Summary
该协议侧重于识别与磷酸肌醇或磷酸磷酸剂结合的蛋白质。它使用亲和色谱与生物异化异酸醇磷酸盐或磷酸磷酸酯,通过链球菌固定到胶质或磁珠。磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸二醇结合蛋白通过西方印迹或质谱法鉴定。
Abstract
肌醇磷酸盐和磷酸磷化物调节真核细胞中的多个细胞过程,包括基因表达、囊泡贩运、信号转导、代谢和发育。这些代谢物通过与蛋白质结合来执行此调节活性,从而改变蛋白质构象、催化活性和/或相互作用。此处描述的方法使用与质谱或西方印迹耦合的亲和色谱法来识别与磷酸肌醇或磷酸磷酸醇相互作用的蛋白质。肌醇磷酸盐或磷酸磷酸剂与生物锡在化学上标记,然后通过链球菌与甘蔗或磁珠结合捕获。蛋白质通过与代谢物结合的亲和力进行分离,然后通过质谱或西方印迹进行洗脱和识别。该方法具有一个简单的工作流程,是敏感的,非放射性的,无脂质体,可定制的,支持蛋白质和代谢物相互作用的精确分析。这种方法可用于无标签或氨基酸标签的定量质谱方法,以识别复杂生物样品中的蛋白质-代谢物相互作用或使用纯化蛋白质。该协议针对分析来自锥虫病的布鲁氏蛋白进行了优化,但可以适应相关的原生动物寄生虫、酵母或哺乳动物细胞。
Introduction
肌醇磷酸盐 (IP) 和磷酸磷酸(PIs) 通过调节细胞过程(如控制基因表达1、2、3、囊泡贩运)在真核生物中起着核心作用4,信号转导5,6,代谢7,8,9,和发育8,10。这些代谢物的调节功能源于它们与蛋白质相互作用的能力,从而调节蛋白质功能。当蛋白质结合后,IP和P可能改变蛋白质构象11,催化活性12,或相互作用13,从而影响细胞功能。IP 和 P 分布在多个亚细胞室中,如核2、3、14、15、内质神经质16、17、等离子体膜1和细胞醇18,要么与蛋白质3,19或与RNA20相关。
磷脂酶C的膜相关PI(4,5)P2的裂解导致Ins(1,4,5)P3的释放,该P3可分别通过IP激酶和磷酸酶进行磷酸化或脱磷。IP 是可溶性分子,可与蛋白质结合并发挥调节功能。例如,元群中的Ins(1,4,5)P3可以通过与IP3受体结合,作为第二信使,诱导受体构象变化,从而从细胞内存储11释放Ca2+。Ins(1,3,4,5)P4与组蛋白脱乙酰酶复合物结合,并调节蛋白质复合组装和活性13。IP调节功能的其他例子包括染色质组织控制21、RNA传输22、23、RNA编辑24和转录1、2、3.相反,PIs通常与血浆膜或细胞膜25中蛋白质的招募有关。然而,PIs的一个新兴特性是在非膜环境中与蛋白质关联的能力3,15,19,26。这是核受体类固醇因子的情况,其转录控制功能受PI(3,4,5)P319和聚A聚合酶的酶,酶活性由核PI(4,5)P226调节。IP和P的调节作用已在许多生物体中显现出来,包括酵母22,27,哺乳动物细胞19,23,果蝇10和蠕虫28。重要的是这些代谢物在锥体中的作用,它很早就偏离了真核系。这些代谢物在锥虫细胞瘤布鲁氏转录控制1,3,发育8,细胞器生物发生和蛋白质流量29,30中起重要作用,31,32,还参与控制病原体T.cruzi33、34、35、弓形虫36和疟原虫的发育和感染5,37.因此,了解IP和P在锥体中的作用可能有助于阐明这些分子的新生物功能,并确定新的药物靶点。
蛋白质和IP或PI结合的特异性取决于蛋白质相互作用域和肌醇13、38的磷酸化状态,尽管与PI脂质部分的相互作用也发生19。I 和 P 的种类及其修饰的激酶和磷酸酶为控制蛋白质功能提供了灵活的细胞机制,该机制受代谢物可用性和丰度、肌醇磷酸化状态和蛋白质的影响交互的亲和力 1,3,13,38。虽然某些蛋白质域具有很好的特征39、40、41, 例如, 普列克斯特林同源域42和 SPX (S YG1/Pho81/XPR1) 域43 ,44,45,一些蛋白质与IP或P通过机制仍然未知相互作用。例如,T.Brucei的抑制剂激活蛋白1(RAP1)缺乏规范的PI结合域,但与PI(3,4,5)P3相互作用,并控制与抗原变异3有关的基因的转录。对来自锥体、酵母或哺乳动物细胞的IP或PI相互作用蛋白的亲和色谱和质谱分析,确定了几种没有已知IP或PI结合域的几种蛋白质8,46。47.数据表明,与这些代谢物结合的其他未定性蛋白质域。因此,识别与IP或P相互作用的蛋白质可能会揭示蛋白质-代谢物相互作用的新机制,以及这些小分子的新细胞调节功能。
此处描述的方法采用亲和色谱与西方印迹或质谱相结合,以识别与 IP 或 P 结合的蛋白质。它使用生物回位化 IP 或 P,它们要么与链球菌珠联结成交结,要么通过链球蛋白结合的磁珠捕获(图 1)。该方法提供了一个简单的工作流程,是敏感的,非放射性的,无脂素体,适合检测来自细胞泄漏或纯化蛋白质3的蛋白质结合(图2)。该方法可用于无标签8、46或与氨基酸标签定量质谱47耦合,以识别复杂生物样品中的IP或PI结合蛋白。因此,这种方法是研究IP或P与细胞蛋白相互作用的少数方法的替代方法,将有助于了解这些代谢物在锥体中,也许在其他真核生物中的调节功能。
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Protocol
1. 通过亲和色谱和西方印迹分析IP或PI结合蛋白
- 细胞生长、致莱和亲和色谱
- 将T.布鲁氏细胞生长到中日志阶段,并监测细胞的存活性和密度。总共 5.0 x 107个细胞足以进行一次结合测定。
- 对于血液形式,在HMI-9培养基中生长细胞,在37°C和5%CO2下辅以10%的胎儿牛血清(FBS)。使细胞密度保持在 8.0 x 105至 1.6 x 106细胞/mL 之间。
注:密度高于1.8 x 106细胞/mL可能会影响细胞活力。在体外生长的T.Brucei 427菌株的双倍时间在5.5至6.5小时之间。 - 对于前循环形式,在SDM-79培养基中生长细胞,在27°C下辅以10%FBS,并将细胞密度保持在1.0 x 107和3.0 x 107细胞/mL之间。
- 对于纯化蛋白质(例如重组蛋白),服用0.5至1μg的蛋白质,在450μL的结合缓冲液(25 mM HEPES,150 mM NaCl,0.2% 4-非基苯基-聚乙烯乙二醇,pH 7.4)中稀释。保留5%的稀释蛋白(输入),用于西方斑点分析。继续执行步骤 1.1.7。
- 对于血液形式,在HMI-9培养基中生长细胞,在37°C和5%CO2下辅以10%的胎儿牛血清(FBS)。使细胞密度保持在 8.0 x 105至 1.6 x 106细胞/mL 之间。
- 在室温 (RT) 下,在 1,600 x g下离心细胞 10 分钟。丢弃上清液。
注: 有关大型文化卷离心的其他信息,请参阅步骤 2.1.2。 - 轻轻将颗粒重新悬浮在10 mL的磷酸盐缓冲盐水pH 7.4中,补充6 mM葡萄糖(PBS-G),并在37°C预热以洗涤细胞。然后,在RT处以1,600 x g将细胞离心5分钟。重复两次。
- 将颗粒悬浮在 PBS-G 的 1 mL 中。然后,将体积转移到1.5 mL管和离心机在1,600 x g5分钟。丢弃上清液。
注:细胞颗粒可闪冻结在液氮中,并储存在-80°C或液氮。 - 在0.5 mL的赖氨酸缓冲液中重新悬浮颗粒(25 mM HEPES,150 mM NaCl,1% t-oct-oct-oct-phoxy聚乙氧乙醇,pH 7.4),辅以1.5x蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1x磷酸酶抑制剂鸡尾酒(材料表)在冰中预冷却至使细胞被感染。孵育解毒在4°C下在50rpm下旋转10分钟。
注:这是一个关键步骤,因为如果不按照指示处理,蛋白质可能会降解。如有必要,通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS/PAGE) 检查蛋白质赖糖的完整性。
注意:T-八氯氧乙二醇有毒,可引起皮肤和眼睛刺激。使用手套、护目和面罩防护。 - 在 4°C 下在 14,000 x g下将莱沙离心 10 分钟。将上清液收集到新的1.5 mL管中,用于结合测定。保留总液干(输入)的5%,用于西方印迹分析。上清液含有用解液缓冲液提取的寄生虫蛋白。
- 收集 50 μL 的 IP 或 P 与角胶珠(即 50 μL 的浆料)或 50 μL 的角质珠,并在 1,000 x g下离心 1 分钟。丢弃上清液,重新悬浮在50 μL的结合缓冲液中,以平衡珠子。使用非偶联珠作为控件。使用具有不同磷酸盐配置(包括非磷酸化形式)的 IP/PI 磁珠来控制非特定相互作用。
- 在细胞中加入50 μL的IP或PI-珠(细胞源化或纯化蛋白(每1mL的珠子含有10 nmol的偶联IP或PI)。将 IP 或 PI 磁珠的体积保持在总液合的 10% 以内,如有必要,使用结合缓冲液调整结合反应体积。
- 对于竞争测定,在结合反应中加入各种浓度的非偶联IP或PI(例如,与IP或PI珠相比,1倍、10倍、100倍摩尔过量)。
- 在4°C下孵育反应1小时或过夜,在50rpm下旋转。
注:根据蛋白质的稳定性,在RT上可以与纯化蛋白结合反应。如果使用与生物锡结合的 IP 或 PI 仅继续步骤 1.1.9.1,否则继续执行步骤 1.1.10。- 在结合反应中加入50 μL的链球菌,在4°C转速下孵育1小时,转速为50rpm。
- 在 4°C 下在 1,000 x g下将混合物离心 1 分钟。去除上清液(流通)并保持颗粒。保留 5% 的上清液用于西方污点分析。
注:如果使用磁珠,则去除上生子并使用磁性支架进行后续的除液(无需离心)。 - 加入1 mL的洗涤缓冲液(25 mM HEPES,300 mM NaCl,0.2% 4-非基苯基聚乙烯乙二醇,pH 7.4),并通过敲击或旋转管重新悬浮树脂(不要使用移液器,因为珠子可以附着在移液器尖端上)。在4°C下在1,000 x g下将反应离心1分钟,并丢弃上清液。重复该步骤,共进行五次处理。
注意:4-非基苯基聚乙烯乙二醇有毒,可引起皮肤和眼睛刺激。使用手套、护目和面罩防护。 - 在珠子中加入50μL的2xLaemmli缓冲液,辅以710mM 2-mercapto乙醇,通过敲击或涡旋混合,使蛋白质洗去。在95°C加热5分钟,然后离心10,000 x g1分钟,并收集上清液(含有洗脱蛋白)。或者,使用 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9 的洗合蛋白,以避免使用 SDS。在-80°C冷冻洗选液,否则进行西斑分析。
注意:2-汞醇有毒,可能导致皮肤、眼睛和呼吸道刺激。使用手套,在化学罩中工作。
- 将T.布鲁氏细胞生长到中日志阶段,并监测细胞的存活性和密度。总共 5.0 x 107个细胞足以进行一次结合测定。
- 西方印迹分析
- 将 15 μL 的输入(从步骤 1.1.6)或流通(从步骤 1.1.10)与 5 μL 的 4x Laemmli 缓冲液混合。在 95°C 下加热输入和流通样品 5 分钟。对于在 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9 中洗脱的样品,将 15 μL 的洗脱液与 5 μL 的 4x 莱姆利缓冲液混合,并在 95°C 下加热 5 分钟。
注: 对于在 2x Laemmli 缓冲液中洗脱的样品,此步骤是不必要的。 - 加载 4-20% SDS/PAGE 凝胶的孔,输入 2.5 μL,2.5 μL 流通,20 μL 洗脱样品,并根据制造商的建议加载蛋白质阶梯。
注:根据感兴趣的蛋白质的分子量选择凝胶百分比。 - 在运行缓冲液中运行 SDS/PAGE 150 V,持续 30-45 分钟,或直到莱姆利缓冲液的蓝色染料位于凝胶末端。
注:运行时间可能因实验室设备而异。 - 从玻璃(或塑料)板中取出凝胶,在转移缓冲液中浸泡15分钟。
- 将蛋白质转移到聚氯乙烯二氟化酶(PVDF)膜或硝化纤维素膜。在转移缓冲液中浸泡膜和 3 mm 滤纸。将三明治与三片滤纸、硝基纤维素或 PVDF 膜、凝胶和另外三张滤纸组装在一起。确保三明治中没有气泡。如有必要,使用滚轮拆下气泡。将膜设置在阴极上,将凝胶放在盒的阳极侧。
注:请查看膜制造商的说明,了解膜激活或斑点制备的信息。 - 将装有三明治的盒内放入带有转移缓冲液的转印罐中。将水箱放入冰桶或 4°C(例如,在冷藏室)。在100 V下转移蛋白质1小时(电流在200-400 mA之间变化)。或者,在4°C下以15 mA的恒定电流过夜。
- 从盒中取出膜。在PBS中用0.05%的聚糖20(PBS-T)或相容的阻滞溶液在PBS中稀释6%的脱脂干牛奶中孵育膜,在RT处孵化1小时,以阻断膜。
注:在阻断膜之前,可以使用Ponceau S染色检查转移的质量。在 Ponceau S 的 15 mL 中孵育膜 1 分钟,在水中冲洗并可视化带。 - 去除阻滞溶液,在RT下孵育膜1小时,在PBS-T稀释的6%非脂干牛奶中稀释的原抗体中旋转50rpm。或者,在 4°C 下以 50 rpm 旋转孵育膜过夜。
注:潜伏时间可能因抗体质量而异;然而,大多数抗体在RT时与1-3小时的孵育工作。 - 在 PBS-T 中孵育膜 5 分钟,在 RT 下旋转 50 rpm,洗净污点。根据抗体的质量,可能需要更多的需要进行护理。
- 在用PBS-T稀释的6%非脂干牛奶中,在6%的脱脂干牛奶中,在6%的脱脂干牛奶中,在50rpm旋转下,在马萝卜过氧化物酶(HRP)中结合的二次抗体中孵育膜1小时。
注:按照制造商的建议进行抗体浓缩或稀释。 - 如步骤 1.2.9 所示,洗净污点。
- 加入化学发光基板以覆盖膜。去除多余的基板,在黑暗中在RT孵育5分钟。
注:请查看制造商的说明,了解有关化学发光试剂的建议。 - 使用基于相机的成像器捕获化学发光信号。或者,使用 X 射线胶片捕获化学发光信号。
- 将 15 μL 的输入(从步骤 1.1.6)或流通(从步骤 1.1.10)与 5 μL 的 4x Laemmli 缓冲液混合。在 95°C 下加热输入和流通样品 5 分钟。对于在 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9 中洗脱的样品,将 15 μL 的洗脱液与 5 μL 的 4x 莱姆利缓冲液混合,并在 95°C 下加热 5 分钟。
2. 通过亲和色谱和质谱分析IP/PI结合蛋白
- 细胞生长、致莱和亲和色谱
- 将T.布鲁氏细胞生长到中日志阶段,并监测细胞的存活性和密度。
注:总共1.0 x 10个10个细胞就足以进行两次结合测定。使用少于此处指示的细胞可能会影响质谱对低丰度蛋白质的检测。- 对于T.布鲁布鲁斯血流形式,在HMI-9介质中生长细胞在中日志阶段(8.0 x 105-1.6 x 106细胞/mL),在37°C时辅以10%FBS,CO2为5%。对于427菌株,5 L培养能产生0.5-1.0 x 1010细胞。监测细胞生长,避免密度高于1.8 x 106细胞/mL,这可能会影响细胞活力。将细胞培养体积保持在烧瓶体积的1/10;否则,细胞的生长速率将因曝气不良而受到影响。
注:427菌株的倍增时间为5.5-6.5小时。 - 对于前循环形式,在SDM-79培养基中生长细胞,在27°C下辅以10%FBS,并将细胞密度保持在1.0 x 107和3.0 x 107细胞/mL之间。500 mL 培养能产生 0.5-1.5 x 1010个细胞。
- 对于T.布鲁布鲁斯血流形式,在HMI-9介质中生长细胞在中日志阶段(8.0 x 105-1.6 x 106细胞/mL),在37°C时辅以10%FBS,CO2为5%。对于427菌株,5 L培养能产生0.5-1.0 x 1010细胞。监测细胞生长,避免密度高于1.8 x 106细胞/mL,这可能会影响细胞活力。将细胞培养体积保持在烧瓶体积的1/10;否则,细胞的生长速率将因曝气不良而受到影响。
- 在RT处以1,600 x g离心细胞15分钟。丢弃上清液,在37°C下重新悬浮在200 mL的PBS-G预热液中。使用圆形底部离心管(材料表),因为使用固定角度离心转子时,T.布鲁西血液形成的颗粒很容易受到干扰。在RT处以1,600 x g再次离心5分钟。
- 去除上清液,在 PBS-G 的 10 mL 中重新悬浮颗粒。在RT处将细胞在1,600 x g下离心5分钟。 重复该过程,最后洗涤后,丢弃上清液。
注:小球可闪冻在液氮中,并储存在-80°C或液氮。 - 在5 mL的赖舍缓冲液中重新悬浮细胞颗粒,在冰中预冷却,并辅以1.5倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1x磷酸酶抑制剂鸡尾酒(材料表)。在 4 °C 转速下以 50 rpm 旋转时孵育奶嘴 10 分钟。
- 在 4°C 下在 10,000 x g下离心 10 分钟。收集上清液(溶解蛋白),并在20 mL的结合缓冲液中稀释。
- 收集400 μL的IP或P与角胶珠(即400μL的浆料)或400μL的控制珠,并在RT的1,000 x g下离心1分钟。丢弃上清液,在400μL的结合缓冲液中重新悬浮,以平衡珠子。使用腺化酶珠作为负对照,确定与非特异性相互作用(例如,非特异性与珠子结合的蛋白质)之间的蛋白质-代谢物相互作用的具体富集。使用具有不同磷酸盐配置(包括非磷酸化形式)的 IP 或 P,以控制由于磷酸盐电荷或与生物锡结合而导致的非特定相互作用。
- 将 400 μL 的 IP/PI 磁珠或控制珠添加到 10 mL 的莱沙中,在 4 °C 转速下孵育 1 小时或过夜。如果使用仅与生物锡结合的 IP 或 P(无珠子)继续步骤 2.1.7.1,否则继续执行步骤 2.1.8。
- 在磁珠中加入100 μL的链球菌,在4°C转速下孵育1小时,转速为50rpm。
- 在4°C下在1,000 x g下将结合反应离心1分钟。去除上清液(流通)并保持颗粒。保留 5% 的上清液用于西方污点分析。
- 将5 mL的洗涤缓冲液加入颗粒中,通过旋转管轻轻混合,然后在4°C下在1000 x g下离心1分钟。丢弃上清液。重复洗涤五次。如果使用磁珠,收集上生子并使用磁性支架进行清场(不需要离心)。
- 向磁珠中加入 50 μL 的 2x Laemli 缓冲液(或 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9,以避免使用 SDS),并通过敲击或涡旋(避免移液,因为珠子可以附着在移液器尖端),然后在 95°C 加热5 分钟。并收集上清液(洗脱的蛋白质)。重复此过程两次以收集总共三个分数。
- 在-80°C冷冻渗漏液,否则在SDS/PAGE中分离蛋白质,或保存在溶液中进行胰蛋白酶化和质谱分析。
- 将T.布鲁氏细胞生长到中日志阶段,并监测细胞的存活性和密度。
- 用于质谱分析的蛋白质的胰蛋白酶消化
注:在蛋白质消化第2.2.1节(凝胶中)或第2.2.2节(溶液中)中,显示了此过程的两种变体。建议蛋白质低结合管,以防止样品损失。咨询蛋白质组学设施的分析化学家,说明该协议适用于样品和质谱仪仪器。- 蛋白质凝胶内胰蛋白酶化
- 在SDS/PAGE中分离蛋白质后,用高纯度水短暂冲洗凝胶。将凝胶转移到干净的玻璃板上。去除蛋白质带与干净的刀片,并避免切割额外的凝胶外带。将凝胶片切成小块(即约 1 mm 正方形),并将其转移到 1 mL 管中。如有必要,请使用移液器尖端,但请务必在使用前用乙醇冲洗移液器尖端。
注意:使用手套避免凝胶污染。凝胶片可储存在-20°C。 - 将 100 μL 的高纯度或高性能液相色谱级水添加到管中,以冲洗凝胶片。丢弃水。
- 对于库马西或基于钛的荧光染色凝胶片,在脱色溶液(25 mM NH4HCO3在50%醋酸酯)中孵育凝胶片1小时,然后丢弃溶液。重复此过程,直到污渍不可见。
注:通过在100mM NH4HCO 3,pH 7.8的库存溶液中稀释,制备含有NH4HCO3的溶液。
注意:醋酸酯是一种挥发性溶剂,易燃易毒性。NH4HCO3可引起皮肤或眼睛刺激。使用手套,在化学罩下工作。 - 对于银染色凝胶片,将50μL的脱色溶液孵育成50μL,用于银渍(15 mM K3[Fe( CN) 6]、50 mM Na 2 S2O3),在水中孵育30分钟。丢弃溶液,用 200 μL 清洗凝胶片水。重复洗涤五次,或直到凝胶黄色不可见。
注意:K3[Fe(CN)6] 可能会导致皮肤或眼睛刺激。使用手套。
- 对于库马西或基于钛的荧光染色凝胶片,在脱色溶液(25 mM NH4HCO3在50%醋酸酯)中孵育凝胶片1小时,然后丢弃溶液。重复此过程,直到污渍不可见。
- 在RT处使用200 μL的醋酸酯脱水凝胶片10分钟。然后,放弃解决方案。
注:脱水凝胶片体积较小、不透明且俗气。如果将几片凝胶组合在一个管中,重复重复有效脱水凝胶片的过程。 - 加入50μL(或足够的体积,以覆盖凝胶片)的还原溶液(100mM NH4HCO3中的10mM二硫硫醇[DTT]),并在56°C孵育1小时。
- 加入50μL(或足够的体积,以覆盖凝胶片)的烷基化溶液(50mM碘乙酰胺在100mM NH4HCO3)和孵育30分钟在RT在黑暗中。之后,丢弃过量的烷基化溶液。
- 在RT处用200 μL的醋酸酯脱水凝胶片10分钟。在RT处取出醋酸酯,用100mM NH4HCO3将凝胶片水合10分钟。
- 在RT处再次用200μL的醋酸酯脱水凝胶片10分钟,并丢弃多余的溶液。
- 加入15μL质谱级胰蛋白酶稀释在50mM NH4HCO3缓冲液中,或足够的体积覆盖水合凝胶片,并在37°C下孵育4小时或过夜。保持胰蛋白酶总量在100至500纳克(或20纳克蛋白/μg) 之间。
- 将样品冷却至RT,在微离心机中以2,000 x g离心1分钟。加入10-20 μL的5%的甲酸稀释在水中,并在RT孵育10分钟。
注意:甲酸是易燃、腐蚀性和有毒的。使用手套,在化学罩下工作。 - 如步骤 2.2.1.9 所示,离心机,然后将上清液(包含提取的肽)收集到不同的管中。将20μL的5%的甲酸稀释在50-60%的醋酸中加入管中,并在RT孵育10分钟。
- 在真空浓缩器中干燥样品,在 10 μL 的 0.5% 醋酸和 2% 醋酸中重组,用于质谱分析。离心机并收集管底的溶液;将溶液储存在-20°C或-80°C。
- 在SDS/PAGE中分离蛋白质后,用高纯度水短暂冲洗凝胶。将凝胶转移到干净的玻璃板上。去除蛋白质带与干净的刀片,并避免切割额外的凝胶外带。将凝胶片切成小块(即约 1 mm 正方形),并将其转移到 1 mL 管中。如有必要,请使用移液器尖端,但请务必在使用前用乙醇冲洗移液器尖端。
- 在蛋白质的溶液胰蛋白化中
- 沉淀蛋白质以减少样品体积、脱盐和缓冲液交换。在样品中加入六卷冷冻(-20°C)丙酮,例如,600 μL的丙酮到100μL的样品中。涡旋并在-20°C孵育15分钟至1小时。溶液将变成多云或形成沉淀物。
注意:丙酮有毒和易燃。使用手套,在化学罩下工作。 - 在4°C下离心样品30分钟,将丙酮干燥,将颗粒气干15分钟。
- 在 50 mM NH4HCO3中加入 10 μL 的 6-8 M 尿素或 1% SDS,以溶解颗粒和涡旋以混合。对于大量蛋白质(>10 μg),使用高达20μL的溶解缓冲液。
- 加入5μL的还原溶液和涡旋。使用微离心机将音量调低。如果样品在尿素中稀释,然后在RT孵育1小时。如果样品在SDS中稀释,然后在56°C下孵育1小时。
- 使用微离心机将音量调低。加入3μL烷基化溶液和涡旋。然后,将音量调低,在黑暗中孵育30分钟。
- 加入3μL的还原溶液,以中和反应。使用 50 mM NH4HCO3将样品慢慢稀释至 1 M 尿素或 0.05% SDS。
注:胰蛋白酶消化缓冲液必须有洗涤剂或变性剂。脱密度剂的浓度限制为:0.05%SDS;0.1% 八角乙基B-D-绿胶体;0.1% 4-非基苯-聚乙烯乙二醇;0.1% t-八苯氧乙二醇乙醇;0.1% 多糖酸 20;0.1% 3-*(3-胆碱丙基)二甲基胺酮-1-丙烷硫化物;< 1 M 尿素或尿素。 - 加入5μL质谱级胰蛋白酶,在50mM NH4HCO3缓冲液中稀释,在37°C下孵育4小时或过夜。使胰蛋白酶总含量保持在100至500纳克(或20纳克蛋白/μg) 之间。
- 将样品冷却至 RT,并使用微离心机将音量调低。加入5%醋酸(或5%的甲酸50%醋酸)来淬火反应。
- 如步骤 2.2.1.11 所示,在真空集中器中干燥样品。将样品储存在-80°C。使用反向相位柱(如 C18 zip-tip)进行脱盐和浓缩肽,然后按质谱法进行分析。
- 沉淀蛋白质以减少样品体积、脱盐和缓冲液交换。在样品中加入六卷冷冻(-20°C)丙酮,例如,600 μL的丙酮到100μL的样品中。涡旋并在-20°C孵育15分钟至1小时。溶液将变成多云或形成沉淀物。
- 蛋白质凝胶内胰蛋白酶化
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Representative Results
亲和力色谱与西方印迹对RAP1和PI(3,4,5)P3相互作用的分析
此示例说明了此方法的应用,通过T. 布鲁氏酸酶或重组T. 布鲁比RAP1 蛋白分析 RAP1 对 PI 的结合。T. 布鲁西亚血流形式的流合物形成表达血凝素 (HA) 标记 RAP1 用于结合测定.RAP1是一种参与转录控制变异表面糖蛋白(VSG)基因3,48的蛋白质,它编码了抗原变异49中参与寄生虫免疫逃逸的表面蛋白。RAP1在二分位蛋白复合物内与磷脂酰二醇5-磷酸酶(PIP5Pase)酶3相互作用,该酶在控制VSG基因转录1,3中也具有功能。RAP1有一个N端乳腺癌1卡博基终端(BRCT)域,其次是骨髓细胞增多(myb)DNA结合域和C-端霉菌样域3,48。但是,它缺少规范的 PI 绑定域。结合测定对非磷酸化或磷酸化的PIs在肌醇环的不同位置和非结合的抗胶抗胶珠进行。西方分析表明,RAP1优先结合PI(3,4,5)P3-珠(图3A),但它也与PI(4,5)P2珠的绑定程度较小。然而,它不绑定到任何其他的P或Agarose珠子。由于RAP1是多蛋白复合物3的一部分,它与某些PIs的相互作用可能不是直接的,因此是RAP1-HA与其他细胞蛋白结合到PIs相互作用的结果。
因此,为了测试RAP1是否直接结合到PIs,一个C端标记6x-他的重组RAP1(rRAP1)蛋白质被表达和纯化为均质从大肠杆菌3。该蛋白用于PI(3,4,5)P3-珠结合测定,在PI(3,4,5)P3或PI(4,5)P2的竞争性浓度下。西方印迹显示,PI(3,4,5)P3浓度的增加,但不抑制RRAP1与PI(3,4,5)P3的相互作用(图3B)。此外,在反应中加入T.布鲁西纯化PIP5Pase酶,通过rRAP1恢复PI(3,4,5)P3结合,这是由于PIP5Pase脱磷化游免费PI(3,4,5)P33,从而表明该的磷化模式代谢物对rRAP1结合至关重要。因此,rRAP1 与 PI(3,4,5)P3 相互作用,就像它从T. 布鲁西亚莱沙中执行 RAP1-HA 一样。此外,数据显示,从分酶结合的RAP1-HA与PI(4,5)P2可能是由于RAP1与复合物中其他蛋白质(例如PIP5Pase)3相互作用的结果。这些数据说明了结合测定与细胞赖量和重组蛋白的互补性。它还显示了竞争结合测定以确定蛋白质和PIs之间相互作用的特异性的效用。
通过亲和色谱和质谱鉴定Ins(1,4,5)P3结合蛋白
在此示例中,使用亲和色谱法,然后进行质谱法,以识别与 Ins(1,4,5)P3 结合的T. 布鲁氏蛋白;因此,实验调查了来自T.布鲁布鲁斯血流中的潜在Ins(1,4,5)P3结合蛋白。T. 布鲁氏溶酶与Ins(1,4,5)P3结合到腺胶珠或非结合珠子(用作对照),结合蛋白与莱姆利样品缓冲液洗脱。SDS/PAGE分析显示,与对照腺胶珠中洗脱的蛋白质相比,从Ins(1,4,5)P3-珠洗脱的蛋白质富集(图4A)。对250种蛋白质的洗脱蛋白进行了质谱分析,其中84种与对照珠相比富于Ins(1,4,5)P3珠(图4B,折变[FC] = 2,p<0.05)。 与对照珠相比,与Ins(1,4,5)P3结合的蛋白质的富集与SDS/PAGE检测到的蛋白质信号相关。这些数据包括经验证为结合Ins(1,4,5)P3的蛋白质和与Ins(1,4,5)P3结合机制未知的蛋白质8。此外,Ins(1,4,5)P3结合蛋白酶与Ins(1,3,4,5)P4和其他PIs8的结合蛋白酶有很大的不同,这表明其中一些蛋白质能够识别Ins(1,4,5)P3的特定磷酸盐配置。因此,生物锡标记 Ins(1,4,5)P3 可用于亲和色谱学与质谱学结合,以识别与 Ins(1,4,5)P3 结合的蛋白质。可以探索这种方法来识别与其他IP或P3、8、46、47结合的蛋白质。
图 1:用于结合测定的亲和试剂。(A) PI(3,4,5)P3(上)和因斯(1,4,5)P3(底部)与生物锡结合在肌醇的sn1位置。在 PI(3,4,5)P3 中,生物锡在肌醇的 sn1 位置与脂质链结合,而在 Ins(1,4,5)P3 中,生物锡与位置 sn1 的磷酸盐结合。(B) Ins (1,4,5)P3 与生物锡结合,通过与链球菌(如腺胶或磁珠)结合捕获。这些试剂的变异使用定制的合成链接剂,以取代生物锡也是可能的46。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:协议工作流程描述了分析IP或PI与T.布鲁布鲁斯蛋白的亲和性相互作用以及(A)西方印迹或(B)质谱检测的步骤。AC-WB、亲和色谱和西印;交流MS、亲和色谱和质谱。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:将T.布鲁氏RAP1与磷化物结合。(A) 表达 HA 标记的 RAP1 的T. 布鲁西亚(5.0 x 107寄生虫) 的脂酸物在 4°C 下孵育 2 小时,体内有 50 μL 的 PIs(每 1 mL 的甘蔗糖珠含有 10 nmol 的偶代)或阿甘草 (Ag) 珠子。结合反应用2个Laemmli样品缓冲液洗净,在95°C加热5分钟。蛋白质在4-20%SDS/PAGE中分离,转移到PVDF膜中,并用单克隆抗体抗HA(1:5,000,稀释6%PBS-牛奶)进行探查。通过抗小鼠IgG-HRP(1:5,000,稀释在6%PBS-牛奶中),并通过化学发光检测。(B) 在 RT 中孵育一克 rRAP1 1 小时,在存在或不存在 5 至 50 μM 二醇甘油 (diC8) PI(3,4,5)P3 时,使用 50 μL PI(3,4,5)P3, 20 至 50 μM diC8 PI(4,5)P2,或 50 μM diC8 PI(3,4,5)P3 和 250 ng PIP5Pase 纯化从T.布鲁西血液形成3。用小鼠抗HISP单克隆抗体(1:2,000,在6%PBS-牛奶中稀释)进行西方印迹分析,并通过化学发光开发。这个数字已由Cestari等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:与Ins(1,4,5)P3结合的T.布鲁氏蛋白的亲和色谱和质谱分析。(A) 10% SDS/PAGE 分析与 Ins(1,4,5)P3 珠或阿加辛珠结合的T.布鲁氏蛋白。5.0 x 109种寄生虫的脂量在 4°C 下孵育 2 小时,与 400 μL 的 Ins(1,4,5)P3 与角糖珠或无 Ins(1,4,5)P3 的阿甘草珠结合使用,P3 [1 mL 的珠子含有 10 nmol 的偶联因(1,4,5)P3]。结合反应洗涤,洗净在2 x莱姆利样品缓冲液中,在95°C下煮5分钟。蛋白质在10%的SDS/PAGE中分离,并沾染了库马西染色(材料表)。箭头显示与腺胶珠相比,在Ins(1,4,5)P3-珠中富集的蛋白质;圆圈表示 Ins(1,4,5)P3-珠和Agarose珠中存在的蛋白质,括号表示存在于这两个中但比腺胶珠高在 Ins(1,4,5)P3-珠中富集的蛋白质。(B) 点图显示质谱鉴定的蛋白质,与腺胶珠相比,在Ins(1,4,5)P3-珠中富集。由 FC > 2 和p-值 <0.05 定义的扩充。四个生物复制用于腺苷酸-珠AC-MS,三个生物复制用于IP3-珠AC-MS. IP3-珠与腺苷当中识别的蛋白质的折叠变化使用肽光谱强度使用MSstat50计算。详细的结果和肽列表有8。质谱原始数据也可通过 PRIDE 合作伙伴存储库通过 ProteomeXchange 联盟通过标识符 PXD005907 获得。这个数字已由Cestari等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
识别与IP或P结合的蛋白质对于理解这些代谢物的细胞功能至关重要。与西印体或质谱结合的亲和色谱提供了识别IP或PI相互作用蛋白的机会,从而获得对其调节功能的见解。IP 或 P 化学标记 [例如,Ins(1,4,5)P3 化学上与生物蛋白相关]并通过链球蛋白与腺糖珠交联,或由链球蛋白磁珠捕获,从而可以分离相互作用的蛋白质,然后通过质量识别这些蛋白光谱学或西方污点。这里描述的修饰已经被用来识别来自T.Brucei3,8和哺乳动物细胞47的蛋白质,这些细胞与这些代谢物结合。使用定制标签(生物锡以外的)的方法的变体也被用于酵母46。这种方法的一个重要考虑因素是使用控制来区分特定交互和非特定交互。非偶联珠是一种基本控制,但附加控制可能包括非磷酸化PIs或肌醇结合到珠3。具有不同磷酸盐组合的I或PI3,8也可用于,因为与这些代谢物结合的蛋白质可能涉及区分肌醇38的磷酸盐配置的域。 39,40,41.此外,样品复杂性可能会影响方法的敏感性,因此通过样品分馏降低样品复杂性可能有助于检测细胞中低丰度蛋白质。有关于细胞分馏和分离线粒体51,核52,糖体53和旗子54,55从锥体分离的既定协议。 请注意,可能需要调整用于亚细胞分馏的缓冲液和试剂,以便与该协议中使用的缓冲液和试剂兼容。值得注意的是,通过亲和色谱鉴定与IP或P结合的蛋白质取决于相互作用的蛋白质和代谢物亲和力,因此,对IP或P的亲和力较弱的蛋白质可能不容易检测到。
对IP或PI与细胞莱沙蛋白相互作用的分析还可能导致识别不直接与这些代谢物结合的蛋白质,但蛋白质与与IP结合的其他蛋白质在复合中相互作用的结果或 PIs。这一特性如图3A所示,其中来自T.布鲁氏乳沙的RAP1-HA似乎与PI(3,4,5)P3-珠和PI(4,5)P2-珠结合。然而,与His标记的rRAP1结合测定表明,这种蛋白质与PI(3,4,5)P3结合,而不是PI(4,5)P23。如图3 B所示,其中竞争检测表明,免费PI(3,4,5)P3但不自由PI(4,5)P2竞争rRAP1-他与PI(3,4,5)P3-珠的相互作用。RAP1似乎与PI(4,5)P2-珠相互作用是由于RAP1与结合PI(4,5)P2(例如PIP5Pase)3的蛋白质的复合体中的RAP1关联。因此,来自细胞莱沙的结合测定可以识别直接或间接与IP或P结合的蛋白质。值得注意的是,间接相互作用不同于非特异性相互作用,因为前者可能具有影响或受代谢物结合影响的生物功能(在蛋白质复合物中)。例如,Ins(1,4,5,6)P4绑定到多亚单位共压抑制酶复合物,并控制复杂的组装和活动13。因此,验证IP/PI与蛋白质的相互作用至关重要。相互作用的验证可能涉及具有过量 IP 或 P 的竞争检测(如图 3B)3、8、潜在蛋白质域的突变56,或使用纯化蛋白确定直接交互(图3A,B)3。
研究蛋白质和IP或PI相互作用的其他方法包括蛋白质与放射性标记IP或PI结合,使用IP或PI结合到疏水膜作为蛋白质捕获的基质,或蛋白质与结合在脂质体中的PI结合42,57,58.重要的是,如果蛋白质与PIS的相互作用需要膜结构38,基于脂质体的测定可作为补充方法。这些方法的局限性包括低通量、低灵敏度、IP 或 P 与矩阵58关联的未知化学方向,或使用放射性物质42。此处描述的方法具有敏感性、无脂素、无放射性,并且 IP/PI 磁珠已上市,因此不需要定制化学合成。此外,与IP或P相关的生物素的位置是明确的,它也可以修改46,58,从而能够精确分析蛋白质和代谢物相互作用。此处描述的方法还可以与定量质谱方法相结合,如细胞培养中氨基酸的稳定同位素标签(SILAC)47,该方法可用于识别不同细胞下的动态相互作用治疗或条件。与西印体或质谱学耦合的亲和色谱有助于识别来自T.Brucei、哺乳动物细胞和酵母3、8、46的众多IP或PI结合蛋白。 47,包括没有IP-或PI结合域特征的蛋白质,它还有助于识别新的结合域,例如PI(3,4,5)P3结合域47。
总体而言,本文描述的协议可用于调查来自T.Brucei的潜在IP或PI相互作用蛋白,并研究蛋白质与这些代谢物的分子相互作用。该协议可以很容易地调整,以识别来自其他单细胞寄生虫或其他生物体(如哺乳动物细胞47和酵母46)的IP或PI结合蛋白,这将有助于进一步理解IP和真核生物中的PIs。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC,RGPIN-2019-04658)的支持;NSERC 发现发布早期职业研究人员补充 (DGECR-2019-00081) 和由麦吉尔大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
| Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
| Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
| Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent - control |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
| Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
| HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
| Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
| Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
| Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
| LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
| Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
| PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
| PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
| PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
| SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
| T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
| Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
| Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
| Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
| 2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |
References
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
- Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
- Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
- Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
- Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
- Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
- Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
- Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
- Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
- Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
- Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
- Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
- Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
- Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
- Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
- Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
- Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
- Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
- Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
- York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
- Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
- Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
- Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
- Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
- Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
- Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
- Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
- Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
- Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
- Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
- Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
- Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
- Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
- Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
- Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
- Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
- Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
- Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
- Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
- Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
- Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
- Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
- Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
- Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
- Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
- Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
- Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
- Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).
