En integreret celle manipulerings platform er udviklet til brug sammen med en enkelt-Probe massespektrometri setup til on-line analyse af individuelle affjedrings celler under omgivende forhold.
Enkelt celle massespektrometri (SCMS) muliggør følsom detektion og nøjagtig analyse af brede intervaller af cellulære arter på individuelt celleniveau. Enkelt-sonden, en mikroskala prøveudtagning og ioniserings anordning, kan kobles med et massespektrometer til on-line, hurtig SCMS analyse af cellulære bestanddele under omgivende forhold. Tidligere, enkelt-sonde SCMS teknik blev primært brugt til at måle celler immobiliseret på et substrat, der begrænser de typer af celler til undersøgelser. I den aktuelle undersøgelse er single-Probe SCMS-teknologien blevet integreret med et celle manipulerende system, der typisk anvendes til in vitro-befrugtning. Denne integrerede celle manipulerings-og analyseplatform bruger en celle Valgs sonde til at indfange identificerede individuelle flydende celler og overføre cellerne til enkelt probespidsen til mikroskala lysis efterfulgt af umiddelbar massespektrometri analyse. Denne opsamling og overførsel proces fjerner cellerne fra den omgivende løsning før analyse, minimerer indførelsen af matrix molekyler i massespektrometri analyse. Denne integrerede opsætning er i stand til SCMS analyse af målrettede patient-isolerede celler til stede i kropsvæsker prøver (f. eks urin, blod, spyt, osv.), giver mulighed for potentielle anvendelser af SCMS analyse til humanmedicin og sygdoms biologi.
Den menneskelige biologi, især sygdoms biologi, bliver i stigende grad opfattet som et resultat af aktiviteter på de enkelte cellers niveau, men de traditionelle analytiske metoder, såsom Liquid kromatografi massespektrometri (LCMS), anvendes generelt til at analysere prøver fremstillet af populationer af celler, hvorimod de erhvervede molekylære oplysninger ikke præcist kan repræsentere de kemiske processer på det individuelle celleniveau. Disse standard, traditionelle metoder er ude af stand til at skelne virkningerne af cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og processen med at ødelægge og blande cellerne til at forberede lysatet potentielt fører til ændring eller tab af cellulære komponenter1,2. Disse begrænsninger af de traditionelle metoder er især vigtige i analysen af patient celler, hvor de opnåede prøver kan indeholde en kompleks blanding af mange forskellige celletyper. For at afhjælpe disse mangler udvikles og anvendes der i stigende grad enkelt celle molekylære metoder, herunder enkelt celle massespektrometri (SCMS)-metoder, til bioanalyse, især af cellulære metabolitter og lav molekylvægt biomolekyler3,4.
De første SCMS teknikker udviklet brugt vakuum-baserede teknikker til at udføre analyserne under ikke-omgivende betingelser2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-omgivende SCMS teknikker er i stand til at analysere cellulære lipider og metabolitter, men kræver prøve forbehandling under kunstige betingelser, og derfor er ikke egnet til real-time analyse. Prøve forberedelsesprocessen for ikke-omgivende analyse omfatter tilsætning af matrixkomponenter, og dette præparat kan ændre cellulære komponenter fra deres naturlige miljø12. Derfor anvendes omgivende massespektrometri (MS) teknikker, som ikke kræver et vakuum til prøvetagnings miljøet, til at analysere celler i et nærmiljø. Ikke at have et vakuum miljø giver mulighed for alsidighed i den eksperimentelle design; kameraer kan tilføjes for at overvåge den cellulære proces og blødere ioniserings teknikker kan kombineres med adskillelse teknikker til at modtage bedre information fra hvert enkelt celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 af41,42.
Single-Probe SCMS-metoden er en omgivende teknik, der analyserer levende, pattedyrs Cancer cellelinjer i et nær-Native miljø21,43,44,45,46. Desuden har enkelt Probe-anordningen været anvendt til andre massespektrometri-applikationer, herunder analyse af ekstracellulære molekyler i flercellede sfæroider og MS Imaging af væv47,48,49 ,50,51,52. Men da celle immobilisering på substrater er nødvendig for denne metode, kan affjedrings celler ikke analyseres direkte ved hjælp af denne teknik3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med enkelt sonde ikke anvendes direkte til at udtage prøver af ikke-klæbende enkeltceller, såsom ikke-vedhæng ende cellelinjer eller ophængs celler isoleret fra patientens blod eller andre kropsvæsker54. I dette arbejde, en integreret celle manipulation platform (ICMP) er kombineret med enkelt-Probe SCMS teknik til at analysere levende, suspension celler on-line med minimal Prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består af en inverteret mikroskop til at overvåge cellevalg, en glas celle-selektions sonde, en mikroinjektor til at indfange individuelle flydende celler, en opvarmet plade til at opretholde cellulære temperatur, to celle manipulation systemer til at styre rumlige bevægelser af både glas celle-selektions sonden og enkelt sonde, og et digitalt mikroskop for at observere celle overførsel fra celle Valgs sonden til enkelt sondespidsen. Fremstillingen af Single-sonden er beskrevet i tidligere publikationer og vil ikke blive behandlet her21,48. ICMP/single-Probe systemet er koblet til et massespektrometer med høj opløsning. Denne integrerede opsætning giver mulighed for prøvetagning af identificerede enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimal effekt fra matrix molekyler.
Den integrerede celle manipulation og analyseplatform er konstrueret til at udvide alsidigheden af enkelt-sonde MS-metoden, der giver mulighed for on-line, hurtig analyse af ikke-vedhængende celler i et nær-Native miljø. En stor fordel ved teknikken er, at minimal prøveforberedelse er nødvendig, så cellerne analyseres under forhold, der efterligner deres standardtilstand. Især, individuelle celler af interesse kan visuelt identificeres og udvælges, minimere indflydelsen af matrix effekt på MS ionisering effektivitet samtidig bevare celler i deres naturlige miljø, så resultaterne er mere repræsentative celler ‘ Native status (figur S3). Denne teknik kan potentielt bruges til at studere patient celler suspenderet i biofluider i fremtidige undersøgelser. En anden fordel ved denne teknik er den fleksible udvælgelse af prøve opløsningsmidlet. Det er vigtigt at inkludere acetonitril som det vigtigste prøve opløsningsmiddel, således at der hurtigt kan forekomme mikroskopi. Potentielt kan interne standarder (f. eks. isotopisk mærkede lægemidler) tilsættes til prøvetagnings opløsningsmidlet til kvantificering af interesse molekyler (f. eks. lægemiddel molekyler) fra individuelle celler, herunder dem, der kan spille en central rolle i at revolutionere behandling af lægemidler i fremtiden54.
Selv om dette integrerede system bekvemt kan anvendes til at analysere brede celleområder, er en begrænsning af metoden, at hverken enkelt sonde-eller celle Valgs sonden er kommercielt tilgængelig; dikterer behovet for optimering af mange parametre (f. eks. strømningshastighed, spænding, længde mellem Nano-ESI-emitter og ionoverførings slanger osv.) før hvert eksperiment. På grund af den lille enkelt sonde-og celle Valgs sonde kan miljøforstyrrelser (f. eks. luftstrøm) desuden medføre vanskeligheder med at etablere et kryds mellem de to sonder. En kortsigtet løsning er bøjning af cellen-selektions sonde tæt på enden for at minimere længden af nedtrapning. Fremtidigt arbejde omfatter udvikling af en bolig til at omslutte de kritiske dele af opsætningen for at minimere miljømæssige virkninger. På grund af den begrænsede mængde af cellulære indhold og korte anskaffelses tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan kun udføres for relativt rigelige arter. Andre faktorer, der påvirker detektionsfølsomhed omfatter den undertrykte ionisering effektivitet på grund af indførelsen af matrix sammen med cellen og potentielle ion tab gennem den udvidede ion Transfer slange.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Naga Rama kothapalli for hendes arbejde med at udvikle prøveforberedelse til både suspension celler og celle lysat eksperimenter. Desuden vil forfatterne takke NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.
Acetontrile | Millipore Co. | AX0145-1 | Sampling solvent |
CellTram Vario | Eppendorf | 6221 | ICMP |
Copper wire | stores.ebay.com/jewelerheaven | Dead soft, round, 20 guage, 25 ft | Conductive union setup |
Digital stereomicroscope | Shenzhen D&F Co. | Supereyes T004 | Analysis |
Disposable micropipette, 1-5 µL | Rochester Scientific | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" | Friedrich & Dimmock, Inc. | MBT-005-020-2Q | Single-probe fabrication |
Epoxy resin | Devcon | Part No. 20945 | Single-probe fabrication |
Eppendorf cell manipulation system | Eppendorf | Transferman NK517800397-U.R. | ICMP |
External nut | VALCO*CHEMINERT | EN1 | Ion transfer tube fabrication |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388-500ML | Sampling solvent |
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm | Polymicro Technologies | TSP040105 | Single-probe fabrication, conductive union setup |
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm | Polymicro Technologies | 1068150015 | Conductive union setup |
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) | Fischer Sci | SH3006603 | Cell culture |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC | M-520 | Conductive union setup |
Laser puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Single-probe fabrication |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment | LY-C240 | Single-probe fabrication |
LTQ Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ Orbitrap XL | Analysis |
Microforge | Narishige, Co. | MF-9 | Cell-selection probe fabrication |
Microunion | IDEX Health & Science LLC | M-539 | Conductive union |
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1576 | Conductive union setup |
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1577 | Conductive union setup |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies | 15140-122 | Cell culture |
Petri dish, 35×10 mm | VWR | 25382-334 | Sample preparation |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 0780-50L | Cell culture |
Platinum wire | Narishige, Co. | Model PT-A | Microforge |
Power supply | Nikon | PSM-2120 | ICMP |
RPMI, 1X with Corning glutagro | Corning | 10-104-CV | Cell culture |
Single-bore tubes | Boralex | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD | IDEX Health & Science LLC | VHP-200-01x | Ion transfer tube fabrication |
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm | IDEX Health & Science LLC | U-1128 | Ion transfer tube fabrication |
Syringe, 250 µL | Hamilton | 1725LTN250UL | Sampling syringe |
T25 flask | CellStar | 690160 | Cell culture |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective | PB5500 | Analysis |
ThermoPlate | TokaiHit | 55R30N | ICMP |
TrypLE Express | Gibco | 12605-010 | Cell culture |
Tube cutter, for 1/16" stainless steel | SUPELCO | 58692-U | Ion transfer tube fabrication |
USB digital photography microscope | dx.com | SO2 25~500X | Analysis |
UV curing resin | Prime Dental | Item No. 006.030 | Single-probe fabrication |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Cell-selection probe fabrication |
Voltage housing | PicoChip | PCH-A00120 | ICMP/MS interface |
Wire cutter | Craftsman | 4 1/2 in end nipper | Conductive union setup |