Vi beskriver en metod för beredning av den enda nyligen isolerade detrusor glatta muskelceller från mänskliga urinblåsan exemplar använder en tvåstegs enzymatisk procedur. De erhållna livskraftiga DSM-cellerna kan studeras av olika tekniker med en cell, inklusive den beskrivna amphotericin-B-plåster-clampelektrofysiologi för att avslöja fysiologiska och farmakologiska egenskaper.
Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler som finns i urinblåsan väggen underlättar i slutändan urinlagring och voiding. Beredning av livskraftiga, färska och isolerade DSM-celler utgör en viktig teknisk utmaning vars prestation ger optimala celler för efterföljande funktionella och molekylära studier. Den metod som utvecklats och utarbetats häri, framgångsrikt används av vår grupp i över ett decennium, beskriver dissekering av mänskliga urinblåsan exemplar som erhållits från öppna urinblåsan operationer följt av en enzymatisk tvåstegsbehandling av DSM bitar och mekanisk trituration för att få nyligen isolerade DSM celler. Det första steget innebär dissekering för att separera DSM-skiktet (även känd som muscularis propria) från slemhinnor (urothelium, lamina propria och muscularis slemhinna) och den intilliggande bindväv, vaskulära och fettvävnader närvarande. DSM skärs sedan i bitar (2-3 mm x 4-6 mm) i nominell Ca2+-innehållande dissektion/matsmältningslösning (DS). DSM bitar överförs nästa till och sekventiellt behandlas separat med DS innehållande papain och kollagen vid ~ 37 °C för 30-45 min per steg. Efter tvättar med DS innehållande enzymfritt bovint serum och trituration med en brandpolerad pipett, bitarna släppa enstaka DSM celler. Nyisolerade DSM-celler är idealiska för plåster-klämma elektrofysiologiska och farmakologiska karakteriseringar av jonkanaler. Närmare bestämt visar vi att TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi minskar spänningssteg framkallade katjonströmmar registreras med amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. DSM celler kan också studeras av andra tekniker såsom encelliga RT-PCR, microarray analys, immunocytokemi, in situ närhet ligering analys, och Ca2 + imaging. Den största fördelen med att använda enstaka DSM-celler är att de observationer som gjorts avser direkt med visade enstaka cellegenskaper. Studier av nyligen isolerade mänskliga DSM celler har gett viktiga insikter som kännetecknar egenskaperna hos olika jonkanaler inklusive katjon-genomsläpplig i urinblåsan och kommer att fortsätta som en guldmyntfot i belysa DSM cellulära egenskaper och regleringsmekanismer.
Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler utgör den mest rikliga celltypen i urinblåsan och slutligen kontrollera urinlagring och tomning genom avslappning och sammandragning, respektive. DSM-celler bildar glatta muskelbuntar som sammanflätas med intilliggande bindväv, nervprocesser, interstitiella celler och andra celltyper1. Den nuvarande förståelsen av dsm-cellernas roll i urinblåsans funktion har uppnåtts genom en multi-level integrerad strategi. Varje experimentell metod – oavsett om den baseras på isolerade enstaka celler in vitro, vävnadsremsor som innehåller glatta muskelbuntar in vitro/ex vivo, eller in vivo-bestämningar (t.ex. cytometri- och voidingfunktionbedömningar) – ger viktiga och specifika insikter om fysiologiska och farmakologiska egenskaper hos DSM (se recensioner1,2,3,4,5,6 för detaljer). Tolkning av resultat från isolerade enstaka celler gör det dock möjligt att särskilt tillskriva slutsatser till själva celltypen. Denna insikt har varit drivkraften för att etablera en tillförlitlig och reproducerbar metod för att få nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken urinblåsan exemplar. Till skillnad från många andra celltyper kan glatta muskelceller inte tillförlitligt odlas på grund av förlusten av deras inhemska fenotyp inklusive specifika förändringar i deras elektrofysiologiska och kontraktila egenskaper7,8. Detta faktum förstärker ytterligare vikten av studier som utförts på fysiologiskt aktiva nyisolerade DSM-celler.
I slutet av 1980-talet och början av 1990-talet publicerade Isenbergs grupp (Tyskland) en rad elektrofysiologiska studier på nyisolerade DSM-celler som erhållits från urinblåsor9,10,11,12,13 ( tabell1). Metoden belyste två viktiga observationer som hjälpte till att få vitala celler och fungerade som en första riktlinje för andra att följa. De var 1) förbehandling isolerade DSM bitar med Ca2 +-fri lösning / medium före enzymatisk behandling och 2) vävnad matsmältning med en lösning som innehåller kollagen. Dessa två kritiska steg har införlivats i alla efterföljande varianter av DSM-celldissociationsprocedurer(tabell 1). För närvarande använder vår grupp en tvåstegs sekventiell papain-collagenase dissociation strategi. DSM bitar behandlas först med en enzymlösning som innehåller papain och sedan med kollagen typ II löslig i samma lösning (DS, dissekering / matsmältningslösning). Detta tillvägagångssätt ger enstaka DSM-celler från olika arter, inklusive marsvin, gris, råtta, mus och huvudsakligen människa(tabell 1).
Enstaka DSM-celler ger en källa för flera molekylärbiologi och fysiologiska experiment. Hittills har protein- och mRNA-uttryck studerats med immunocytokemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestämningar visade höga nivåer av detektion för olika jonkanaler, inklusive den stora ledningsspänningen- och Ca2+-aktiverad (BK), liten ledningsenhet Ca2+-aktiverad K+ typ 3 (SK3), spänningsinstiftade K+ (Kv),L-typ spänningsstyrd Ca2+ (Cav) och transientreceptorpotential melastatin typ 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na/Ca2+ utbyte 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De är alla tänkt att kontrollera DSM retbarhet, intracellulära Ca2 + nivåer och kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiska metoder, utförs direkt på marsvin, mus, råtta eller mänskliga DSM celler, tillhandahålls direkt demonstration av biofysiska och farmakologiska egenskaper av L-typ Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK och TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tillvägagångssätten inkluderade en konventionell helcellspänningsklämma, en perforerad spänningsklämma och enkanalsinspelningar (cellansluten, inifrån och ut- och utvändiga konfigurationer). Dessutom, membran potentiell inspelning av DSM med hjälp av en ström-klämma som bevis för att mål-engagerande farmakologiska medel ändra cellen retbarhet. TRPM4-hämmaren 9-feantropinducerad hyperpolarisering i DSM-celler som erhållits från människor, marsvin och råttaurinblåsar19,20,22,31. Bland de olika elektrofysiologiska metoderna ger amfotericin-B (och nystatin, gramicidin och β-escin) perforerade patch-clamp inspelningar en viktig fördel genom att bevara inneboende intracellulära signalmolekyler och vägar. Endast lågmolekylära katjoner och i mindre utsträckning, Cl– men inte proteiner eller signalmolekyler inklusive Ca2 + – kan genomföras genom plasmamembranet porer bildas av amphotericin-B eller nystatin32. Det framgångsrika resultatet av perforerade patch-clamp experiment beror på flera allmänna variabler som är unika för denna teknik. Här beskriver vi detaljerna i förfarandet med hjälp av amphotericin-B att vår grupp har använt framgångsrikt under åren15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Förmodligen är icke-selektiva katjonkanaler fortfarande en av de minst förstådda kanaltyperna i DSM-celler. Den första rapporten från en icke-selektiv katjonliknande kanal går tillbaka till 1993. Papperet av Wellner och Isenberg11 beskrev en 33 pS stretch-aktiverad enda kanal som visar följande rang ordning jonpermeabilitet: K+> Na+>Cs+>>>Ba2+> Ca2+, och hämning av kanalaktivitet av Gd3 +, en allmän hämmare av icke-selektiva katjonkanaler. Nästan ett decennium senare beskrev Thorneloe och Nelson40 Na+ permeable katjonströmmar i mus DSM celler, hämmas av Gd3 +, med hjälp av hela cellinspelningar. Eftersom molekylära identiteter av icke-selektiva katjonkanaler och deras biofysiska karakteriseringar återstår att fastställa, är framtida undersökningar inom detta forskningsområde motiverade. Protokollet beskrivs häri för registrering av icke-selektiva kationkanalströmmar – med hjälp av extracellulära och pipette intracellulära lösningar som innehåller Cs+, TEA+och nifedipin (tabell 2) som fysiologiskt och farmakologiskt mildra Kv och Cav strömmar – har varit och kommer att fortsätta att vara användbara i elektrofysiologiska undersökningar av icke-selektiva katjonkanaler. Vi har använt detta specifika protokoll för att fastställa omfattningen av hämning av hela cellen kationströmmar av TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi i marsvin, råtta och mänskliga DSM celler19,20,22.
Sammantaget ger den metod som beskrivs här för att få nyligen isolerade enstaka DSM-celler från mänsklig urinblåsa nappar livskraftiga celler som är mycket lämpliga för elektrofysiologiska undersökningar med hjälp av olika konfigurationer av patch-clamp-tekniken, Ca2+-avbildning, immunocytokemi, in situ proximal rättstvister analys, och encelliga RT-PCR/qRT-PCR samt avanceradmolekylärbiologiska tekniker inklusive mikroarray analys, RNA-seq, och CHIP-seq. Användningen av den perforerade patch-clamp-metoden för amphotericin-B bevarar den inbyggda cellmiljön till skillnad från andra konfigurationer. När de utförs med hjälp av de specifika villkor som beskrivs här, utformade för att förneka bidrag av K+ och Ca2+ strömmar i DSM-celler, spänningssteg inducerad strömmar visar egenskaperna hos icke-selektiva katjonströmmar som lämpar sig för biofysiska och farmakologiska karakteriseringar.
De förfaranden som beskrivs här förklarar de steg som är inblandade i beredningen av livskraftiga, nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken mänskliga urinblåsan exemplar med enzymatisk matsmältning och i inspelningen av hela cellen kation strömmar känsliga för TRPM4 kanalinhibitor 9-feantropi använder amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. Det enzymatiska förfarandet bygger på en tvåstegs sekventiell exponering som häri kallas sekventiell papain-collagenase matsmältningsmetod. DSM vävnader behandlas först med papain och ditiotiotelitol (ett enzym stabiliserande medel) under en nominell Ca2 +-fritt tillstånd, följt i det andra steget av kollagen typ II i närvaro av låg Ca2 +. Motiveringen för att utföra papain matsmältning under låga Ca2 + villkor i glatta muskelceller går tillbaka till slutet av 1980-talet. Nyligen isolerade halspulsådern glatt muskelceller beredda med papain visas en långsträckt form, visade livskraft (motstånd mot trypan blå upptag) och svarade på kontraktil stimuli (högre Ca2 + och histamin)65. År senare tillämpades denna metod vid beredning av DSM-celler (se tabell 1). Valet av kollagen typ II snarare än andra typer avser dess relativt höga proteolytiska aktivitet idealiskför glatt muskelvävnader inklusive DSM. I själva verket kan kollagenbehandling ensam ge enstaka DSM celler om än kräver omfattande enzymexponering (≥60 min)53,54. Eftersom kollagenaktivitet beror på Ca2+ och enzymet är inaktivt under Ca2+-fria förhållanden, kräver optimal enzymatisk matsmältning av DSM-bitar förekomsten av Ca2+ 66. I vårt fall innehåller DS-C 100-200 μM [Ca2+] (tabell 2). Efter enzymatisk behandling tvättas smält DSM bitar försiktigt ett antal gånger med kallt DS utan enzymer eller Ca2+ för att avlägsna alla enzymer bundna till vävnader. Den iskalla DS hjälper till att bevara DSM cell integritet och att begränsa enzymatisk aktivitet av eventuella kvarvarande papain eller kollagen. I det sista steget släpper trituration av enzymbehandlade DSM-bitar med en brandpolerad Pasteur pipette singel-DSM-cell. DSM-celler placeras antingen omedelbart på en inspelningskammare för patch-clamp studier eller andra typer av experiment eller lagras på is i DS för användning senare samma dag (vanligtvis inom 8 timmar efter beredning, men cellerna förblir livskraftiga i upp till 24 timmar).
Vi identifierade flera viktiga överväganden för att framgångsrikt få enstaka DSM-celler. Den första gäller den mänskliga DSM-preparatets källkvalitet. För att optimalt bevara vävnadsintegriteten placeras DSM-prover som erhålls från öppna urinblåsanoperationer i iskalla DS så snart som möjligt och upprätthålls i en kall miljö. Specifikt, vid kirurgisk extraktion från patienten, urinblåsan exemplaret placeras omedelbart på ett helt förberett sidobord i operationssalen. Bruttoundersökning av hela exemplaret (vanligen erhålls under radikaleller enkel cystectomy) och dess öppning följa. Efter visuell inspektion avlägsnas ett helt tjockleksurinstegeexemplar från ett avlägset område av preparatet grovt oinvolverat med tumör och placeras omedelbart i en kopp (antingen 50 eller 100 ml) som innehåller kall (~4 °C) Dissektionslösning (DS) (tabell 2) och sedan tätt stängd med lock. På grund av den planerade karaktären av skördav vävnaden, operationsrummet personal och extra personal gör skörden varnas i början av det kirurgiska fallet för att få material tillgängliga i operationssalen vid tidpunkten för vävnadutvinning. Dessa försiktighetsåtgärder tillsammans med den rutinmässiga, repetitiva karaktären av bearbetningsstegen håller den varma ischemitiden för vävnaden – från extraktion till placering i kyld behållare med DS-lösning – till mindre än 5 min. Behållaren placeras sedan i kylskåp eller på is i en kylare för att upprätthålla den kalla miljön och transporteras (iskall) till laboratoriet. När exemplaret anländer i laboratoriet, dissekering och enzymatisk dissociation steg påbörjas. Det är mycket svårt att förutsäga om ett visst DSM-prov kommer att ge högkvalitativa DSM-celler efter enzymatisk dissociation, så vi fortsätter med enzymatiska dissociation steg. I många fall, parallellt med elektrofysiologiska experiment, genomför vår grupp isometriska spänningsinspelningar på DSM-remsor som utarbetats av samma DSM-prover. Vi har funnit att vi vanligtvis kan få högkvalitativa DSM-celler från preparat som också framgångsrikt ger livskraftiga remsor för isometristudier (vår opublicerade observation).
Den andra faktorn avser olika enzym parti variabilities. Vi observerade att för både papain och kollagen typ II, varje gång ett nytt parti enzym kommer från en leverantör, enzymaktiviteten i DS för vävnadsmatsmältning en variera. Vi optimerar därför rutinmässigt enzymkoncentrationen och inkubationsintervallen för varje nytt parti. För att minimera partiets variabilitet bidrag, beställer vi större mängder av samma parti och göra en stor sats av lager lösningar i 2 mL alikvoter av enzymer och lagra dem på ~ -20 ° C tills de används. Med tiden kan dock frysta lager (lagrade upp till 2 veckor) förlora sin enzymatiska verksamhet. Den tredje variabeln avser temperaturen hos enzymmatsmältningsbehandlingar. Enzymatiska aktiviteter av både papain och kollagen display temperaturberoende. Papain och kollagen typ II uppvisar aktivitet i temperaturområden som omfattar normal kroppsfysiologi67,68. Därför strävar vi efter att hålla enzymbehandlingarna stabila vid ~37 °C för att undvika högre temperaturer för att bevara DSM-cellintegriteten. Det fjärde övervägandet gäller variationen i kvaliteten på DSM-celler som finns inom varje beredning som sträcker sig från mycket livskraftiga (uppvisar utmärkta klassiska glatta muskelegenskaper) till icke-friska, översmälta celler. Ett långvarigt enzyminkubationsintervall är en av de främsta orsakerna till att få ett stort antal skadade celler. Överdriven enzymbehandlingar försämrar också proteinstrukturer av jonkanaler, receptorer och transportörer, vilket påverkar deras funktionalitet negativt. Tolkning av resultat från enzymatiskt erhållna, nyligen isolerade celler bör bära denna hänsyn i åtanke. Optimering av enzymmatsmältningsförhållanden syftar till att öka andelen mycket livskraftiga celler. Experimentella metoder som förlitar sig på ett högre antal livskraftiga celler såsom mikroarrayanalyser kräver mer robusta optimeringar än de som framgångsrikt utförs på färre celler som encellig patch-clamp elektrofysiologi eller Ca2 + imaging. Hänsyn till de ovannämnda faktorerna har väglett våra forskningsinsatser under det senaste decenniet för att få högkvalitativa enda DSM-celler.
Den perforerade patch-clamp tekniken har varit en stöttepelare elektrofysiologisk strategi i över ett kvarts sekel. Flera publikationer innehåller närmare uppgifter om de tekniska övervägandena69,70,71,72,73. Cellperforering kan erhållas med amphotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se referens32för översikt över varje). Den största fördelen med perforerade patch-clamp inspelningar över andra elektrofysiologiska metoder är att den inhemska intracellulära miljön – inklusive intracellulära Ca2+ 2+ 2+ 2+och signalmolekyler (t.ex. cAMP, PKA, fosfater och fosfodiesteras) – bevaras. Denna teknik är därför idealisk för att undersöka hela celljonkanalströmmarna och deras regleringsmekanismer under nära fysiologiska förhållanden. En viktig varning är att intracellulär cellsammansättning inte kan styras exakt till skillnad från andra elektrofysiologiska metoder som konventionella hela cellen och enkanals struket-patch (inside- och outside-out) inspelningar. Enligt vår erfarenhet bidrar tre faktorer rutinmässigt till framgångsrika experimentella resultat av amphotericin-B-perforerade patch-clamp experiment. Den första är kvaliteten på dsm-cellen som valts för att försöka spela in. När DSM-celler är mycket livskraftiga visar en semi-contractil (serpentin-liknande), hög kontrast glänsande utseende med en väldefinierad gloria runt cellytan och fäst tätt på glasbotten av inspelningskammaren sedan giga-tätning formation och cell perforering inträffar relativt lätt. Den andra och tredje faktorerför framgång, respektive, avser kvalitet källa och löslighet av amphotericin-B (i dimetylsulfoxid/DMSO och intracellulär pipettlösning). Vi observerade avvikelser mellan olika leverantörer när det gäller källa och partivariationer. Varje dag förbereder vi en ny lösning av amphotericin-B-stamlösning från pulver följt av dess utspädning i intracellulär pipettlösning. Dessa steg kräver omfattande ultraljudsbehandling och virvelring. Med nytillverkad amphotericin-B-innehållande pipettlösning, framgångsrik cellperforering (+, Ca2+ 2+ 2+ 2+, och icke-selektiva katjonströmmar från celler med människa, marsvin, mus och/eller råtta DSM17,21,22,23,29,30,31,35,60. Här beskriver vi villkoren för registrering av icke-selektiva katjonströmmar i mänskliga DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blockerare av TRPM4-kanaler, försvagade spänningssteg inducerade strömmar som stöder dessa kanalers roll i kontrollen av DSM:s retbarhet. Som en anmärkning kräver det vanligtvis minst 45 min efter att ha fått en giga-tätning och inledande av perforering för att registrera optimala stabila spänningssteg inducerade icke-selektiva katjonströmmar. Spänningsramper kan också användas som ett alternativ till spänningsstegsprotokoll30,64. Här var ett spänningsstegprotokoll från en hyperpolariserad membranpotential att föredra snarare än en rampprotokoll eftersom den tidigare metoden minimerar effekten av spänningsberoende inaktivering och möjliggör i genomsnitt av framkallad ström under en varaktighet spänningssteg där rampen ger en enda datapunkt per spänning. Den senare punkten gäller särskilt mänskliga DSM-celler eftersom strömmarna visar variabel aktivitet under spänningssteg (Figur 5OchFigur 6). Den amphotericin-B perforerade patch-clamp teknik har varit avgörande för att identifiera egenskaperna hos DSM celler och andra celltyper och kommer att fortsätta att medhjälpare i att ge nya upptäckter i framtiden. Dessutom kan nyligen isolerade enstaka DSM-celler framgångsrikt användas för att mäta hela cell En+Cl–och Ca2+ 2+ 2+ 2+strömmar med det konventionella läget för patch-clamp teknik, membran potentiell inspelning med den aktuella klämman, och enstaka kanal inspelningar som exemplifieras av våra tidigare rapporter23,29,35,64.
Förutom encelliga patch-clamp metoder kan nyligen isolerade DSM-celler studeras med andra tekniska metoder, inklusive Ca2+ imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytokemi, in situ närhetligationsanalys och genomiska metoder (t.ex. mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Som enda cell transkriptom bestämningsmetoder fortsätter att utvecklas och bli mycket känsliga, föreställer vi oss i en framtida förmåga att rutinmässigt och specifikt länka elektriska eller farmakologiska egenskaper hos enskilda DSM celler med deras transkriptom / proteom profiler. Detta kommer att uppnås genom första inspelning från en DSM-cell och sedan extrahera mRNA eller protein följt av transkriptomiska/ proteomiska analyser. Även om sådana metoder redan har testats i icke-DSM-celler, är de för närvarande tekniskt utmanande, saknar känslighet som skall betraktas som rutin och begränsas till framgångsrik upptäckt av några utvalda genprodukter74. Funktionsmolekylära profiluttryck som kopplar samman studier när de görs på DSM-celler som erhålls från urinblåsor som härrör från kontroll och sjuka patientgivare kommer att ge insikter i fysiologiska processer som är nödvändiga för att driva normala DSM-funktioner, patogenes och identifiera effektiva nya terapeutiska metoder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-R01DK106964 och P20DK123971 bidrag till Georgi V. Petkov. Författarna tackar Dr Viktor Yarotskyy och Ms Sarah Maxwell för kritisk utvärdering av manuskriptet. Vi är också tacksamma för urologi personal kirurger på MUSC och UTHSC: Drs Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, och Anthony Patterson samt MUSC och UTHSC Urology invånare: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata för deras hjälp med mänsklig vävnad samling.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |