Summary

Antikropps fri analys för RNA-metyltransferas aktivitetsanalys

Published: July 09, 2019
doi:

Summary

Här beskrivs en antikroppsfri in vitro-analys för direkt analys av metyltransferasaktivitet på syntetiskt eller in vitro-transkriberat RNA.

Abstract

Det finns mer än 100 kemiskt distinkta modifieringar av RNA, varav två tredjedelar består av metyleringar. Intresset för RNA-modifieringar, och i synnerhet metyleringar, har åter dykt upp på grund av de viktiga roller som de enzymer som skriver och raderar dem i biologiska processer som är relevanta för sjukdomar och cancer. Här, en känslig in vitro-analys för noggrann analys av RNA metylering Writer aktivitet på syntetiska eller in vitro-transkriberas RNAs tillhandahålls. Denna analys använder en tritierat form av S-adenosyl-metionin, vilket resulterar i direkt märkning av metylerat RNA med tritium. Den låga energin av tritium strålning gör metoden säker, och befintliga metoder för tritium signal förstärkning, gör det möjligt att kvantifiera och visualisera metylerat RNA utan användning av antikroppar, som är ofta benägna att artefakter. Medan denna metod är skriven för RNA-metylering, få tweaks gör det tillämpligt på studiet av andra RNA-modifieringar som kan radioaktivt märkas, såsom RNA-acetylering med 14C acetyl-coenzym A. Sammantaget gör denna analys att snabbt bedöma RNA metylering villkor, hämning med små molekyler hämmare, eller effekten av RNA eller enzym mutanter, och ger ett kraftfullt verktyg för att validera och expandera resultat som erhållits i celler.

Introduction

DNA, RNA och proteiner är föremål för modifieringar som tätt reglerar genuttryck1. Bland dessa modifieringar förekommer metyleringar på alla tre biopolymerer. DNA-och proteinmetyleringar har studerats mycket väl under de senaste tre decennierna. Däremot har intresset för RNA-metylering bara nyligen reantänts i ljuset av de viktiga roller som proteiner som skriver, raderar eller binder RNA-metyleringar spelar i utveckling och sjukdom2. Förutom bättre kända funktioner i den rikliga ribosomala och överförande rnas reglerar RNA-metyleringsvägarna specifika budbärare RNA stabilitet3,4, skarvning5 och översättning6,7, Mirna bearbetning8,9 och transkriptionella pausa och release10,11.

Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet i en molekylärbiologisk laboratoriemiljö (sammanfattas i figur 1). Många studier bedömer aktiviteten hos ett RNA-metyltransferas genom dot-blot med en antikropp mot RNA-modifiering av intresse. Emellertid, dot-blot inte kontrollera integriteten av RNA vid inkubering med RNA-metyltransferas. Detta är viktigt eftersom även mindre föroreningar av rekombinanta proteiner med nukleaser kan leda till partiell RNA-nedbrytning och confounding resultat. Dessutom kan även mycket specifika RNA modifiering antikroppar erkänna oförändrad RNAs med specifika sekvenser eller strukturer. Det in vitro-RNA-metyltransferas-test som rapporteras här utnyttjar det faktum att S-adenosyl-metionin kan tritieras på metylgruppdonatorn (figur 1), vilket gör det möjligt att korrekt upptäcka det metylerade RNA utan att använda antikroppar . Instruktioner ges för in vitro-transkription och rening av en avskrift av intresse och testning av metylering av nämnda avskrift av enzymet av intresse. Denna metod är flexibel och robust, och kan justeras i enlighet med behoven hos ett givet projekt. Till exempel, in vitro transkriberad och renad RNAs, kemiskt syntetiserade RNAs, men även cellulära RNAs kan användas. Denna analys ger kvantitativ information i form av scintillationgrester, samt kvalitativ information genom att visa exakt var det metylerade RNA körs på en gel. Detta kan ge en unik inblick i funktionen hos ett RNA-metyltransferas, särskilt vid användning av cellulära RNAs som substrat, eftersom det ger en metod för att direkt observera storleken på RNA eller RNAs som är riktade mot metylering.

Protocol

1. in vitro-transkription och gel rening av mål-RNA Klona sekvensen av intresse till plasmider som innehåller T7 och/eller SP6-initiativtagare med hjälp av etablerade molekylära kloningstekniker12 eller Kits. Linearizing DNA-mall för in vitro-transkription Förstärka sekvensen av intresse genom PCR av plasmid med primers som utformats för att inkludera T7 promotor regionen genom insatsen, + 20-30 BP uppströms och nedströms som tidigare beskri…

Representative Results

In vitro-transkription reaktionFigur 2 A representerar en typisk kör från en in vitro-transkription reaktion med T7 RNA-polymeras av 7Sk snRNA, vilket är en relativt kort (331 NT) och mycket strukturerade RNA. Som visas på RAW-bild, det finns flera oönskade band, både kortare och längre än 7SK, troligen till följd av slumpmässiga transkriptionella initiering eller uppsägning händelser. På grund av detta är gel rening efter in vitro-transkri…

Discussion

Här rapporteras en enkel och robust metod för in vitro-verifiering av RNA-metyltransferasaktivitet mot specifika transkriptioner. Analysen utnyttjar det faktum att S-adenosyl metionin kan tritieras på metylgrupp givaren (figur 1), vilket gör det möjligt för METYLERAT RNA att upptäckas korrekt utan användning av antikroppar. Det är dock viktigt att notera att denna analys inte kan ange vilka rester eller kemisk grupp metyleras av enzymet. För att identifiera eller kontrollera att en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna skulle vilja tacka Dr Turja Kanti Debnath för hans hjälp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe Lab stöds av Department of Defense-Congressiellt riktade medicinska forsknings program-Breast Cancer genombrott Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 och start-up medel från Institute of Cellular och Molekylärbiologi och Högskolan för naturvetenskap vid University of Texas i Austin, USA.

Materials

10 bp DNA Ladder Invitrogen 10821-015 10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)  N/A N/A For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer N/A N/A For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS N/A N/A For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. 
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher BP1408-1 For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) Perkin Elmer NET155V250UC For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity=
(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes GE Healthcare RPN11649 For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP GE Healthcare 28906846 For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter Beckman LS6500 For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704466 Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Applied Science 4693159001 For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell Biorad 345-9902 RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes Biorad 1656001 Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer DeNovix DS-11-S Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original National Diagnostics LS-271 For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials Fisher 03-337-1 For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer RPI CORP 112600 For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer Biorad 1651745 For drying gel.
Gel Loading Buffer II Ambion AM8547 For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips Gel Company NC9431993 For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit Ambion AM1333 For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. 
Perfectwestern Extralarge Container Genhunter Corporation NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) Gel staining box.
pRZ Addgene #27663 Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Qiagen 74204 For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap Saran Wrap Amazon For drying gel.
SYBR Gold Invitrogen S11494 Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe Invitrogen S33102 Nucleic acid gel stain.
TE Sigma 93283-100ML 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED Fisher 110-18-9 For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES eppendorf 5382000023/5361000038 For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit life technologies Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL) Ambion AM2238 For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea Sigma 51456-500G For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper GE Healthcare 3030-154 Chromatography paper for drying gel.

References

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5′ UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

Play Video

Cite This Article
Shelton, S. B., Xhemalce, B. Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis. J. Vis. Exp. (149), e59856, doi:10.3791/59856 (2019).

View Video