Summary
Här beskrivs en antikroppsfri in vitro-analys för direkt analys av metyltransferasaktivitet på syntetiskt eller in vitro-transkriberat RNA.
Abstract
Det finns mer än 100 kemiskt distinkta modifieringar av RNA, varav två tredjedelar består av metyleringar. Intresset för RNA-modifieringar, och i synnerhet metyleringar, har åter dykt upp på grund av de viktiga roller som de enzymer som skriver och raderar dem i biologiska processer som är relevanta för sjukdomar och cancer. Här, en känslig in vitro-analys för noggrann analys av RNA metylering Writer aktivitet på syntetiska eller in vitro-transkriberas RNAs tillhandahålls. Denna analys använder en tritierat form av S-adenosyl-metionin, vilket resulterar i direkt märkning av metylerat RNA med tritium. Den låga energin av tritium strålning gör metoden säker, och befintliga metoder för tritium signal förstärkning, gör det möjligt att kvantifiera och visualisera metylerat RNA utan användning av antikroppar, som är ofta benägna att artefakter. Medan denna metod är skriven för RNA-metylering, få tweaks gör det tillämpligt på studiet av andra RNA-modifieringar som kan radioaktivt märkas, såsom RNA-acetylering med 14C acetyl-coenzym A. Sammantaget gör denna analys att snabbt bedöma RNA metylering villkor, hämning med små molekyler hämmare, eller effekten av RNA eller enzym mutanter, och ger ett kraftfullt verktyg för att validera och expandera resultat som erhållits i celler.
Introduction
DNA, RNA och proteiner är föremål för modifieringar som tätt reglerar genuttryck1. Bland dessa modifieringar förekommer metyleringar på alla tre biopolymerer. DNA-och proteinmetyleringar har studerats mycket väl under de senaste tre decennierna. Däremot har intresset för RNA-metylering bara nyligen reantänts i ljuset av de viktiga roller som proteiner som skriver, raderar eller binder RNA-metyleringar spelar i utveckling och sjukdom2. Förutom bättre kända funktioner i den rikliga ribosomala och överförande rnas reglerar RNA-metyleringsvägarna specifika budbärare RNA stabilitet3,4, skarvning5 och översättning6,7, Mirna bearbetning8,9 och transkriptionella pausa och release10,11.
Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet i en molekylärbiologisk laboratoriemiljö (sammanfattas i figur 1). Många studier bedömer aktiviteten hos ett RNA-metyltransferas genom dot-blot med en antikropp mot RNA-modifiering av intresse. Emellertid, dot-blot inte kontrollera integriteten av RNA vid inkubering med RNA-metyltransferas. Detta är viktigt eftersom även mindre föroreningar av rekombinanta proteiner med nukleaser kan leda till partiell RNA-nedbrytning och confounding resultat. Dessutom kan även mycket specifika RNA modifiering antikroppar erkänna oförändrad RNAs med specifika sekvenser eller strukturer. Det in vitro-RNA-metyltransferas-test som rapporteras här utnyttjar det faktum att S-adenosyl-metionin kan tritieras på metylgruppdonatorn (figur 1), vilket gör det möjligt att korrekt upptäcka det metylerade RNA utan att använda antikroppar . Instruktioner ges för in vitro-transkription och rening av en avskrift av intresse och testning av metylering av nämnda avskrift av enzymet av intresse. Denna metod är flexibel och robust, och kan justeras i enlighet med behoven hos ett givet projekt. Till exempel, in vitro transkriberad och renad RNAs, kemiskt syntetiserade RNAs, men även cellulära RNAs kan användas. Denna analys ger kvantitativ information i form av scintillationgrester, samt kvalitativ information genom att visa exakt var det metylerade RNA körs på en gel. Detta kan ge en unik inblick i funktionen hos ett RNA-metyltransferas, särskilt vid användning av cellulära RNAs som substrat, eftersom det ger en metod för att direkt observera storleken på RNA eller RNAs som är riktade mot metylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in vitro-transkription och gel rening av mål-RNA
- Klona sekvensen av intresse till plasmider som innehåller T7 och/eller SP6-initiativtagare med hjälp av etablerade molekylära kloningstekniker12 eller Kits.
- Linearizing DNA-mall för in vitro-transkription
- Förstärka sekvensen av intresse genom PCR av plasmid med primers som utformats för att inkludera T7 promotor regionen genom insatsen, + 20-30 BP uppströms och nedströms som tidigare beskrivits13.
- Alternativt, smälta 5 μg plasmiden med hjälp av en begränsning enzym (RE) skära webbplats tillgängliga nedströms insatsen enligt de instruktioner som tillhandahålls av leverantören av RE.
Observera: kom ihåg att dubbelkolla att skäret inte klipps av den valda RE. Val av den RE som används i detta steg kan dramatiskt påverka avkastningen av utskriften. Företrädesvis linjärisera med en trubbig eller 5 '-överhängande producerar re för att undvika mall växling av T7 RNA-polymeras på motsatt DNA-sträng14. Prova olika RE om initial avkastningen är otillräcklig.
- Rena den resulterande DNA med hjälp av kit för DNA aguppstod gel utvinning och sanering. Eluera DNA med 30 μL vatten.
- Blanda väl genom vortexing, Pipettera 1,5 μL och mät DNA-koncentrationen med en mikrovolyms spektrofotometer.
- Använd 250 ng av DNA för att kontrollera kvaliteten och storleken på det renade DNA på en 1% aguppkom gel elektrofores i 1x TBE buffert migreras för 1 h vid 4 V/cm.
- Tina de frysta reagenser som finns i in vitro-transkriptionssatsen. Placera T7 RNA Polymerase mix på is, och de andra reagenser på en nutator vid rumstemperatur. Omedelbart efter fullständig upptinning, snabb snurra rNTP rören för 5 s för att samla in lösning på botten av rören och placera på isen. Behåll 10X Reaktionsbufferten i rumstemperatur för att undvika nederbörd.
- Pipet i en 1,5 mL tub följande komponenter i 20 μL transkriptionsreaktion vid rumstemperatur i angiven ordning: 6 μL vatten, 2 μL (0,1-1 μg) av linjär DNA-mall, 2 μL 75 mM ATP-lösning, 2 μL 75 mM GTP-lösning , 2 μL 75 mM CTP-lösning, 2 μL 75 mM UTP-lösning, 2 μL 10X reaktionsbuffert och 2 μL T7 RNA-polymeras-blandning.
Anmärkning: för DNA-mall som genereras av PCR, Använd 100-200 ng DNA; för DNA-mall som genereras av begränsning enzym smälta av en Plasmid, Använd ~ 1 μg. aktiv rekombinant hans6-märkta T7 RNA-polymeras kan renas i E. coli15. - Blanda röret noggrant. Quick spin för 5 s att samla reaktions lösning på botten av röret, sedan Inkubera vid 37 ° c för 2-4 h.
Obs: varje avskrift kommer att bete sig olika beroende på DNA-mallen, dess längd, dess sekvens eller struktur. Optimera in vitro-transkription villkor genom att testa olika inkubationstider upp till 6 h; olika koncentrationer av DNA-mall, T7 RNA-polymeras eller NTP; tillägg av tilläggs-MgCl2 till vad som finns i T7 RNA-polymeras-blandningen. - Vid slutet av inkubationstiden, tillsätt 1 μL DNase I per 20 μL reaktion och inkubera vid 37 ° c I 15 min.
Anmärkning: transkriptionsreaktionen kan tillfälligt hållas på is tills Polyakrylamidgelen är klar. - Fortsätt med rening av polyakrylamidgel.
Obs: eftersom RNA är känsligt för pH-och RNase-kontaminering, Använd RNA-dedikerad utrustning och RNase-fria reagenser. - Bestäm procentandelen polyakrylamid för gelen beroende på storleken på avskriften av intresse: 3,5% för 100-2000 NT (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 5% för 80-500 NT (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 8% för 60-400 NT (XC: 160 NT; BB: 45 NT), 12% för 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT), 15% för 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT) och 20% för 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
- Förbered urea denaturerande polyakrylamidgel genom att kombinera följande reagens i en 50 mL koniskt rör: 9,6 g av molekylär kvalitet urea, 2 mL 10X TBE, x mL 40% akrylamid: BIS-akrylamidblandning (29:1) och vatten upp till 20 mL-märket på röret , där x = 20 mL/(40%/gel procent%).
FÖRSIKTIGHET: polyakrylamidgeler innehåller ofta un-polymeriserad akrylamid som är ett giftigt material som kan ge upphov till faror när de introduceras i miljön. Kassera polyakrylamidgeler genom institutets kemiska avfalls program. - Mikrovågsugn för 15 s vid 30% effekt. Placera på nutator i 10 min vid rumstemperatur eller tills urea har helt upplöst.
- Medan gel blandningen roterar, hämta en gel kassett (18-Tja, 1 mm tjock; 13,3 x 8,7 cm (b x L)), ta bort kam och placera kassetten för gel gjutning.
- Quick spin 50 mL-röret för 5 s för att samla gel lösning på botten av röret. Tillsätt 125 μL 10% ammoniumpersulfatlösning (APS). Placera på nutator för ~ 1 min. Quick spin igen för 5 s.
- Tillsätt 25 μL tetrametylethylendiamin (TEMED) och blanda försiktigt genom att Pipettera upp och ner 5 gånger med en 25 mL pipett som undviker bubblor.
- Pipettera i gelen och sätt försiktigt in gel kammen och Undvik bubblor.
- Dra åt tätningen genom att lägga till ett stort pärmclip ovanpå kassetten.
- Låt gelen att polymerisera för 1 h.
- När gelen har stelnat, ta bort bindemedlet klippet. Sätt in kassetten i elektrofores låda. Tillsätt 1x TBE buffert i de övre och nedre reservoarerna.
- Hämta transkriptionsreaktion. Tillsätt vatten upp till 100 μL och tillsätt sedan 100 μL 2x Gelinlastningsbuffert. Förbered stegen genom att blanda den rekommenderade mängden med vatten till 10 μL och 10 μL 2x Gellastbuffert till ett separat 1,5 mL-rör.
- Inkubera både stegen och in vitro-transkriptionsreaktionen i thermomixer vid 70 ° c i 15 min.
- Medan proverna är denaturerande vid 70 ° c, ta försiktigt bort kammen, rengör brunnarna genom att Pipettera upp och ner varje brunn med en P1000 pipett, och omedelbart Pre-Run för 10 min vid 100 V.
- När proverna har avslutat sin 15 min denaturering vid 70 ° c, ta bort rören från thermomixer och omedelbart placera på isen.
- Rengör varje brunn på gelen igen med P1000 pipetten. Fyll på 20 μL av stegen på den första brunnen till vänster, 20 μL av RNA-provet på 10 separata brunnar och 20 μL 1x Gellastbuffert på de outnyttjade brunnarna.
- Kör gelen vid 100 V för 60-240 min, beroende på% polyakrylamid av gelen.
Anmärkning: färgerna i gelen Lastbuffert kommer att separera i två band som de korsar gelen, en långsam migrera Bromophenol blå (BB) blått band, och ett snabbt migrera xylen Cyanol (XC) Cyan band. Den ungefärliga migrationen av dessa band i olika% polyakrylamidgeler är välkänd (se steg 1,11) och kan användas för att uppskatta RNA-migration i gelen. - När gelen har stoppats, ta försiktigt bort gelen från kassetten.
- Placera gelen i en ren låda som innehåller en lösning på 50 mL 1x TBE-buffert med 50 μL av nukleinsyrets gel och inkubera i 5 minuter på en rocker för att färga RNA.
- Ta en före och efter band excision bild av gelen på gel Imaging system, företrädesvis med blått ljus istället för UV-transillumination.
- Punktskatter varje band av intresse med hjälp av en Nuclease-fri engångsgel styckning spets. Efter varje brunn, överför spetsen som innehåller gel slice till en 1,5 mL tub och snurra snabbt för att samla upp gel slice. Upprepa tills alla band har samlats i samma 1,5 mL-rör.
- När alla gel skivor har samlats in, tillsätt 100 μL av Nuclease-fritt vatten eller TE buffert till 1,5 mL röret. Förvaras vid 4 ° c för ~ 48 h. Detta gör att RNA att lämna gel skivorna i lösningen.
- Efter 48 h, Pipettera vattnet eller TE buffert till en ny 1,5 mL tub. Kassera de kvarvarande gel skivorna. Rena RNA via Clean-up kit enligt följande.
- Equilibrate rotations kolonnen vid rumstemperatur i minst 30 min.
- Till 100 μL RNA-lösning i det nya 1,5 mL-röret från steg 1,32, tillsätt 350 μL RLT-buffert och blanda väl i 2 minuter på en nutator. Snurra för 1 s på 200 x g för att samla in lösning på botten av röret.
- Tillsätt 675 μL av 100% EtOH och blanda väl för 2 min på nutator. Snurra för 1 s på 200 x g och omedelbart gå vidare till nästa steg.
- Överför 565 μL av blandningen till spinkolonnen och snurra i 1 min vid 15 000 x g. Töm Samlingsröret med aspiration.
- Upprepa föregående steg med den andra halvan av provet.
- Tillsätt 500 μL RPE-buffert till kolonnen och snurra i 1 min vid 15 000 x g. Töm Samlingsröret med aspiration.
- Tillsätt 750 μL 80% etanol till kolonnen och snurra i 1 min vid 15 000 x g. Töm Samlingsröret med aspiration.
- Placera kolonnen i ett nytt 2 mL samlingsrör med locket öppet och snurra på 15 000 x g i 5 min.
- Överför kolonnen till ett nytt 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 17 μL vatten i mitten av kolonnen och snurra på 15 000 x g i 1 min till elute. Elute igen med ytterligare 17 μL vatten. Den totala återvunna volymen bör vara 32 μL.
- Blanda väl genom vortexing, Pipettera 1,5 μL och mät RNA-koncentrationen med en mikrovolyms spektrofotometer.
- Kontrollera kvaliteten på RNA-rening av urea denaturerande polyakrylamidgel som i steg 1.11-1,29.
2. in vitro-RNA-metyltransferas-analys
- Ställ in 100 μL RNA-metyltransferasanalys i en 1,5 mL tub på is enligt följande: 23 μL vatten, 10 μL 10X msk (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL 0,05 M EDTA, 5 μL 100 mM DTT , 40 μL av 50% glycerol, 4 μL 58 μM 3H-Sam, 5 μl 20X proteashämmare cocktail, 1 μl RNaseOUT (tillval), 5 μl RNA och 5 μl metyltransferas.
Varning: radioaktivt tritierat material är farligt och bör endast hanteras när du bär handskar, en labbrock och annan nödvändig personlig skyddsutrustning. Alla pipettspetsar och rör som är i kontakt med radioaktivt material betraktas som fast radioaktivt avfall. Kassera allt fast och flytande radioaktivt avfall enligt laboratoriets godkända protokoll för radioaktivt avfall.
Anmärkning: inkludera kontrollprover utan metyltransferas och utan RNA. Reagenskoncentrationerna kan kräva optimering och/eller inkludering av divalenta katjonsalter, såsom MgCl2, eller OMÄRKTA Sam. Det optimala intervallet av slutlig RNA-koncentration är från 50 nM till 1 μM, medan koncentrationen av metyltransferas är från 25 nM till 300 nM. - Blanda noga genom att försiktigt vortexa röret. Snurra 5 s på 200 x g för att samla in lösningen i botten av röret. Inkubera röret (s) vid 37 ° c för 2 h.
- Städa upp reaktionen med hjälp av kolonnrening som i steg 1,32.
FÖRSIKTIGHET: var mycket noga med att korrekt avyttra alla radioaktiva ämnen, särskilt under kolonnen tvättar (Pipettera ut i stället för aspirera avfall från uppsamlings rör). - Utför vätske scintillationsräkning
- Ställ in scintillationgreven med en injektionsflaska per prov, en injektionsflaska för bakgrundsmätning och en injektionsflaska för svep testet. Fyll injektionsflaskorna med 5 mL scintillationräknings lösning.
- Tillsätt 10 μL av varje eluerat radioaktivt RNA-prov i 1 injektionsflaska och dra åt locket och blanda försiktigt.
- Förbered svep testflaskorna. Grundligt gnugga bomullsvabb på alla ytor och utrustning som används under protokollet. Tillsätt kompresser till injektionsflaskorna fyllda med 5 mL scintillationslösning och dra åt locket.
- Kör proverna på scintillationräknaren enligt följande. Öppna disk huven, sätt i racket i maskinen och Stäng huven. Välj räkna enstaka rack. Välj Välj användar program. Välj eller skapa ett program som mäter tritium (3H) för 60 s. hit Count rack. Upprepa scintillationgredet tre gånger.
Obs: utrustningen mäter scintillationsantalet för varje prov och utdata till både skärmen och en utskrift. Protokoll kan pausas här om så önskas. Återstående RNA-prover från steg 2,3 ska frysas vid-80 ° c för senare användning.
- Fortsätt med autoradiogram
- Förbered och förköra urea denaturerande polyakrylamidgel som i steg 1.11-1,20.
- Pipettera över 20 μL radioaktivt RNA-material till ett nytt 1,5 mL-rör som innehåller 20 μL 2x Gellastbuffert. Blanda väl. Förbered stegen som i steg 1,21. Inkubera proverna vid 70 ° c i 15 min.
- Tvätta brunnarna i gelen en gång till omedelbart före prov lastning. Fyll på 20 μl av den beredda stegen, 20 μL av proverna och 20 μL 1x Gellastbuffert på kvarvarande körfält. Kör gelen vid 100 V för 60-180 min, beroende på polyakrylamid procent.
- När gelen är klar kör, ta bort gelen från kassetten och placera den i en låda som innehåller 50 mL 1x TBE buffert med 5 μL av ultraljud nukleinsyra gel fläck.
- Inkubera i 5 minuter på vippan för att färga RNA.
- Ta försiktigt ut gelen ur lådan och placera den på UV-transilluminatorn i gel avbildnings systemet med brunnar upp och stegen till vänster.
- Fokusera kameran på gelen, slå på UV-ljus och sedan ta en bild av gelen genom att exponera från 50 ms till 1 s beroende på signalintensitet.
- Stäng av UV-exponering och spara bilden som TIFF-fil.
- Placera gelen tillbaka i lådan. Ta bort TBE. Fixera gelen med 50 mL fastsättnings lösning (50% metanol, 10% ättiksyra, 40% ultra-rent vatten) i 30 min vid rumstemperatur på en rocker.
- Försiktigt flytta gelen igen till en ny svart låda som innehåller 25 ml av autoradiografi förbättra lösningen. I avsaknad av en svart låda, täck rutan med aluminiumfolie för att skydda lösningen från ljus.
- Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur på vippan.
- Lyft försiktigt gelen och placera den med framsidan nedåt på ett plastfolie med brunnarna upp och stegen på höger sida. Placera två ark kromatografipapper på bak i gelen. Vänd försiktigt hela stacken.
- Värm upp gel torken till 80 ° c. Flytta tillbaka plastlocket på gel torken. Sätt in wrap, gel och kromatografi pappersbunten under plastlocket och flytta plastlocket tillbaka ner för att skapa en tätning.
- Torr för 1 h vid 80 ° c i gel torken.
- Stäng av gel torken och ta försiktigt bort stacken. Ta bort wrap och andra kromatografi papper. Tejpa kvarvarande kromatografipapper med den torkade gelen i en autoradiogram kassett.
- Lägg till 1 ark autoradiografi film i det mörka rummet.
- Placera kassetten vid-80 ° c och utveckla filmen efter 1 h till 4 veckor beroende på signalintensitet, som kan bedömas baserat på de tidigare uppmätta scintillationgrevarna: 1-4 veckor för 250-1000 CPM, 24 h till 1 vecka för 1000-10000 CPM och 1 h till 24 h för > 10000 CP M.
- När filmen är utvecklad, placera filmen ovanpå kassetten och försiktigt Markera med en Lab markör 4 kanterna av gelen, varje brunn, och positionen för XC och BB färgämnen.
- Skanna filmen på 300 eller 600 pixlar per tum upplösning och spara bilden som TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-transkription reaktion
Figur 2 A representerar en typisk kör från en in vitro-transkription reaktion med T7 RNA-polymeras av 7Sk snRNA, vilket är en relativt kort (331 NT) och mycket strukturerade RNA. Som visas på RAW-bild, det finns flera oönskade band, både kortare och längre än 7SK, troligen till följd av slumpmässiga transkriptionella initiering eller uppsägning händelser. På grund av detta är gel rening efter in vitro-transkriptionsreaktionen viktig för att erhålla ett rent RNA-prov som visas i figur 2B. Vid denna punkt kan RNA av intresse identifieras genom sitt läge i förhållande till stegen och renas genom gel rening.
Som tidigare nämnts kan det vara nödvändigt att optimera längden på transkriptionsreaktionen före gel reningssteget. Transkription reaktioner som löper för länge kan resultera i extremt höga halter av RNA produktion, vilket gör nedströms identifiering av rätt utskrift svårt. Det är också viktigt att kontrollera identiteten för den renade avskriften genom omvänd Transkription och kvantitativ PCR (RTqPCR) med hjälp av specifika primers.
In vitro-RNA-metyltransferasanalys
Figur 3 visar ett representativt resultat av en RNA-metyltransferasanalys som beskrivs i protokollet med den undre gränsen för våra rekommenderade RNA-och proteinkoncentrationer. Denna analys möjliggör både kvantitativa resultat från scintillation räknas, samt kvalitativa resultat från autoradiogram. Här, MePCE, en RNA-metyltransferas kända för att metylera 7SK10, visades att kunna också Metylera U6. Dessutom, som nyligen visats för 7sk16, bindning av Histon H4 till mepce också hämmar U6 metylering. Vi kunde observera detta i både scintillationgreven (figur 3C) och autoradiogram (figur 3B), vilket visar robustheten hos detta protokoll.
Figur 1 . Schematisk representation av ett typiskt RNA metyltransferas-analysarbetsflöde och förväntade resultat. Sinefungin är en kompetitiv metyltransferashämmare. L: stege; WT: vildtyp; M: katalytisk Mutant; CPM: antal per min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativt experiment som visar produkten av in vitro-transkription före (A) och efter (B) rening på en denaturerande urea-polyakrylamid 8% gel som färgas med nukleinsyrliga fläckar. Pilarna pekar på 7SK avskrift före och efter gel rening. L: stege. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . In vitro-RNA-metyltransferasanalys utförd med MePCE mot U6. In vitro-metyltransferasanalys med hjälp av rekombinant gst-MePCE (25 nm), 3H-radioaktivt Sam som metylgruppdonator och in vitro transkriberat U6 RNA (50 nm) som substrat. Den autoradiogram exponerades för 2 veckor för att upptäcka kvarvarande aktivitet (250 CPM) i + Histone H4 provet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet mot specifika transkriptioner. Analysen utnyttjar det faktum att S-adenosyl metionin kan tritieras på metylgrupp givaren (figur 1), vilket gör det möjligt för METYLERAT RNA att upptäckas korrekt utan användning av antikroppar. Det är dock viktigt att notera att denna analys inte kan ange vilka rester eller kemisk grupp metyleras av enzymet. För att identifiera eller kontrollera att en specifik restprodukt är metylerad kan andra metoder såsom mutationell analys, omvänd Transkription eller masspektrometrianalys av RNA-substratet användas tillsammans med RNA-metyltransferasanalysen.
Valet av RNAs och deras syntes sätt beror på storleken på RNA. Specifika RNAs av storlekar mellan 18 och 120 NT kan vara bekvämt anpassade-syntetiseras från många välrenommerade nukleinsyra leverantörer. Men oftast är specifika RNAs av olika storlekar in vitro-transkriberad. DNA-mallar för in vitro-transkription kan genereras på olika sätt, och kräver den sekvens av intresse som ska placeras nedströms från en T7 eller SP6 promotor. När exakta ändar av RNAs är viktiga, rekommenderas pRZ plasmid17. Den höga känsligheten hos analysen (figur 3) gör det också möjligt att ersätta ett renat RNA med en blandning av cellulära RNA, antingen totalt eller Messenger rnas till exempel. Faktum är att gelen och autoradiogram ge en metod för att direkt observera storleken på RNA (s) riktade för metylering.
De villkor som rapporteras här i steg 2,1 i protokollet är optimala för BIN3 familj av metyltransferaser, som har två homologs hos människor, MePCE10 och BCDIN3D9. Det är viktigt att betona att analys betingelserna måste anpassas till det specifika proteinet och RNA av intresse. Till exempel, det visades att förekomsten av MgCl2 minskar BCDIN3D aktivitet18, dock, mgcl2 kan vara en viktig samordnare av RNA-struktur, och kan därför utgöra en viktig del av analysen för andra RNA metyltransferaser.
Fördelen med att använda en autoradiogram, som kan exponeras under en längre tid, är att det kan tillåta att upptäcka mycket svag aktivitet som inte upptäcks i scintillation analysen. Vanligtvis indikerar detta att proteinet är en metyltransferas, men att en eller flera av reaktionsbetingelserna eller reagenser måste optimeras: enzym; substrat, kofaktor, buffertförhållanden, etc9. Till exempel kan enzym rening behöva förbättras för att ta bort eller ändra placeringen av taggen. Det kan också vara att RNA som används som substrat måste vikas ordentligt eller att interagera med ett annat protein eller RNA-faktor som skall metyleras av enzymet. Därför måste redan existerande litteratur och/eller egna resultat i celler noggrant granskas för att ställa in analys villkoren för enzymet och RNA av intresse.
Analysen är också extremt flexibel. Till exempel, det kan vara ett föregångare steg till en annan typ av analys, så att radioaktivt metylerat RNA används i kvantitativa och kvalitativa demetylase-analyser11, eller i RNA-bindande analyser som gör det möjligt att specifikt visualisera beteendet hos och metylerat RNA jämfört med oförändrat. Analysen kan också lätt justeras för att analysera modifiering av rnas som använder coenzymer som kan radioaktivt märkas, såsom acetyl-coenzym A för studiet av RNA-acetylering19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Dr Turja Kanti Debnath för hans hjälp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe Lab stöds av Department of Defense-Congressiellt riktade medicinska forsknings program-Breast Cancer genombrott Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 och start-up medel från Institute of Cellular och Molekylärbiologi och Högskolan för naturvetenskap vid University of Texas i Austin, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
