Summary
Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.
Abstract
Er zijn meer dan 100 chemisch verschillende modificaties van RNA, waarvan tweederde bestaat uit methylaties. Belangstelling voor RNA-modificaties, en vooral methylaties, is opnieuw ontstaan als gevolg van de belangrijke rollen die worden gespeeld door de enzymen die ze schrijven en verwijderen in biologische processen die relevant zijn voor ziekte en kanker. Hier wordt een gevoelige in vitro assay voor een accurate analyse van RNA methylatieanalyse Writer activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde rna's verstrekt. Deze test maakt gebruik van een tritiumhoudend vorm van S-adenosyl-methionine, resulterend in directe etikettering van gemethyleerd RNA met tritium. De lage energie van tritium straling maakt de methode veilig, en reeds bestaande methoden van tritium signaalversterking, maken het mogelijk om te kwantificeren en het gemethyleerd RNA visualiseren zonder het gebruik van antilichamen, die vaak vatbaar zijn voor artefacten. Hoewel deze methode is geschreven voor RNA-methylering, maken enkele tweaks het toepasbaar op de studie van andere RNA-modificaties die radioactief gelabeld kunnen worden, zoals RNA acetylering met 14C acetyl coenzym A. over het algemeen maakt deze assay het mogelijk om snel te beoordelen RNA methylatieaandoeningen, remming met kleine molecuul remmers, of het effect van RNA-of enzym mutanten, en biedt een krachtig hulpmiddel om de in cellen verkregen resultaten te valideren en uit te breiden.
Introduction
DNA, RNA en eiwitten zijn onderhevig aan modificaties die genexpressie1strak reguleren. Onder deze wijzigingen, en optreden op alle drie biopolymeren. DNA-en eiwithoudende methylaties zijn in de afgelopen drie decennia zeer goed bestudeerd. Daarentegen is de interesse in RNA-methylatie pas recentelijk geregend in het licht van de belangrijke rollen die eiwitten die het schrijven, wissen of binden van RNA-methylaties spelen in ontwikkeling en ziekte2. Naast beter bekende functies in de overvloedige ribosomale en overdracht RNAS, reguleren RNA methylatietrajecten specifieke boodschapper RNA stabiliteit3,4, splicing5 en vertaling6,7, Mirna verwerkt8,9 en transcriptionele onderbreken en vrijgeven10,11.
Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit in de setting van een moleculair biologie laboratorium gerapporteerd (samengevat in Figuur 1). Veel studies beoordelen de activiteit van een RNA-methyltransferase door middel van dot-Blot met een antilichaam tegen de RNA-modificatie van belang. Dot-Blot controleert echter niet de integriteit van het RNA na incubatie met het RNA-methyltransferase. Dit is belangrijk omdat zelfs kleine verontreinigingen van recombinant eiwit met nucleasen kunnen leiden tot gedeeltelijke RNA afbraak en verstorende resultaten. Bovendien kunnen zelfs zeer specifieke RNA modificatie antilichamen ongemodificeerde Rna's herkennen met specifieke sequenties of structuren. De in vitro RNA-methyltransferase assay die hier wordt gerapporteerd, maakt gebruik van het feit dat de S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen . Instructies zijn voorzien voor in vitro transcriptie en zuivering van een transcriptie van belang en het testen van de methylatieanalyse van deze transcriptie door het enzym van de belangstelling. Deze methode is flexibel en robuust, en kan worden aangepast aan de behoeften van een bepaald project. Zo kunnen in vitro getranscribeerde en gezuiverde Rna's, chemisch samengestelde rna's, maar ook cellulaire Rna's worden gebruikt. Deze test verschaft kwantitatieve informatie in de vorm van scintillatie tellingen, evenals kwalitatieve informatie door te laten zien waar precies het gemethyleerd RNA op een gel draait. Dit kan een uniek inzicht bieden in de functie van een RNA-methyltransferase, vooral bij het gebruik van cellulaire Rna's als substraat, omdat het een methode biedt om direct de grootte van het RNA of Rna's te observeren die gericht zijn op methylatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in vitro transcriptie en gel zuivering van het doelwit RNA
- Kloon de volgorde van belangstelling in plasmiden met T7 en/of SP6 promoters met behulp van gevestigde moleculaire kloontechnieken12 of Kits.
- Linearisatie van de DNA-template voor in vitro transcriptie
- Vergroot de volgorde van belangstelling per PCR van het plasmide met primers die zijn ontworpen om de T7 Promoter regio op te nemen via de insert, + 20-30 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts zoals eerder beschreven13.
- Als alternatief, verteren 5 μg van het plasmide met behulp van een restrictie-enzym (her) cut site stroomafwaarts van de wisselplaat volgens de instructies van de leverancier van het RE.
Opmerking: Vergeet niet te controleren of de insert niet door de geselecteerde RE wordt gesneden. Selectie van de RE gebruikt in deze stap kan dramatisch invloed hebben op de opbrengst van het transcript. Bij voorkeur Linearize met een bot of 5 '-overhangende uiteinde produceren RE om te voorkomen dat sjabloon overschakelen van de T7 RNA polymerase op het tegenovergestelde DNA-onderdeel14. Probeer verschillende RE als de initiële opbrengsten onvoldoende zijn.
- Zuivert het resulterende DNA met behulp van de Kit voor DNA-agarose-gel-extractie en-opruimen. Elute het DNA met 30 μL water.
- Meng goed door vortexing, pipet 1,5 μL en meet de DNA-concentratie met een microvolume spectrofotometer.
- Gebruik 250 ng van DNA om de kwaliteit en grootte van het gezuiverde DNA te controleren op een 1% agarose gel elektroforese in 1x TBE buffer gemigreerd voor 1 h bij 4 V/cm.
- De bevroren reagentia van de in vitro transcriptie Kit ontdooien. Plaats de T7 RNA polymerase mix op ijs en de andere reagentia op een nutator bij kamertemperatuur. Onmiddellijk na het ontdooien, Quick draai de rNTP buizen voor 5 s te verzamelen oplossing aan de onderkant van de buizen en plaats op ijs. Houd de 10x-reactie buffer bij kamertemperatuur om neerslag te voorkomen.
- Pipet in een buis van 1,5 mL de volgende bestanddelen van de 20 μL transcriptie reactie bij kamertemperatuur in de aangegeven volgorde: 6 μL water, 2 μL (0,1-1 μg) lineaire DNA-template, 2 μL 75 mM ATP-oplossing, 2 μL 75 mM GTP-oplossing , 2 μL van 75 mM CTP-oplossing, 2 μL 75 mM UTP-oplossing, 2 μL 10x-reactie buffer en 2 μL T7 RNA-polymerase-mix.
Opmerking: voor DNA-template gegenereerd door PCR, gebruik 100-200 ng DNA; voor DNA-template gegenereerd door restrictie enzym Digest van een plasmide, gebruik ~ 1 μg. actieve recombinant zijn6-gelabelde T7 RNA polymerase kan worden gezuiverd in E. coli15. - Meng de buis grondig. Snelle spin voor 5 s voor het verzamelen van reactie oplossing aan de onderkant van de buis, vervolgens inbroed bij 37 ° c voor 2-4 h.
Opmerking: elke transcriptie gedraagt zich verschillend, afhankelijk van de DNA-sjabloon, de lengte, de volgorde of de structuur. Optimaliseer in vitro transcriptie condities door verschillende incubatie tijden tot 6 uur te testen; verschillende concentraties van DNA-template, T7 RNA polymerase, of NTP; of toevoeging van aanvullende MgCl2 aan wat er in de T7 RNA polymerase mix aanwezig is. - Voeg aan het einde van de incubatieperiode 1 μL DNase I per 20 μL-reactie toe en incuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.
Opmerking: de transcriptie reactie kan tijdelijk op ijs worden bewaard tot de polyacrylamidegel klaar is. - Ga verder met zuivering door polyacrylamidegel.
Opmerking: aangezien RNA gevoelig is voor pH-en RNase-verontreiniging, gebruikt u RNA-dedicated apparatuur en RNase-vrije reagentia. - Bepaal het percentage Polyacrylamide voor de gel, afhankelijk van de grootte van het transcript van belang: 3,5% voor 100-2000 NT (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 5% voor 80-500 NT (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 8% voor 60-400 NT (XC: 160 NT; BB: 45 NT), 12% voor 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT), 15% voor 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT), en 20% voor 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).
- Bereid de ureum-denaturerende polyacrylamidegel voor door de volgende reagentia te combineren in een conische buis van 50 mL: 9,6 g moleculaire ureum, 2 mL 10x TBE, x mL 40% acrylamide: bis-acrylamidemix (29:1) en water tot de 20 mL markering op de buis , waarbij x = 20 mL/(40%/gel percentage%).
Let op: Polyacrylamidegels bevatten vaak un-gepolymeriseerde acrylamide, wat een giftig materiaal is dat een gevaar kan opleveren wanneer het in het milieu wordt geïntroduceerd. Verwijder polyacrylamidegels via het chemisch afval programma van de instelling. - Magnetron voor 15 s bij 30% vermogen. Plaats de nutator gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur of totdat ureum volledig is opgelost.
- Haal, terwijl het gelmengsel draait, een gel cassette (18-goed, 1 mm dik; 13,3 x 8,7 cm (b x L)), verwijder de kam en plaats de cassette voor het gieten van de gel.
- Snel draaien de 50 mL tube voor 5 s om gel oplossing te verzamelen aan de onderkant van de buis. Voeg 125 μL van 10% ammoniumpersulfiaat oplossing (APS) toe. Plaats op de nutator voor ~ 1 min. Quick spin weer voor 5 s.
- Voeg 25 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe en meng met een pipet van 25 mL om bubbels te vermijden voorzichtig door het pipetteren op en neer.
- Pipetteer in de gel gegoten en plaats de gel kam voorzichtig met het vermijden van bubbels.
- Draai de afdichting vast door een grote Binder clip over de bovenkant van de cassette toe te voegen.
- Laat de gel voor 1 uur polymeriseren.
- Verwijder de binder clip zodra de gel is gestijgd. Plaats de cassette in de elektroforese doos. Voeg 1x TBE buffer toe aan de boven-en onderreservoirs.
- Transcriptie reactie ophalen. Voeg water tot 100 μL toe en voeg 100 μL 2x gel-laad buffer toe. Bereid de ladder voor door de aanbevolen hoeveelheid met water te mengen tot 10 μL en 10 μL van 2x gel-laad buffer in een aparte tube van 1,5 mL.
- Incuberen zowel de ladder als de in vitro transcriptie reactie in de thermomixer bij 70 °C gedurende 15 minuten.
- Terwijl de monsters denaturering op 70 ° c, verwijder voorzichtig de kam, reinig de putten door pipetteren op en neer elke goed met een P1000 Pipet, en onmiddellijk pre-run voor 10 min bij 100 V.
- Zodra de monsters hun 15 min denaturatie hebben voltooid bij 70 °C, verwijdert u de buizen van de thermomixer en plaatst u onmiddellijk op ijs.
- Reinig elke put van de gel opnieuw met de P1000 pipet. Plaats 20 μl van de ladder op de eerste putje naar links, 20 μL van het RNA-monster op 10 afzonderlijke putjes en 20 μL 1x gel-laad buffer op de onbenutte putten.
- Voer de gel uit op 100 V voor 60-240 min, afhankelijk van de% Polyacrylamide van de gel.
Opmerking: de kleurstoffen in de gel-laad buffer worden gescheiden in twee banden terwijl ze de gel doorkruisen, een langzaam migrerende Bromophenol Blue (BB) blauwe band en een snel migrerende xylene Cyanol (XC) cyaan band. De geschatte migratie van deze bands in verschillende% polyacrylamidegels is bekend (zie stap 1,11) en kan worden gebruikt om de migratie van RNA in de gel te schatten. - Verwijder de gel voorzichtig uit de cassette zodra de gel is gestopt.
- Plaats de gel in een schone doos met een oplossing van 50 mL 1x TBE buffer met 50 μL nucleïnezuur gel vlek en inincubatie gedurende 5 minuten op een rocker om het RNA te vlekken.
- Neem een voor-en-na-band excisie foto van de gel op het gelbeeldvormings systeem, bij voorkeur met blauw licht in plaats van UV-trans verlichting.
- Accijnzen elke band van belang met behulp van een Nuclease-vrije wegwerp gel snijden tip. Breng na elk goed de punt met de gel slice over in een tube van 1,5 mL en draai kort om de gelslice te verzamelen. Herhaal dit totdat alle banden zijn verzameld in dezelfde 1,5 mL Tube.
- Zodra alle gelschijfjes zijn verzameld, voeg 100 μL Nuclease vrij water of TE buffer toe aan de buis van 1,5 mL. Bewaren bij 4 °C voor ~ 48 h. Hierdoor kan het RNA de gelschijfjes in de oplossing afsluiten.
- Pipet de water-of TE-buffer na 48 uur in een nieuwe buis van 1,5 mL. Gooi de overgebleven gelschijfjes weg. Reinig het RNA via clean-up Kit als volgt.
- De draai kolom wordt gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur weer in evenwicht.
- Voeg aan de 100 μL RNA-oplossing in de nieuwe buis van 1,5 mL uit stap 1,32 350 μL RLT-buffer toe en meng goed gedurende 2 minuten op een nutator. Spin voor 1 s bij 200 x g om de oplossing te verzamelen aan de onderkant van de buis.
- Voeg 675 μL 100% EtOH toe en meng goed gedurende 2 minuten op de nutator. Spin voor 1 s bij 200 x g en ga onmiddellijk door naar de volgende stap.
- Breng 565 μL van het mengsel op de spin kolom en draai gedurende 1 minuut bij 15.000 x g. Maak de opvang buis leeg door aspiratie.
- Herhaal de vorige stap met de tweede helft van het voorbeeld.
- Voeg 500 μL RPE-buffer toe aan de kolom en draai gedurende 1 minuut bij 15.000 x g. Maak de opvang buis leeg door aspiratie.
- Voeg 750 μL 80% ethanol toe aan de kolom en draai gedurende 1 minuut bij 15.000 x g. Maak de opvang buis leeg door aspiratie.
- Plaats de kolom in een nieuwe 2 mL opvang buis met het deksel open en spin bij 15.000 x g gedurende 5 minuten.
- Breng de kolom over naar een nieuwe tube van 1,5 mL.
- Voeg 17 μL water toe in het midden van de kolom en draai bij 15.000 x g gedurende 1 minuut om te elute. Opnieuw met nog eens 17 μL water. Het totale herstelde volume moet 32 μL zijn.
- Meng goed door vortexing, pipet 1,5 μL en meet de concentratie van het RNA met behulp van een microvolume spectrofotometer.
- Controleer de kwaliteit van de RNA-zuivering door ureum-denaturering van polyacrylamidegel zoals in stappen 1.11-1.29.
2. in vitro RNA-methyltransferase assay
- Stel de 100 μL RNA methyltransferase assay in een buis van 1,5 mL op ijs als volgt in: 23 μl water, 10 μL 10x TBS (500 mM tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL van 0,05 M EDTA, 5 μL van 100 mM DTT , 40 μL van 50% glycerol, 4 μL van 58 μM 3H-Sam, 5 μl van een cocktail van 20 x proteaseremmers, 1 μl RNaseOUT (facultatief), 5 μl RNA en 5 μl methyltransferase.
Let op: radioactief tritiumhoudend materiaal is gevaarlijk en mag alleen worden gehanteerd bij het dragen van handschoenen, een Labcoat en andere noodzakelijke PBM. Alle pipetpunten en buizen die in contact komen met radioactief materiaal worden beschouwd als vast radioactief afval. Gooi alle vaste en vloeibare radioactieve afvalstoffen weg volgens het goedgekeurde protocol voor radioactief afval van het lab.
Opmerking: Neem controlemonsters zonder de methyltransferase en zonder het RNA. De reagens concentraties kunnen optimalisering en/of opname van divalente kationzouten, zoals MgCl2, of niet-GELABELDE Sam vereisen. Het optimale bereik van de uiteindelijke RNA-concentratie is van 50 nM tot 1 μM, terwijl de methyltransferase concentratie van 25 nM tot 300 nM is. - Meng grondig door de buis zachtjes te vortexeren. Spin 5 s op 200 x g om de oplossing op de bodem van de buis te verzamelen. Inincuberen van de buis (en) bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Reinig de reactie met behulp van kolom zuivering zoals in stap 1,32.
VOORZICHTIG: Wees voorzichtig met het afvoeren van radioactieve materialen, vooral tijdens het wassen van de kolom (Pipetteer uit in plaats van het opzuigen van afval van verzamelbuizen). - Voer vloeibare Scintillatie telling uit
- Stel het Scintillatie Count-rek in met één injectieflacon per monster, één injectieflacon voor achtergrond meting en één injectieflacon voor de veeg test. Vul de injectieflacons met 5 ml Scintillatie teloplossing.
- Voeg 10 μL van elk eluteerde radioactieve RNA-monster toe in 1 injectieflacon en draai het deksel vast en meng zachtjes.
- Bereid de veeg test flesjes. Wrijf wattenstaafjes grondig op alle oppervlakken en apparatuur die tijdens het protocol worden gebruikt. Voeg doekjes toe aan de flacons gevuld met 5 ml Scintillatie oplossing en draai het deksel vast.
- Voer de voorbeelden uit op de Scintillatie-teller als volgt. Open de tegen kap, steek het rek in de machine en sluit de kap. Selecteer aantal Single rack. Selecteer gebruikers programmaselecteren. Selecteer of maak een programma dat tritium (3uur) meet voor 60 s. hit Count rack. Herhaal het aantal Scintillatie drie keer.
Opmerking: de apparatuur meet het aantal Scintillatie van elk monster en de uitvoer naar zowel het scherm als een afdruk. Protocol kan desgewenst worden onderbroken. Resterende RNA-monsters uit stap 2,3 moeten worden bevroren bij-80 °C voor later gebruik.
- Ga verder met het autoradiogram
- Bereid en pre-run ureum denaturerende polyacrylamidegel zoals in stappen 1.11-1.20.
- Pipetteer 20 μL radioactief RNA-materiaal in een nieuwe tube van 1,5 mL met 20 μL 2x gel-laad buffer. Meng goed. Bereid de ladder zoals in stap 1,21. Incuberen de monsters bij 70 °C gedurende 15 minuten.
- Was de putjes van de gel nogmaals onmiddellijk voor het laden van het monster. Plaats 20 μl van de bereide ladder, 20 μL van de monsters en 20 μL 1x gel-laad buffer op de resterende rijstroken. Voer de gel uit op 100 V voor 60-180 min, afhankelijk van het percentage Polyacrylamide.
- Zodra de gel klaar is, verwijdert u de gel uit de cassette en plaatst u deze in een doos met 50 mL 1x TBE buffer met 5 μL ultrasensitieve nucleïnezuur gelvlek.
- Inincuberen gedurende 5 minuten op de rocker om het RNA te vlekken.
- Neem de gel voorzichtig uit de doos en plaats deze op de UV-transilluminator van het gelbeeldvormings systeem met de putten omhoog en de ladder aan de linkerkant.
- Richt de camera op de gel, zet het UV-licht aan en neem een afbeelding van de gel door bloot te stellen van 50 MS tot 1 s, afhankelijk van de signaalintensiteit.
- Schakel UV-belichting uit en sla de afbeelding op als TIFF-bestand.
- Plaats de gel weer in de doos. Verwijder TBE. Bevestig de gel met 50 mL bevestigingsoplossing (50% methanol, 10% azijnzuur, 40% Ultra-zuiver water) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker.
- Beweeg de gel voorzichtig opnieuw naar een frisse zwarte doos met 25 mL van de autoradiografie verbeterende oplossing. Bij afwezigheid van een zwarte doos, bedek de doos met aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen.
- Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de rocker.
- Til de gel voorzichtig op en plaats deze op een vel plastic folie met de putjes omhoog en de ladder aan de rechterkant. Plaats twee vellen chromatografie papier op de achterkant van de gel. Draai de hele stapel voorzichtig om.
- Verwarm de gel droger vooraf tot 80 °C. Plaats de plastic hoes terug op de geldroger. Voeg wrap-, gel-en chromatografie papierstapel onder de plastic afdekking en beweeg de plastic afdekking terug naar beneden om een afdichting te maken.
- Droog gedurende 1 uur bij 80 °C in de geldroger.
- Zet de gel droger uit en verwijder de stapel voorzichtig. Verwijder het wikkel-en tweede chromatografie papier. Tape resterend chromatografie papier met de gedroogde gel in een autoradiogram cassette.
- Voeg 1 vel autoradiografie film toe aan de Dark Room.
- Plaats de cassette bij-80 °C en ontwikkel de film na 1 uur tot 4 weken, afhankelijk van de signaalintensiteit, die kan worden beoordeeld op basis van de eerder gemeten Scintillatie tellingen: 1-4 weken voor 250-1000 CPM, 24 uur tot 1 week voor 1000-10000 CPM en 1 uur tot 24 h voor > 10000 CP M.
- Nadat de film is ontwikkeld, plaatst u de film bovenop de cassette en markeert u zorgvuldig met een laboratorium marker de 4 randen van de gel, elk goed en de positie van de XC-en BB-kleurstoffen.
- Scan de film op 300 of 600 pixels per inch resolutie en sla de afbeelding op als TIFF-bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro transcriptie reactie
Figuur 2 A vertegenwoordigt een typische run van een in vitro transcriptie reactie met de T7 RNA polymerase van het 7Sk snrna, wat een relatief korte (331 NT) en sterk gestructureerd RNA is. Zoals weergegeven op die RAW-afbeelding, zijn er meerdere ongewenste bands, zowel korter als langer dan 7SK, waarschijnlijk als gevolg van willekeurige transcriptionele initiatie-of beëindigings gebeurtenissen. Hierdoor is gel-zuivering na de in vitro transcriptie reactie belangrijk om een zuiver RNA-monster te verkrijgen zoals weergegeven in Figuur 2B. Op dit punt, het RNA van belang kan worden geïdentificeerd door de locatie ten opzichte van de ladder en gezuiverd door gel zuivering.
Zoals eerder vermeld, kan het nodig zijn om de lengte van de transcriptie reactie voorafgaand aan de gel-zuiveringsstap te optimaliseren. Transcriptie reacties die te lang lopen, kunnen resulteren in extreem hoge hoeveelheden RNA-productie, waardoor de downstream-identificatie van het juiste transcript moeilijk is. Het is ook belangrijk om de identiteit van de gezuiverde transcriptie te controleren door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve PCR (RTqPCR) met behulp van specifieke primers.
In vitro RNA methyltransferase assay
Figuur 3 toont een representatief resultaat van een RNA-methyltransferase test zoals beschreven in het protocol met behulp van de ondergrens van onze aanbevolen RNA-en eiwit concentraties. Deze bepaling maakt zowel kwantitatieve resultaten van het Scintillatie tellingen mogelijk, als ook kwalitatieve resultaten van het autoradiogram. Hier, mepce, een RNA methyltransferase waarvan bekend is dat natriummethylaat 7sk10, bleek ook te kunnen natriummethylaat U6. Bovendien remt, zoals onlangs weergegeven voor 7sk16, de binding van Histon H4 aan mepce ook U6-methylatie. We konden dit observeren in zowel het aantal Scintillatie (Figuur 3C) als het autoradiogram (Figuur 3B), wat de robuustheid van dit protocol aantoont.
Figuur 1 . Schematische weergave van een typische RNA-methyltransferase assay-workflow en verwachte resultaten. Sinefungin is een competitieve methyltransferase remmer. L: ladder; WT: wild type; M: katalytisch Mutant; CPM: tellingen per min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Representatief experiment met het product van in vitro transcriptie vóór (A) en na (B) zuivering op een denaturerende ureum-Polyacrylamide 8% gel gekleurd met nucleïnezuur vlek. De pijlen wijzen naar de 7SK transcriptie voor en na de gel zuivering. L: ladder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . In vitro RNA methyl-transferase test uitgevoerd met MePCE tegen U6. In vitro methyltransferase assay met behulp van RECOMBINANT gst-MePCE (25 nm), 3H-radioactieve Sam als methylgroep donor en in-vitro getranscribeerd U6 RNA (50 nm) als substraat. Het autoradiogram werd gedurende 2 weken blootgesteld om de resterende activiteit (250 CPM) in het + histone H4-monster te detecteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit naar specifieke transcripten gerapporteerd. De assay maakt gebruik van het feit dat S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze bepaling niet kan aangeven welke residu of chemische groep door het enzym wordt gemethyleerd. Om te identificeren of om te controleren of een specifiek residu is gemethyleerd, kunnen andere methoden zoals mutationele analyse, reverse transcriptie blok of massaspectrometrie analyse van het RNA-substraat worden gebruikt in combinatie met de RNA-methyltransferase assay.
De keuze van Rna's en hun wijze van synthese is afhankelijk van de grootte van het RNA. Specifieke Rna's van grootten tussen 18 en 120 NT kunnen gemakkelijk op maat worden gesynthetiseerd uit vele gereputeerde nucleïnezuur providers. Echter, meestal zijn specifieke Rna's van verschillende grootte in vitro getranscribeerd. De DNA-templates voor in vitro transcriptie kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd en vereisen dat de volgorde van de interesse stroomafwaarts ligt van een T7 of SP6 Promoter. Wanneer precieze uiteinden van Rna's belangrijk zijn, wordt de pRZ plasmide aanbevolen17. De hoge gevoeligheid van de assay (Figuur 3) maakt het ook mogelijk om een gezuiverd RNA te vervangen door een mengsel van cellulair RNA, ofwel Total of Messenger RNAS bijvoorbeeld. Inderdaad, de gel en autoradiogram bieden een methode om direct te observeren de grootte van de RNA (s) gericht voor Methylation.
De hier gemelde voorwaarden in stap 2,1 van het protocol zijn optimaal voor de BIN3 familie van methyltransferases, die twee homo logs bij mensen heeft, MePCE10 en BCDIN3D9. Het is belangrijk om te benadrukken dat de testomstandigheden moeten worden aangepast aan het specifieke eiwit en RNA van belang. Zo werd bijvoorbeeld aangetoond dat de aanwezigheid van MgCl2 BCDIN3D activiteit18afneemt, maar MgCl2 kan een belangrijke coördinator van de RNA-structuur zijn en kan dus een belangrijk onderdeel van de test voor andere RNA- methyltransferases.
Het voordeel van het gebruik van een autoradiogram, dat kan worden blootgesteld voor een langere periode, is dat het kan toestaan om zeer zwakke activiteit die niet wordt gedetecteerd in de Scintillatie assay detecteren. Meestal geeft dit aan dat het eiwit een methyltransferase is, maar dat een of meer van de reactie condities of reagentia moeten worden geoptimaliseerd: enzym; substraat, cofactor, buffer condities, etc.9. Het kan bijvoorbeeld nodig zijn de enzym zuivering te verbeteren om de positie van de tag te verwijderen of te wijzigen. Het kan ook zijn dat het RNA dat als substraat wordt gebruikt, goed moet worden gevouwen of om te communiceren met een andere proteïne-of RNA-factor om door het enzym te worden gemethyleerd. Zo moeten reeds bestaande literatuur en/of eigen resultaten in cellen zorgvuldig worden geëvalueerd om de assay-voorwaarden voor het enzym en RNA van belangstelling in te stellen.
De assay is ook uiterst flexibel. Het kan bijvoorbeeld een voorloper zijn naar een ander type Assay, zodanig dat het radioactief gemethylleerde RNA wordt gebruikt in kwantitatieve en kwalitatieve demethylase testen11, of in RNA binding testen die het mogelijk maken om specifiek het gedrag van de gemethyleerd RNA in vergelijking met de ongewijzigde. De test kan ook licht worden aangepast om de modificatie van rna's te analyseren die coenzymen gebruiken die radioactief gelabeld kunnen worden, zoals acetyl coenzym A voor de studie van RNA acetylering19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Turja Kanti Debnath bedanken voor zijn hulp bij ChemDraw. Onderzoek in de Xhemalçe Lab wordt ondersteund door het ministerie van defensie-Congressionally gerichte medisch onderzoekprogramma-Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH subsidie R01 GM127802 en start-up fondsen van het Institute of Cellular en Moleculaire biologie en het College voor natuurwetenschappen aan de Universiteit van Texas in Austin, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
