Summary
Aquí, se describe un ensayo in vitro libre de anticuerpos para el análisis directo de la actividad de la metiltransferasa en ARN sintético o transcrito in vitro.
Abstract
Hay más de 100 modificaciones químicamente distintas del ARN, dos tercios de las cuales consisten en metilaciones. El interés por las modificaciones del ARN, y especialmente las metilaciones, ha resurgido debido a los importantes roles desempeñados por las enzimas que las escriben y borran en procesos biológicos relevantes para la enfermedad y el cáncer. Aquí, se proporciona un ensayo in vitro sensible para el análisis preciso de la actividad del escritor de metilación de ARN en ARN sintéticos o transcritos in vitro. Este ensayo utiliza una forma tritiada de S-adenosyl-metionina, lo que resulta en el etiquetado directo de ARN metilado con tritio. La baja energía de la radiación de tritio hace que el método sea seguro, y los métodos preexistentes de amplificación de la señal de tritio, permiten cuantificar y visualizar el ARN metilado sin el uso de anticuerpos, que son comúnmente propensos a los artefactos. Si bien este método está escrito para la metilación del ARN, pocos ajustes lo hacen aplicable al estudio de otras modificaciones de ARN que pueden ser etiquetadas radiactivamente, como la acetilación de ARN con 14C de coenzima A. En general, este ensayo permite evaluar rápidamente el ARN condiciones de metilación, inhibición con inhibidores de moléculas pequeñas, o el efecto de ARN o enzimas mutantes, y proporciona una poderosa herramienta para validar y expandir los resultados obtenidos en las células.
Introduction
El ADN, el ARN y las proteínas están sujetos a modificaciones que regulan estrechamente la expresión génica1. Entre estas modificaciones, las metilaciones se producen en los tres biopolímeros. El ADN y las metilaciones de proteínas han sido muy bien estudiados durante las últimas tres décadas. Por el contrario, el interés por la metilación del ARN se ha reinado recientemente a la luzde las importantes funciones que desempeñan las proteínas que escriben, borran o unen las metilaciones del ARN en el desarrollo y la enfermedad 2. Además de las funciones más conocidas en los abundantes ARN ribosomales y de transferencia, las vías de metilación del ARN regulan la estabilidad específica del ARN mensajero3,4, empalme5 y la traducción6,7, procesamiento de miRNA8,9 y pausa transcripcional y liberación10,11.
Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la met-fitransferasa de ARN en el entorno de un laboratorio de biología molecular (resumido en la Figura1). Muchos estudios evalúan la actividad de un ARN metiltransferasa a través de la mancha de puntos con un anticuerpo contra la modificación del interés del ARN. Sin embargo, el punto-blot no verifica la integridad del ARN al incubar con el ARN metiltransferasa. Esto es importante porque incluso pequeñas contaminaciones de proteínas recombinantes con nucleasas pueden conducir a la degradación parcial del ARN y resultados de confunción. Además, incluso los anticuerpos de modificación de ARN altamente específicos pueden reconocer ARN no modificados con secuencias o estructuras específicas. El ensayo de ARN metiltransferasa in vitro notificado aquí aprovecha el hecho de que la S-adenosyl metionina puede ser tritida en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos . Se proporcionan instrucciones para la transcripción in vitro y la purificación de una transcripción de interés y pruebas de la metilación de dicha transcripción por la enzima de interés. Este método es flexible y robusto, y se puede ajustar de acuerdo a las necesidades de cualquier proyecto dado. Por ejemplo, se pueden utilizar ARN transcritos y purificados in vitro, ARN sintetizados químicamente, pero también ARN celulares. Este ensayo proporciona información cuantitativa en forma de recuentos de centelleo, así como información cualitativa al mostrar dónde se ejecuta exactamente el ARN metilado en un gel. Esto puede proporcionar una visión única de la función de un ARN metiltransferasa, particularmente cuando se utiliza ARN celulares como sustrato, ya que proporciona un método para observar directamente el tamaño del ARN o ARN que están dirigidos a la metilación.
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Protocol
1. Transcripción in vitro y purificación en gel del ARN objetivo
- Clonar la secuencia de interés en plásmidos que contienen promotores T7 y/o SP6 utilizando técnicas de clonación molecular establecidas12 o kits.
- Linealización de la plantilla de ADN para transcripción in vitro
- Amplificar la secuencia de interés por PCR del plásmido con imprimaciones diseñadas para incluir la región promotora T7 a través de la plaquita, +20-30 bp aguas arriba y aguas abajo como se describió anteriormente13.
- Alternativamente, digerir 5 g del plásmido utilizando una enzima de restricción (RE) sitio de corte disponible aguas abajo de la plaquita de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor del RE.
NOTA: Recuerde comprobar que la plaquita no está cortada por el RE seleccionado. La selección del RE utilizado en este paso puede afectar dramáticamente el rendimiento de la transcripción. Preferentemente, linealice con un extremo contundente o de 5'-sobre-sobre produciendo RE para evitar el cambio de plantilla de la polimerasa de ARN T7 en la cadena de ADN opuesta14. Pruebe un RE diferente si los rendimientos iniciales son insuficientes.
- Purificar el ADN resultante usando el kit para la extracción y limpieza de gel de agarosa de ADN. Elugar el ADN con 30 l de agua.
- Mezcle bien mediante vórtice, pipetee 1,5 l y mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro de microvolúmenes.
- Utilice 250 ng de ADN para comprobar la calidad y el tamaño del ADN purificado en una electroforesis de gel de agarosa del 1% en 1 búfer TBE migrado durante 1 h a 4 V/cm.
- Descongelar los reactivos congelados del kit de transcripción in vitro. Coloque la mezcla de polimerasa de ARN T7 sobre hielo y los demás reactivos en un nutator a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la descongelación completa, gire rápidamente los tubos rNTP durante 5 s para recoger la solución en la parte inferior de los tubos y colocar sobre hielo. Mantenga el búfer de reacción 10x a temperatura ambiente para evitar precipitaciones.
- Pipet a un tubo de 1,5 ml los siguientes componentes de la reacción de transcripción de 20 l a temperatura ambiente en el orden indicado: 6 l de agua, 2 l (0,1 - 1 g) de plantilla de ADN lineal, 2 ml de solución ATP de 75 mM, 2 l de solución GTP de 75 mM , 2 ml de solución de CTP de 75 mM, 2 ml de solución UTP de 75 mM, 2 ml de búfer de reacción de 10x y 2 ml de mezcla de polimerasa de ARN T7.
NOTA: Para la plantilla de ADN generada por PCR, utilice ADN de 100 a 200 ng; para la plantilla de ADN generada por la enzima de restricción digestión de un plásmido, utilizar s1 g. Recombinante activo Su6-etiquetado T7 ARN Polymerase puede ser purificado en E. coli15. - Mezcle bien el tubo. Giro rápido durante 5 s para recoger la solución de reacción en la parte inferior del tubo, luego incubar a 37 oC durante 2-4 h.
NOTA: Cada transcripción se comportará de manera diferente dependiendo de la plantilla de ADN, su longitud, su secuencia o estructura. Optimizar las condiciones de transcripción in vitro probando diferentes tiempos de incubación hasta 6 h; diferentes concentraciones de plantilla de ADN, T7 RNA Polimerasa, o NTP; o la adición de MgCl2 suplementario a lo que está presente en la mezcla de polimerasa de ARN T7. - Al final del período de incubación, añadir 1 l de DNase I por reacción de 20 l e incubar a 37 oC durante 15 min.
NOTA: La reacción de transcripción se puede mantener temporalmente en hielo hasta que el gel de poliacrilamida esté listo. - Proceder con la purificación por gel de poliacrilamida.
NOTA: Dado que el ARN es sensible a la contaminación por pH y RNase, utilice equipos dedicados al ARN y reactivos libres de RNase. - Determinar el porcentaje de poliacrilamida para el gel dependiendo del tamaño de la transcripción de interés: 3,5% para 100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt), 5% para 80-500 nt (XC: 260 nt ; BB: 65 nt), 8% para 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% para 40-200 nt (XC: 70 nt ; BB: 20 nt), 15% para 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt), y 20% para 6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).
- Preparar el gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea combinando los siguientes reactivos en un tubo cónico de 50 ml: 9,6 g de urea de grado molecular, 2 ml de TBE 10x, x mL de 40% de mezcla de acrilamida:bis-acrilamida (29:1) y agua hasta la marca de 20 ml en el tubo , donde x-20 mL/(40%/porcentaje de gel %).
ADVERTENCIA: Los geles de poliacrilamida a menudo contienen acrilamida no polimerizada, que es un material tóxico que puede producir un peligro cuando se introduce en el medio ambiente. Deseche los geles de poliacrilamida a través del programa de residuos químicos de la institución. - Microondas para 15 s a 30% de potencia. Colocar sobre el nutator durante 10 minutos a temperatura ambiente o hasta que la urea se haya disuelto por completo.
- Mientras la mezcla de gel está girando, recupere un cassette de gel (18-bueno, 1 mm de espesor; 13.3 x 8.7 cm (W x L)), retire el peine y coloque el cassette para la fundición de gel.
- Gire rápidamente el tubo de 50 ml durante 5 s para recoger la solución de gel en la parte inferior del tubo. Añadir 125 ml de solución de persulfato de amonio al 10% (APS). Colocar en el nutator durante 1 min. Giro rápido de nuevo durante 5 s.
- Añadir 25 ml de tetrametiletilemetildiamina (TEMED) y mezclar cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 25 ml evitando burbujas.
- Pipetear en el gel fundido e insertar cuidadosamente el peine de gel evitando burbujas.
- Apriete el sello añadiendo un clip de aglutinante grande sobre la parte superior del cassette.
- Deje que el gel se polimerice durante 1 h.
- Una vez que el gel se haya solidificado, retire el clip aglutinante. Inserte el cassette en la caja de electroforesis. Agregue 1 búfer TBE en los depósitos superior e inferior.
- Recuperar la reacción de transcripción. Agregue agua de hasta 100 s, luego agregue 100 l de 2 x tampón de carga de gel. Prepare la escalera mezclando la cantidad recomendada con agua a 10 ml y 10 l de 2 x tampón de carga de gel a un tubo separado de 1,5 ml.
- Incubar tanto la escalera como la reacción de transcripción in vitro en el termomezclador a 70 oC durante 15 min.
- Mientras las muestras se están desnaturalizando a 70 oC, retire cuidadosamente el peine, limpie los pozos pipeteando cada poca con una pipeta P1000, e inmediatamente pre-ejecute durante 10 minutos a 100 V.
- Una vez que las muestras hayan completado su desnaturalización de 15 minutos a 70oC, retire los tubos del termomezclador e inmediatamente colóquelos sobre hielo.
- Limpie cada pocó del gel de nuevo con la pipeta P1000. Cargue 20 s de la escalera en el primer pozo a la izquierda, 20 l de la muestra de ARN en 10 pozos separados y 20 l de 1x tampón de carga de gel en los pozos no utilizados.
- Ejecutar el gel a 100 V durante 60 -240 min, dependiendo del % de poliacrilamida del gel.
NOTA: Los tintes en el búfer de carga de gel se separarán en dos bandas a medida que atraviesan el gel, una banda azul de bromofenol (BB) de migración lenta y una banda cian xyleno cianol (XC) de migración rápida. La migración aproximada de estas bandas en diferentes geles de % de poliacrilamida es bien conocida (ver paso 1.11) y se puede utilizar para estimar la migración de ARN en el gel. - Una vez que el gel se haya detenido, retire cuidadosamente el gel del cassette.
- Colocar el gel en una caja limpia que contenga una solución de 50 ml de 1x tampón TBE con 50 ml de mancha de gel de ácido nucleico e incubar durante 5 minutos en un balancín para manchar el ARN.
- Tome una imagen de escisión de la banda antes y después del gel en el sistema de imágenes de gel, preferiblemente usando luz azul en lugar de transiluminación UV.
- Consube cada banda de interés utilizando una punta de corte de gel desechable sin nucleasa. Después de cada pocto, transfiera la punta que contiene la rodaja de gel a un tubo de 1,5 ml y gire brevemente para recoger la rebanada de gel. Repita hasta que todas las bandas se hayan recogido en el mismo tubo de 1,5 ml.
- Una vez recogidas todas las rodajas de gel, añada 100 ml de agua libre de nucleasas o tampón te te al tubo de 1,5 ml. Conservar a 4oC durante 48 h. Esto permite que el ARN salga de las rodajas de gel en la solución.
- Después de 48 h, canalizar el agua o tampón TE a un tubo fresco de 1,5 ml. Deseche las rodajas de gel restantes. Purifique el ARN a través del kit de limpieza de la siguiente manera.
- Equilibrar la columna de espín a temperatura ambiente durante al menos 30 min.
- A la solución de 100 ml de ARN en el nuevo tubo de 1,5 ml del paso 1.32, agregue 350 ml de tampón RLT y mezcle bien durante 2 minutos en un nutator. Gire durante 1 s a 200 x g para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
- Añadir 675 s de 100% EtOH y mezclar bien durante 2 minutos en el nutator. Gire durante 1 s a 200 x g e inmediatamente proceda al siguiente paso.
- Transfiera 565 ml de la mezcla a la columna de centrifugado y gire durante 1 min a 15.000 x g. Vacíe el tubo de recogida por aspiración.
- Repita el paso anterior con la segunda mitad de la muestra.
- Agregue 500 l de búfer de RPE a la columna y gire durante 1 min a 15.000 x g. Vacíe el tubo de recogida por aspiración.
- Añadir 750 l de etanol al 80% a la columna y girar durante 1 min a 15.000 x g. Vacíe el tubo de recogida por aspiración.
- Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 2 ml con la tapa abierta y gire a 15.000 x g durante 5 min.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Añadir 17 l de agua en el centro de la columna y girar a 15.000 x g durante 1 min para eluir. Eluir de nuevo con otro 17 l de agua. El volumen total recuperado debe ser de 32 l.
- Mezcle bien mediante vórtice, pipetee 1,5 l y mida la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
- Compruebe la calidad de la purificación del ARN mediante gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea como en los pasos 1.11-1.29.
2. Ensayo de ARN metiltransferasa in vitro
- Configurar el ensayo de 100 ml de ARN metiltransferasa en un tubo de 1,5 ml sobre hielo de la siguiente manera: 23 l de agua, 10 ml de 10 x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 l de 0,05 M EDTA, 5 ml de TDT tDT de 100 mM, 2 ml de EDTA de 0,05 M, 5 ml de TDT TDT de 100 mM, TDTT d/TDT de 100 mM, 2 ml de EDTA de 0,05 M, 5 ml de TDT TDT de 100 mM, TDT DTT( , 40 l de 50% de glicerol, 4 l de 58 m 3H-SAM, 5 l de cóctel inhibidor de proteasa 20x, 1 l de RNaseOUT (opcional), 5 ml de ARN y 5 l de metiltransferasa.
ADVERTENCIA: El material tritiado radiactivo es peligroso y solo debe manipularse mientras se usan guantes, una capa de laboratorio y cualquier otro EPP necesario. Todas las puntas y tubos de pipeta en contacto con material radiactivo se consideran residuos radiactivos sólidos. Deseche todos los residuos radiactivos sólidos y líquidos de acuerdo con el protocolo de residuos radiactivos aprobado por el laboratorio.
NOTA: Incluya muestras de control sin la metiltransferasa y sin el ARN. Las concentraciones de reactivos pueden requerir optimización y/o inclusión de sales de cationes divalentes, como MgCl2, o SAM sin etiquetar. El rango óptimo de la concentración final de ARN es de 50 nM a 1 M, mientras que la concentración de metiltransferasa es de 25 nM a 300 nM. - Mezcle bien vórtice suavemente el tubo. Gire 5 s a 200 x g para recoger la solución en la parte inferior del tubo. Incubar el tubo(s) a 37oC durante 2 h.
- Limpie la reacción utilizando la purificación de columnas como en el paso 1.32.
ADVERTENCIA: Tenga mucho cuidado de eliminar adecuadamente cualquier material radiactivo, especialmente durante los lavados de columna (pipeta fuera en lugar de aspirar residuos de tubos de recogida). - Realizar recuento de centelleo líquido
- Configure el estante de recuento de centelleo con un vial por muestra, un vial para la medición de fondo y un vial para la prueba de deslizamiento. Llene los viales con 5 ml de solución de recuento de centelleo.
- Agregue 10 ml de cada muestra de ARN radiactivo eludado en 1 vial, y apriete la tapa y mezcle suavemente.
- Prepare los viales de prueba de deslizamiento. Frote completamente los hisopos de algodón en todas las superficies y equipos utilizados durante el protocolo. Agregue hisopos a los viales llenos con 5 ml de solución de centelleo y apriete la tapa.
- Ejecute las muestras en el contador de centelleo de la siguiente manera. Abra la campana del mostrador, inserte el bastidor en la máquina y cierre el capó. Seleccione Recuento de rack único . Seleccione Seleccionar programa de usuario . Seleccione o cree un programa que mida el tritio (3H) para 60 s. Hit Count Rack. Repita el recuento de centelleo tres veces.
NOTA: El equipo medirá el recuento de centelleo de cada muestra y la salida tanto a la pantalla como a una impresión. El protocolo se puede pausar aquí si se desea. Las muestras de ARN restantes del paso 2.3 deben congelarse a -80 oC para su uso posterior.
- Continúe con el autoradiograma
- Preparar y preejecutar gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea como en los pasos 1.11-1.20.
- Pipetear 20 l de material de ARN radiactivo en un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 20 ml de 2x de tampón de carga de gel. Mezcla bien. Prepare la escalera como en el paso 1.21. Incubar las muestras a 70oC durante 15 min.
- Lave los pozos del gel una vez más inmediatamente antes de la carga de la muestra. Cargar 20 l de la escalera preparada, 20 ml de las muestras y 20 l de 1 x tampón de carga de gel en los carriles restantes. Ejecutar el gel a 100 V durante 60-180 min, dependiendo del porcentaje de poliacrilamida.
- Una vez que el gel termine de funcionar, retire el gel del cassette y colóquelo en una caja que contenga 50 ml de 1 tampón TBE con 5 ml de mancha de gel de ácido nucleico ultrasensible.
- Incubar durante 5 minutos en el balancín para manchar el ARN.
- Saque cuidadosamente el gel de la caja y colóquelo en el transiluminador UV del sistema de imágenes de gel con los pozos hacia arriba y la escalera a la izquierda.
- Enfoque la cámara en el gel, encienda la luz UV y luego tome una imagen del gel exponiendo de 50 ms a 1 s dependiendo de la intensidad de la señal.
- Desactive la exposición UV y guarde la imagen como archivo Tiff.
- Vuelva a colocar el gel en la caja. Retire TBE. Fijar el gel con 50 ml de solución de fijación (50% metanol, 10% ácido acético, 40% agua ultrapura) durante 30 min a temperatura ambiente en un balancín.
- Mueva suavemente el gel de nuevo a una caja negra fresca que contenga 25 ml de la solución que mejora la autoradiografía. En ausencia de una caja negra, cubra la caja con papel de aluminio para proteger la solución de la luz.
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en el balancín.
- Levante suavemente el gel y colóquelo boca abajo en una lámina de plástico con los pozos hacia arriba y la escalera en el lado derecho. Coloque dos hojas de papel de cromatografía en la parte posterior del gel. Voltee suavemente toda la pila.
- Precalentar el secador de gel a 80oC. Vuelva a mover la cubierta de plástico de la secadora de gel. Inserte la pila de papel de envoltura, gel y cromatografía debajo de la cubierta de plástico y mueva la cubierta de plástico hacia abajo para crear un sello.
- Secar durante 1 h a 80oC en el secador de gel.
- Apague el secador de gel y retire suavemente la pila. Retire la envoltura y el segundo papel de cromatografía. Cinta restante papel cromatografía con el gel seco en un casete de autoradiograma.
- Añadir 1 hoja de película de autoradiografía en la sala oscura.
- Colocar el cassette a -80 oC y desarrollar la película después de 1 h a 4 semanas dependiendo de la intensidad de la señal, que se puede juzgar en función de los recuentos de centelleo previamente medidos: 1-4 semanas para 250-1,000 cpm, 24 h a 1 semana para 1,000-10,000 cpm y 1 h a 24 h para >10,000 cp M.
- Una vez desarrollada la película, coloque la película encima del cassette y marque cuidadosamente con un marcador de laboratorio los 4 bordes del gel, cada poca, y la posición de los colorantes XC y BB.
- Escanee la película a una resolución de 300 o 600 píxeles por pulgada y guarde la imagen como archivo Tiff.
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Representative Results
Reacción de transcripción in vitro
Figura 2 A representa una carrera típica de una reacción de transcripción in vitro con la polimerasa de ARN T7 del ARN 7SK, que es un ARN relativamente corto (331 nt) y altamente estructurado. Como se muestra en esa imagen sin procesar, hay varias bandas no deseadas, tanto más cortas como más largas que 7SK, probablemente resultantes de eventos de iniciación o terminación de transcripción aleatoria. Debido a esto, la purificación de gel después de la reacción de transcripción in vitro es importante para obtener una muestra de ARN limpia como se muestra en la Figura 2B. En este punto, el ARN de interés puede ser identificado por su ubicación en relación con la escalera y purificado por purificación de gel.
Como se mencionó anteriormente, puede ser necesario optimizar la duración de la reacción de transcripción antes del paso de purificación del gel. Las reacciones de transcripción que duran demasiado tiempo pueden dar lugar a cantidades extremadamente altas de producción de ARN, lo que dificulta la identificación posterior de la transcripción correcta. También es importante verificar la identidad de la transcripción purificada mediante la transcripción inversa y la PCR cuantitativa (RTqPCR) utilizando imprimaciones específicas.
Ensayo in vitro de ARN metiltransferasa
La Figura 3 muestra un resultado representativo de un ensayo de ARN metiltransferasa descrito en el protocolo utilizando el límite inferior de nuestras concentraciones recomendadas de ARN y proteínas. Este ensayo permite tanto los resultados cuantitativos de los recuentos de centelleo, como los resultados cualitativos del autoradiograma. Aquí, MePCE, un ARN metiltransferasa conocido por metilato 7SK10, se demostró que también es capaz de metilato U6. Por otra parte, como se ha demostrado recientemente para 7SK16, la unión de histona H4 a MePCE también inhibe la metilación U6. Pudimos observar esto tanto en el recuento de centelleo (Figura3C)como en el autoradiograma (Figura3B),mostrando la robustez de este protocolo.
Figura 1 . Representación esquemática de un flujo de trabajo típico de ensayo de ARN metiltransferasa y resultados esperados. Sinefungina es un inhibidor competitivo de la metiltransferasa. L: escalera; WT: tipo salvaje; M: mutante catalítico; cpm: recuentos por minuto Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Experimento representativo que muestra el producto de la transcripción in vitro antes de (A) y después de (B) purificación en un gel de urea-poliacrilamida 8% desnaturalizante teñido con mancha de ácido nucleico. Las flechas apuntan a la transcripción 7SK antes y después de la purificación del gel. L: escalera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Ensayo in vitro de ARN metil-transferasa realizado con MePCE contra U6. Ensayo in vitro de metiltransferasa utilizando GST-MePCE recombinante (25 nM), 3SAM H-radiactivo como donante del grupo metilo y ARN U6 transcrito in vitro (50 nM) como sustrato. El autoradiograma estuvo expuesto durante 2 semanas con el fin de detectar la actividad residual (250 cpm) en la muestra +Histone H4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la metiltransferasa de ARN hacia transcripciones específicas. El ensayo aprovecha el hecho de que S-adenosyl metionina puede ser trititada en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este ensayo no puede indicar qué residuo o grupo químico es metilado por la enzima. Para identificar o verificar que un residuo específico está metilado, se pueden utilizar otros métodos como el análisis mutacional, el bloqueo de transcripción inversa o el análisis de espectrometría de masas del sustrato de ARN junto con el ensayo de ARN metiltransferasa.
La elección de los ARN y su modo de síntesis depende del tamaño del ARN. ARN específicos de tamaños entre 18 y 120 nt pueden ser convenientemente sintetizados a medida de muchos proveedores de ácido nucleico de renombre. Sin embargo, lo más común es que los ARN específicos de varios tamaños se transcriben in vitro. Las plantillas de ADN para la transcripción in vitro se pueden generar de varias maneras, y requieren que la secuencia de interés se locale aguas abajo de un promotor T7 o SP6. Cuando los extremos precisos de los ARN son importantes, se recomienda el plásmido pRZ17. La alta sensibilidad del ensayo (Figura3) también permite sustituir un ARN purificado por una mezcla de ARN celular, ya sea ARN total o mensajero, por ejemplo. De hecho, el gel y el autoradiograma proporcionan un método para observar directamente el tamaño del ARN o ARN destinados a la metilación.
Las condiciones aquí indicadas en el paso 2.1 del protocolo son óptimas para la familia BIN3 de metiltransferasas,que tiene dos homólogos en humanos, MePCE10 y BCDIN3D 9. Es importante destacar que las condiciones del ensayo deben ajustarse a la proteína específica y al ARN de interés. Por ejemplo, se demostró que la presencia de MgCl2 disminuye la actividad de BCDIN3D18, sin embargo, MgCl2 puede ser un importante coordinador de la estructura del ARN, y por lo tanto podría constituir un componente importante del ensayo para otros ARN Metiltransferasas.
La ventaja de utilizar un autoradiograma, que puede exponerse durante un largo período de tiempo, es que puede permitir detectar una actividad muy débil que no se detecta en el ensayo de centelleo. Por lo general, esto indica que la proteína es una metiltransferasa, pero que una o más de las condiciones de reacción o reactivos necesitan ser optimizados: enzima; sustrato, cofactor, condiciones de tampón, etc9. Por ejemplo, es posible que sea necesario mejorar la purificación de enzimas para eliminar o cambiar la posición de la etiqueta. También puede ser que el ARN utilizado como sustrato necesita ser doblado correctamente o para interactuar con otra proteína o factor de ARN para ser metilado por la enzima. Por lo tanto, la literatura preexistente y / o los resultados propios en las células necesitan ser cuidadosamente revisados para configurar las condiciones de ensayo para la enzima y EL ARN de interés.
El ensayo también es extremadamente flexible. Por ejemplo, puede ser un paso precursor de otro tipo de ensayo, de modo que el ARN metilado radioactivamente se utiliza en los ensayos cuantitativos y cualitativos de demetilasa11,o en ensayos de unión al ARN que permiten visualizar específicamente el comportamiento de la ARN metilado en comparación con el no modificado. El ensayo también se puede ajustar ligeramente para analizar la modificación de los ARN que utilizan coenzimas que pueden etiquetarse radioactivamente, como la coenzima A de acetil para el estudio de la acetilación de ARN19,20.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer al Dr. Turja Kanti Debnath por su ayuda con ChemDraw. La investigación en el laboratorio xhemalé e cuenta con el apoyo del Departamento de Defensa - Programa de Investigación Médica Dirigido por el Congreso - Premio De ruptura del cáncer de mama (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 y fondos de puesta en marcha del Instituto de Celulares y Biología Molecular y la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Texas en Austin, EE. UU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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