדוגמה, זה הוכח כי הנוכחות של MgCl2 יורדת BCDIN3D פעילות18, עם זאת, mgcl2 יכול להיות מתאם חשוב של מבנה rna, ולכן יכול להיות מרכיב חשוב של השיטת ה-rna אחרים מתילסים.
היתרון של שימוש בautoradiogram, אשר ניתן לחשוף לפרק זמן ממושך, הוא שהוא יכול לאפשר לזהות פעילות חלשה מאוד שאינה מזוהה בתוך שיטת הניקוד. בדרך כלל זה מציין כי החלבון הוא מתילאז, אבל זה אחד או יותר של תנאי התגובה או ריאגנטים צריך להיות ממוטב: אנזים; מצע, קופקטור, תנאי מאגר, וכו '9. לדוגמה, ייתכן שיהיה צורך לשפר את טיהור האנזימים כדי להסיר או לשנות את מיקום התג. זה יכול להיות גם כי ה-RNA המשמש מצע צריך להיות מקופל כראוי או לקיים אינטראקציה עם חלבון אחר או גורם RNA להיות מתילזה על ידי האנזים. לפיכך, הספרות הקיימות ו/או תוצאות משלהם בתאים צריכים להיבדק בקפידה כדי להגדיר את תנאי הקיום של האנזים ו-RNA של עניין.
הדבר גם גמיש במיוחד. לדוגמה, זה יכול להיות צעד הקודמן לסוג אחר של התיתיתיות, כגון רנ א מתיל הרדיואקטיבי משמש כמותית ואיכותני מאמר11, או ב-rna binding בחני המאפשר להמחיש במפורש את התנהגות ה RNA מתילנטי לעומת האחד שלא שונו. התיקון יכול להיות גם מותאם בקלות כדי לנתח את השינוי של rnas כי השימוש באנזימים שיכולים להיות מתויג באופן אקטיבי, כגון מרחלי co A לחקר של RNA מרחלציה19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד ר טורג'ה קאנטי דבנאת על עזרתו בכמקולף. מחקר במעבדה xhemalçe הצ נתמך על ידי משרד הביטחון-Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי-סרטן השד פריצת דרך הפרס (W81XWH-16-1-0352), NIH גרנט R01 GM127802 והתחל כספים מהמכון לסלולר ו ביולוגיה מולקולרית והמכללה למדעי הטבע באוניברסיטת טקסס באוסטין, ארה ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
