Summary
Vi beskriver en metod för beredning av den enda nyligen isolerade detrusor glatta muskelceller från mänskliga urinblåsan exemplar använder en tvåstegs enzymatisk procedur. De erhållna livskraftiga DSM-cellerna kan studeras av olika tekniker med en cell, inklusive den beskrivna amphotericin-B-plåster-clampelektrofysiologi för att avslöja fysiologiska och farmakologiska egenskaper.
Abstract
Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler som finns i urinblåsan väggen underlättar i slutändan urinlagring och voiding. Beredning av livskraftiga, färska och isolerade DSM-celler utgör en viktig teknisk utmaning vars prestation ger optimala celler för efterföljande funktionella och molekylära studier. Den metod som utvecklats och utarbetats häri, framgångsrikt används av vår grupp i över ett decennium, beskriver dissekering av mänskliga urinblåsan exemplar som erhållits från öppna urinblåsan operationer följt av en enzymatisk tvåstegsbehandling av DSM bitar och mekanisk trituration för att få nyligen isolerade DSM celler. Det första steget innebär dissekering för att separera DSM-skiktet (även känd som muscularis propria) från slemhinnor (urothelium, lamina propria och muscularis slemhinna) och den intilliggande bindväv, vaskulära och fettvävnader närvarande. DSM skärs sedan i bitar (2-3 mm x 4-6 mm) i nominell Ca2+-innehållande dissektion/matsmältningslösning (DS). DSM bitar överförs nästa till och sekventiellt behandlas separat med DS innehållande papain och kollagen vid ~ 37 °C för 30-45 min per steg. Efter tvättar med DS innehållande enzymfritt bovint serum och trituration med en brandpolerad pipett, bitarna släppa enstaka DSM celler. Nyisolerade DSM-celler är idealiska för plåster-klämma elektrofysiologiska och farmakologiska karakteriseringar av jonkanaler. Närmare bestämt visar vi att TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi minskar spänningssteg framkallade katjonströmmar registreras med amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. DSM celler kan också studeras av andra tekniker såsom encelliga RT-PCR, microarray analys, immunocytokemi, in situ närhet ligering analys, och Ca2 + imaging. Den största fördelen med att använda enstaka DSM-celler är att de observationer som gjorts avser direkt med visade enstaka cellegenskaper. Studier av nyligen isolerade mänskliga DSM celler har gett viktiga insikter som kännetecknar egenskaperna hos olika jonkanaler inklusive katjon-genomsläpplig i urinblåsan och kommer att fortsätta som en guldmyntfot i belysa DSM cellulära egenskaper och regleringsmekanismer.
Introduction
Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler utgör den mest rikliga celltypen i urinblåsan och slutligen kontrollera urinlagring och tomning genom avslappning och sammandragning, respektive. DSM-celler bildar glatta muskelbuntar som sammanflätas med intilliggande bindväv, nervprocesser, interstitiella celler och andra celltyper1. Den nuvarande förståelsen av dsm-cellernas roll i urinblåsans funktion har uppnåtts genom en multi-level integrerad strategi. Varje experimentell metod - oavsett om den baseras på isolerade enstaka celler in vitro, vävnadsremsor som innehåller glatta muskelbuntar in vitro/ex vivo, eller in vivo-bestämningar (t.ex. cytometri- och voidingfunktionbedömningar) - ger viktiga och specifika insikter om fysiologiska och farmakologiska egenskaper hos DSM (se recensioner1,2,3,4,5,6 för detaljer). Tolkning av resultat från isolerade enstaka celler gör det dock möjligt att särskilt tillskriva slutsatser till själva celltypen. Denna insikt har varit drivkraften för att etablera en tillförlitlig och reproducerbar metod för att få nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken urinblåsan exemplar. Till skillnad från många andra celltyper kan glatta muskelceller inte tillförlitligt odlas på grund av förlusten av deras inhemska fenotyp inklusive specifika förändringar i deras elektrofysiologiska och kontraktila egenskaper7,8. Detta faktum förstärker ytterligare vikten av studier som utförts på fysiologiskt aktiva nyisolerade DSM-celler.
I slutet av 1980-talet och början av 1990-talet publicerade Isenbergs grupp (Tyskland) en rad elektrofysiologiska studier på nyisolerade DSM-celler som erhållits från urinblåsor9,10,11,12,13 ( tabell1). Metoden belyste två viktiga observationer som hjälpte till att få vitala celler och fungerade som en första riktlinje för andra att följa. De var 1) förbehandling isolerade DSM bitar med Ca2 +-fri lösning / medium före enzymatisk behandling och 2) vävnad matsmältning med en lösning som innehåller kollagen. Dessa två kritiska steg har införlivats i alla efterföljande varianter av DSM-celldissociationsprocedurer(tabell 1). För närvarande använder vår grupp en tvåstegs sekventiell papain-collagenase dissociation strategi. DSM bitar behandlas först med en enzymlösning som innehåller papain och sedan med kollagen typ II löslig i samma lösning (DS, dissekering / matsmältningslösning). Detta tillvägagångssätt ger enstaka DSM-celler från olika arter, inklusive marsvin, gris, råtta, mus och huvudsakligen människa(tabell 1).
Enstaka DSM-celler ger en källa för flera molekylärbiologi och fysiologiska experiment. Hittills har protein- och mRNA-uttryck studerats med immunocytokemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestämningar visade höga nivåer av detektion för olika jonkanaler, inklusive den stora ledningsspänningen- och Ca2+-aktiverad (BK), liten ledningsenhet Ca2+-aktiverad K+ typ 3 (SK3), spänningsinstiftade K+ (Kv),L-typ spänningsstyrd Ca2+ (Cav) och transientreceptorpotential melastatin typ 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na/Ca2+ utbyte 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De är alla tänkt att kontrollera DSM retbarhet, intracellulära Ca2 + nivåer och kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiska metoder, utförs direkt på marsvin, mus, råtta eller mänskliga DSM celler, tillhandahålls direkt demonstration av biofysiska och farmakologiska egenskaper av L-typ Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK och TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tillvägagångssätten inkluderade en konventionell helcellspänningsklämma, en perforerad spänningsklämma och enkanalsinspelningar (cellansluten, inifrån och ut- och utvändiga konfigurationer). Dessutom, membran potentiell inspelning av DSM med hjälp av en ström-klämma som bevis för att mål-engagerande farmakologiska medel ändra cellen retbarhet. TRPM4-hämmaren 9-feantropinducerad hyperpolarisering i DSM-celler som erhållits från människor, marsvin och råttaurinblåsar19,20,22,31. Bland de olika elektrofysiologiska metoderna ger amfotericin-B (och nystatin, gramicidin och β-escin) perforerade patch-clamp inspelningar en viktig fördel genom att bevara inneboende intracellulära signalmolekyler och vägar. Endast lågmolekylära katjoner och i mindre utsträckning, Cl- men inte proteiner eller signalmolekyler inklusive Ca2 + - kan genomföras genom plasmamembranet porer bildas av amphotericin-B eller nystatin32. Det framgångsrika resultatet av perforerade patch-clamp experiment beror på flera allmänna variabler som är unika för denna teknik. Här beskriver vi detaljerna i förfarandet med hjälp av amphotericin-B att vår grupp har använt framgångsrikt under åren15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Förmodligen är icke-selektiva katjonkanaler fortfarande en av de minst förstådda kanaltyperna i DSM-celler. Den första rapporten från en icke-selektiv katjonliknande kanal går tillbaka till 1993. Papperet av Wellner och Isenberg11 beskrev en 33 pS stretch-aktiverad enda kanal som visar följande rang ordning jonpermeabilitet: K+> Na+>Cs+>>>Ba2+> Ca2+, och hämning av kanalaktivitet av Gd3 +, en allmän hämmare av icke-selektiva katjonkanaler. Nästan ett decennium senare beskrev Thorneloe och Nelson40 Na+ permeable katjonströmmar i mus DSM celler, hämmas av Gd3 +, med hjälp av hela cellinspelningar. Eftersom molekylära identiteter av icke-selektiva katjonkanaler och deras biofysiska karakteriseringar återstår att fastställa, är framtida undersökningar inom detta forskningsområde motiverade. Protokollet beskrivs häri för registrering av icke-selektiva kationkanalströmmar - med hjälp av extracellulära och pipette intracellulära lösningar som innehåller Cs+, TEA+och nifedipin (tabell 2) som fysiologiskt och farmakologiskt mildra Kv och Cav strömmar - har varit och kommer att fortsätta att vara användbara i elektrofysiologiska undersökningar av icke-selektiva katjonkanaler. Vi har använt detta specifika protokoll för att fastställa omfattningen av hämning av hela cellen kationströmmar av TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi i marsvin, råtta och mänskliga DSM celler19,20,22.
Sammantaget ger den metod som beskrivs här för att få nyligen isolerade enstaka DSM-celler från mänsklig urinblåsa nappar livskraftiga celler som är mycket lämpliga för elektrofysiologiska undersökningar med hjälp av olika konfigurationer av patch-clamp-tekniken, Ca2+-avbildning, immunocytokemi, in situ proximal rättstvister analys, och encelliga RT-PCR/qRT-PCR samt avanceradmolekylärbiologiska tekniker inklusive mikroarray analys, RNA-seq, och CHIP-seq. Användningen av den perforerade patch-clamp-metoden för amphotericin-B bevarar den inbyggda cellmiljön till skillnad från andra konfigurationer. När de utförs med hjälp av de specifika villkor som beskrivs här, utformade för att förneka bidrag av K+ och Ca2+ strömmar i DSM-celler, spänningssteg inducerad strömmar visar egenskaperna hos icke-selektiva katjonströmmar som lämpar sig för biofysiska och farmakologiska karakteriseringar.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutionella Review Board kommittéer vid University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), och Medical University of South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De godkända förfarandena gör det möjligt att urinblåsan i hela tjockleken (>1 cm x >1 cm) - som innehåller alla lager, inklusive slemhinnor, detrusor glatt muskulatur, och serosa också är fästa blodkärl och fettvävnad) - som skall samlas in från patienter-givare som genomgår kirurgisk partiell extraktion av urinblåsan. Patientgivare är vuxna (åldersintervall som studerats hittills: 25 till 87 år), antingen manliga eller kvinnliga, med eller utan symtom på överaktiv blåsa (enligt American Urological Association I-PSS poäng41). Kirurgiska ingrepp innebär en mängd olika medicinska tillstånd inklusive radikala cystectomy för urothelial carcinom, och adenocarcinom. I sådana fall är det insamlade urinblåsan exemplaret långt från tumörstället.
1. Dissekering av DSM-vävnader och beredning av slemhinnorfria DSM-bitar
- Undersök hela tjockleken urinblåsan exemplar som kom i labbet från operationssalen i en tätt förseglad behållare fylld med den kalla dissekering / matsmältningslösning(figur 1 och tabell 2 för sammansättning av DS).
OBS: Preparatet hålls vanligtvis i kallt DS från några timmar till natten före ankomsten till laboratoriet. För längre lagring kompletteras DS (tabell 2) med 1 mM CaCl2. - Ta bort och skölj den mänskliga hela tjockleken DSM exemplar (som innehåller alla lager inklusive slemhinnor, DSM och serosa) med iskall DS för att tvätta bort fäst skräp och blod.
- Fäst urinblåsan, slemhinnan uppåt och serosa nedåt, på en silikonenantiomerbelagd (Materialformmaterial) 150 mm i diameter rund skål fylld med iskallt DS (figur 1B).
- Ta bort den intilliggande fettvävnaden, blodkärlen, epitelet (urotelet) och muscularisslemhinnan från exemplaret genom skarp dissekering med mikrosax och pincett.
- Klipp ut flera slemhinnans fria DSM-bitar (~2-3 mm lång och 4-6 mm bred) (figur 1C).
2. Enzymatisk dissociation av DSM bitar som ger nyligen isolerade enstaka DSM celler
- Placera 3 till 6 DSM bitar i ett rör som innehåller 1 till 2 ml förvärmd (~ 37 °C) DS innehållande papain och ditiotioreitol (DS-P, tabell 2) och inkubera DSM bitar i DS-P för 30-45 min på ~ 37 °C försiktigt skaka ibland röret (en gång var 10-15 min).
OBS: För att optimalt kontrollera temperaturen för enzymatisk behandling placeras rör med vävnadsbitar och enzymlösningar i antingen en glasvävnadskammare fylld med vatten som är anslutet till ett cirkulerande varmt vattenbad (figur 1D) eller ett högprecisionstemperaturstyrt skakvattenbad (figur 1E). - Ta bort DS-P från röret, tvätta kort DSM bitar med iskall DS, kasta kallt DS från röret lämnar DSM bitar sitter längst ner på röret.
- Tillsätt 1 till 2 ml DS-innehållande kollagentyp II (DS-C, tabell 2) i röret med DSM-bitar, blanda försiktigt; och inkubera i 25-40 min vid ~37 °C skaka försiktigt röret ibland (var 10-15 min).
- Kassera DS-C och tvätta enzymbehandlade DSM-bitar 5-10 gånger med iskall DS.
- Efter den sista tvätten, lämna DS-lösning inuti röret; försiktigt triturate med en brandpolerad Pasteur pipett flera gånger för att släppa enstaka DSM celler.
- Placera några droppar DS-lösning som innehåller dispergerade DSM-celler på en glasbottenskammare eller ett täckglas och inspektera visuellt för kvaliteten under ett mikroskop (med ett mål på 20 x eller 40 x) efter minst 5 minuter efter appliceringen så att cellerna kan följa botten.
- Använd omedelbart nyligen isolerade DSM-celler för elektrofysiologiska experiment eller förvara cellerna i ett rör som innehåller DS vid ~4 °C antingen på is eller i kylskåp tills de används (vanligtvis för upp till 8 timmar beredning).
Obs! Inom samma beredning varierar cellernas kvalitet från mycket livskraftiga till översmälta, döda DSM-celler(figur 2). När sekventiell papain-kollagen metod ger ett mycket stort antal ovibla celler, preparatet kasseras, och en ny matsmältning av DSM bitar utförs men med minskade inkubationsintervall. Om proceduren resulterar i för få DSM-celler sedan för efterföljande nedbrytning av DSM bitar, inkubationsintervallen ökas. Positiv immunreaktivitet för α-smooth muscle actin bekräftar identiteten på DSM-celler(figur 3).
3. Registrering av spänningssteginducerade katjonströmmar från DSM-celler med amphotericin-B perforerad helcellsspänningsklämmateknik
- Pipette 0,25-1 ml cellupphängning på en glasbottenkammare som sitter på ett stadium av ett inverterat mikroskop och låter cellerna hålla sig till glasbotten.
- Efter inkubation i minst 45 min, ta bort DS från badet och byt ut med E-lösningen(tabell 2) genom superfusion där lösningsflödet med hjälp av gravitationgenom inloppsslanger ersätter DS med den nya lösningen medan utloppsslangen ansluten till ett vakuumavfallskärl avlägsnar kammarlösningen och förhindrar spill. Observera att E-lösningen innehåller tetraetylammonium (TEA+) och cesium (Cs+) joner för att hämma K+ strömmar.
- Förbered en arbetsbeståndslösning av amphotericin-B i dimetylsulfoxid (DMSO) (1 mg per 10 μL dmso). För att helt lösa upp amfotericin pulver, sonicate (minst 15 min) och virvel lösningen väl.
OBS: Detta steg tar vanligtvis mindre än 10 min. Upplösning 3-4 mg amphotericin-B i 30-40 μL DSMO i en 1,5 ml mikrocentrifug röret fungerar bra. Högre mängder amphotericin-B kräver mer DSMO lösningsmedel som vanligtvis resulterar i ett längre intervall för blandning och ofullständig löslighet av amphotericin-B fasta partiklar som finns i röret. - Lös stamlösningen av amphotericin-B i pipettlösningen (lösning P, tabell 2) för att erhålla en slutlig koncentration på 200-500 μg/ml. Detta steg kräver omfattande ultraljudsbehandling och virvelring vid en höghastighetsinställning (8-10/10) för ~ 30 till 60 min per steg för att säkerställa optimal blandning och förebyggande av amphotericin-B fällning bildas i pipettlösningen.
Amphotericin-B fälls ut över tid och är ljuskänslig. Den fungerande pipettlösningen som innehåller Amphotericin-B kontrolleras för löslighet, handblandad före pipettfyllning och hålls i mörkret. - Dra flera patch elektroder, brand-polska elektrod tips, och (om det behövs) päls spetsarna med tandvax.
- Fyll spetsen på en patchelektrod med pipettlösningen (lösning P, tabell 2) utan amphotericin-B genom att kort doppa elektroden i lösningen.
- Fyll på elektroden med samma pipettlösning som innehåller amphotericin-B.
- Montera elektroden på en hållare som är ansluten till ett huvudsteg för plåstret.
- Använd en mikromanipulator, placera elektroden strax under ytan av den extracellulära lösningen så att spetsen på elektroden är bara nedsänkt.
- I spänningsklämläget ställer du in hållpotentialen till 0 mV och justerar strömmen till 0 pA med pipettoffsetratten på den kommersiella förstärkaren (Materialtabell).
- Bestäm elektrodresistansen med hjälp av membrantestfönstret/funktionen hos den kommersiella anskaffningsprogramvaran (Table of Materials). Om du vill aktivera klickar du på Verktyg>Membrantest>Spela upp eller en genvägsikon i programvaran. Det bestämda elektrodmotståndet bör ligga inom intervallet 2 till 5 MΩ.
OBS: Membran Testfunktion som tillhandahålls i kommersiella förvärv programvara eller Seal Test alternativ på förstärkaren kan användas för att övervaka elektrodmotstånd genom att tillämpa spänningssteg repetitivt. - Fortsätt övervaka elektrodmotståndet medan elektroden avancerar mot en vald DSM-cell med en mikromanipulator (figur 4A).
Obs! För att betraktas som en livskraftig DSM-cell måste cellen visa spindelformad långsträckt morfologi, en väldefinierad gloria runt cellen, skarpa kanter och semi-contractil (serpentin) utseende. - Vid beröring av cellytan med elektroden - indikerad av en snabb ökning av elektrodresistansen mätt med membrantestfunktionen - bildar en giga-tätning genom att applicera ett mjukt snabbt negativt tryck på elektrodhållaren via slangar. Detta resulterar i ett negativt tryck som skapas på elektrodens spets och som drar cellmembranet i elektrodmedhjälp i bildandet av en giga-tätning eller en mycket tät kontakt mellan elektroden och plasmamembranet (figur 4B).
- När giga-tätningen bildas, kompensera pipettkapacitans genom att justera snabba och långsamma rattar på den kommersiella förstärkaren och övervaka giga-seal stabilitet (läckageström) med hjälp av membrantestfunktionen.
- Låt tiden, vanligtvis 30-60 min, för amphotericin-B att sprida ner pipetten och föras in i plasmamembranet som bildar porer primärt selektiva till monovalenta katjoner. Under detta steg, fortsätt att övervaka giga-tätningen med membrantestfunktionen. Eftersom cellperforering ökar så gör amplituden av kapacitanstransienterna (jämför figur 4B kontra figur 4C visar ingen och effektiv cellperforering) mätt med membrantestfunktionen.
- När plåstretsperforering är optimal (bedömd av stabil seriemotstånd vanligtvis under 50 MΩ) avbryt du ut kapacitanstransienterna genom att justera rattarna för cellkapacitans och seriemotstånd på förstärkaren. Seriekompensation kan också utföras vid denna tidpunkt (figur 4D).
- När stabila spänningssteginducerade katjonströmmar som framkallas i det angivna protokollet observeras, applicera ett sammansatt eller fysiologiskt tillstånd för att testa genom superfusion och registrera svaren för kontroll-, provningstillstånd och washout (om möjligt) med programvara för kommersiellt förvärv.
- Rekordströmmar med ett rutinmässigt spänningsstegsprotokoll som innebär att hålla DSM-celler på -64 eller -74 mV och öka spänningen i steg om 10 mV för 400 eller 500 ms från -94 till +96 eller +106 mV och återgå till innehavspotentialen.
OBS: Membranpotentialvärdena justeras för en vätskekorsningspotential på 14 mV (med P- och E-lösningar, tabell 2). Vätskekorsningens potential erhålls i den kommersiella förvärvsprogramvaran (Table of Materials) genom att klicka(Verktyg>Junction Potentials)och ange koncentrationerna av lösningsjonkomponenter. Ett rampprotokoll kan också användas för att hämta aktuella inspelningar. - Kör spänningsprotokollet i kontinuerlig ~1 min intervall under ett experiment inspelningströmmar för förtilläggskontroll, testtillstånd och washout.
- Rekordströmmar med ett rutinmässigt spänningsstegsprotokoll som innebär att hålla DSM-celler på -64 eller -74 mV och öka spänningen i steg om 10 mV för 400 eller 500 ms från -94 till +96 eller +106 mV och återgå till innehavspotentialen.
4. Dataanalys och visualisering
- Öppna inspelade filer i den kommersiella dataanalysprogramvaran (Table of Materials) för kontroll, testtillstånd och diskning genom att klicka på Arkiv>Öppna data och välja filer av intresse för öppning.
OBS: För analys öppnas och analyseras vanligtvis tre filer (var och en innehållande en enda uppsättning spårningar till en enda protokollkörning) för varje villkor. Svaren är därefter i genomsnitt för att få ett genomsnittligt svar för varje villkor. Den programvara som används för datainsamling innehåller en möjlighet att automatiskt samla in användarspecificerade flera testkörningar och genomsnitt dem för enstaka utdatafil som kan användas som ett alternativ. - Få det genomsnittliga svaret under de senaste 200 ms för den aktuella spår som mäts vid varje spänning; det valda varaktighetsintervallet återspeglar en strömaktivering av strömsteg sett mellan stöd. För att göra det följ stegen nedan.
- Välj en fil av intresse för analys i den kommersiella analysprogramvaran (Table of Materials).
Programvaran placerar den senast importerade filen i sitt aktiva visningsfönster. Den öppna filen visar en serie överlappande spår som erhållits med ett spänningsstegsprotokoll. Som standard visas fyra markörer i det aktiva fönstret (som visar x- och y-värden för den markerade spårningen). - Välj analysområde genom att placera markören 2 i slutet av spänningssteget 400 eller 500 ms och markör1 med intervallet 200 ms innan dess så att analysområdet är 200 ms.
- Få svar för varje spänning genom att klicka på Analysera>Snabbdiagram>IV (eller IV-genvägsikonen) (i snabbfönstret innan du genererar data bekräftar att för y-axelns (aktuella) signalregionalternativ "Markörer na 1..2" och "Mean" är markerade). Klicka på OK om du vill generera I-V-diagrammet och placera data i ett resultatkolumnblad som kan visas genom att komma åt Windows>Resultat.
- Analysera ytterligare filer genom att upprepa steg 4.2.1 - 4.2.3. Klicka på Analysera> Snabbdiagram> IV eller IV-ikonen genväg, välj Lägg till i stället för Ersätt för att lägga till ytterligare data i resultatbladet när du bearbetar spåren.
- Kopiera data till ett kalkylblad genom att markera kolumner av intresse och trycka på CTRL +C för att kopiera och CTRL+V för att klistra in. Lagra kalkylbladet Resultat i det kommersiella analysprogrammet(Table of Materials) i (*.rlt) -format genom att klicka på Arkiv>Spara som.
- Välj en fil av intresse för analys i den kommersiella analysprogramvaran (Table of Materials).
- För varje cell normaliserar du svaren för alla tre förhållandena till värdet av det maximala spänningssteget för förtilläggskontrollen (enligt formeln: Respons-/responskontroll-Max ) och diagram svaren som aktuella (eller aktuelldensitet) värden jämfört med spänningsförhållanden(figur 6).
- I ett kalkylblad svar, bestämma de genomsnittliga svaren som antingen strömmar (pA) eller aktuella tätheter (pA / pF) för kontroll, testtillstånd (i detta exempel, 9-fenanthrol) och washout vid varje spänningsteg.
- Dividera värden för varje spänning för varje tillstånd (kontroll, 9-feantrop, och washout) med maximal kontrollrespons som erhålls vid den högsta spänningen (+96 mV i figur 6) för förtilläggskontrollen enligt formeln: Normaliserat svar för tillstånd(x) = Respons(x)/Responskontroll-Max för (x).
- För sammanfattningsanalys ordnar du data i ett format som enkelt kan kopieras till ett grafiskt program (t.ex.
Representative Results
Enzymatisk dissociation av DSM bitar ger friska nyisolerade DSM celler rutinmässigt används i funktionella och molekylära studier såsom: patch-clamp elektrofysiologi och immunocytokemi. Figur 1 sammanfattar dissekeringsstegen och visualiserar de inställningar som används för temperaturkontroll av enzymatiska behandlingssteg. Figur 2 illustrerar ljusfältsbilder av DSM-celler som erhållits från tre mänskliga urinblåsan exemplar vardera från en annan patient-givare. Friska enstaka DSM-celler kännetecknas av spindelformad morfologi, skarpa väldefinierade kanter, en väldefinierad gloria runt cellen och semi-contractil (serpentin-liknande) utseende när de ses under mikroskopet (se DSM celler demarked av vita pilar i figur 2). De svarar också på kontraktionstimulerande medel som muskarinagonist carbachol eller höga K+ (60 mM) applikationer. DSM-celler visar positiv immunreaktivitet för α-smooth muscle actin som bekräftar deras identitet (figur 3).
DSM-celler är idealiska för patch-clamp elektrofysiologiska undersökningar av jonkanal egenskaper. Här beskriver vi den amphotericin-B perforerade patch-clamp inspelningsmetod med hjälp av pipett och extracellulära lösningar(tabell 2)för att optimalt spela in spänningssteg inducerad katjonkanaler. Under de särskilda förhållanden som används säkerställde blockadav Kv och L-typ Ca2+ strömmar med Cs+/TEA+ respektive nifedipin att dessa joniska komponenter smitningsbidrag till de hela cellspänningsströmmarna eliminerades. Figur 4 respektive figur 5 visar experimentella steg för den amphotericin-B perforerade patch-clamp-metoden och representativa helcellsströmmar mätta antingen med ett spänningssteg som induceras eller ett rampprotokoll i tre olika mänskliga DSM-celler, var och en från en annan patientgivare. Observera att inspelningarna visar en viss grad av variabilitet när det gäller aktuella amplitudeoch yttre rättelse. Ytterligare experiment visade att 9-fenanthrol, en TRPM4-kanalhämmare, effektivt och reversibelt hämmade mänskliga DSM-katjonströmmar vid negativ och positiv spänning (figur 6). Den 9-feantropa känsliga strömkomponenten illustrerar en starkare hämning vid positiva spänningar och yttre rättelse (figur 6C).
Figur 1: Sammanfattning av dissekeringssteg som resulterar i beredning av detrusor smooth muscle (DSM) bitar och installation som används för enzymatisk dissociation. Visas är bilder av: (A) en hel tjocklek mänsklig urinblåsan exemplar tillhandahålls från en öppen urinblåsan kirurgi som främmande kirurgiskt material i iskalla DS, (B)Samma beredning efter fastsättning med ett delvis dissekerat DSM-skikt, (C) DSM bitar av variabeldimensioner som skärs ut från DSM-skiktet redo för enzymatisk rötning (mindre bitar) eller andra experimentella undersökningar (större bitar), (D, E) alternativa inställningar som används för enzymatisk rötning av DSM-bitar som består av antingen (1) ett temperaturstyrt cirkulerande vattenbad som är förenat via slangar till en stor glasvävnadskammare fylld med vatten, en gummihållare för rör, plaströr som innehåller DSM-bitar och enzymlösningar som utarbetats i dissektions-/rötningslösning (DS, antingen DS-P eller DS-C, tabell 2) och en temperatursond kopplad till en display som möjliggör kontinuerlig övervakning (D) eller (2) ett stort vattenfyllt temperaturkontrollerat bad som innehåller en hållare och rör med DSM-delar och enzymlösningar (E ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa ljusfältsbilder av mänskliga nyisolerade DSM-celler som erhållits med hjälp av sekventiell papain-kollagenmatrötningsmetod. - Jag har intesett dig på. Visas är bilder av livskraftiga, fysiologiskt aktiva DSM celler anses lämpliga kandidater för att försöka perforerade patch-clamp inspelningar. - Jag har inte sett digpå. Bilder av icke-livskraftiga eller översmälta celler; sådana celler undveks för patch-clamp experiment. Vita och svarta pilar i paneler (A-H) pekar på DSM-celler som anses livskraftiga respektive icke-bärkraftiga för försök till patchklämmainspelningar. Observera att de svarta pilarna i paneler (A, C och G) pekar på cellfragment (cirkulära bitar) eller små celler som saknar DSM-morfologi och i (H) cellerna verkar bleka och vidgade. Bilder är från tre olika urinblåsan exemplar (A och B: patient-givare källa en, C och D: patient-givare källa två, och E-H: patient-givare källa tre). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uttryck för övergående receptorpotentiell melastatin typ 4 (TRPM4) kanal och α-smooth muscle specifika actin immunreactivities i enda mänskliga DSM celler genom immunocytokemi analys. (A) Visas är konfokala bilder som visar immunocytochemical detektion av TRPM4 kanal proteinuttryck i en mänsklig DSM cell. Röd färgning (nederst till vänster) indikerar TRPM4-kanalproteiner; blå (DAPI) färgning upptäcker cell kärnor (överst till vänster); grön färgning indikerar α-smooth muscle actin (α-SMA, uppe till höger); den sammanslagna bilden (nederst till höger) illustrerar överlappningen av alla tre bilderna. (B)Konfokala bilder som illustrerar förmildrande tionkemisk detektion av TRPM4-kanalproteinuttryck i närvaro av en TRPM4-specifik konkurrerande peptid (CP) i isolerade humana DSM-celler. Blå (DAPI) färgning indikerar cellkärnor (överst till vänster); grön färgning är för α-smooth muscle actin (α-SMA, uppe till höger); den sammanslagna bilden (nederst till höger) illustrerar överlappningen av alla tre bilderna. Resultaten kontrollerades i fyra separata experiment med DSM hela vävnad eller flera DSM-celler isolerade från fyra patienter. Bilder kommer från Hristov et al. (2016)22 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk illustration av steg som är involverade i giga-tätningsbildning och amphotericin-B perforering av mänskliga DSM-celler. Illustreras är rumsliga positioner av en amphotericin-B som innehåller pipett och en DSM cell tillsammans med tillhörande svar för membrantester som erhållits i kommersiella förvärv programvara (Table of Materials) genom att ändra spänningsteg (antingen -10 eller -20 mV i detta exempel) bestämma motstånd. Konfigurationer är: (A) före cellen särbehandling med en elektrod, (B)Efter giga-tätningsbildning erhållen genom placering av amfotericin-B innehållande pipett (amphotericin-B representerat av röda prickar) på cellytan och med förtryck, (C) har den konfiguration på cellen som visas ~45 min efter giga-tätningsbildning, vid denna tidpunkt amphotericin-B har spridit ner pipetten och dess molekyler har satts in i plasmamembranet på spetsen av elektroden bildar permeabla porer, och (D) samma konfiguration som i (C) men med kapacitans transienter avbrytas med hjälp av rattar för hela cellkapacitans och seriemotstånd på förstärkaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Strömströmmar för helcelljonjoner som registrerats med amphotericin-B perforerad patchklämmametod i humana DSM-celler. (A)Ett diagram över spänningsstegsprotokollet illustrerar en hållpotential på -74 mV och spänningssteg på 400 ms varaktighet från -94 till +96 mV som utförs i steg om 10 mV och sedan återföras till -74 mV. (B, C) Representativa strömspår tillsammans med strömtäthetsspänningsytor från två olika mänskliga DSM-celler, var och en från ett annat urinblåsaexemplar/patientgivare som erhållits med det spänningsstegsprotokoll som beskrivs i (A). (D)Ett exempel på ett strömspår som erhållits med ett rampprotokoll (grafiskt representerat i den övre infällingen som spänningsförändring från -94 till +116 mV under en varaktighet på 0,21 mV/ms, innehavspotentialen var -94 mV). Till höger i paneler (B-D) visar diagrammen aktuell densitetsspänningsförhållande för varje DSM-cell som registrerats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: TRPM4-kanalblockerare 9-feantrolmedierad hämning av spänningsstegsinducerade katjonströmmar i mänskliga DSM-celler. (A)Visas är representativa strömmar mätt med det spänningsstegsprotokoll som beskrivs i fig. 5A för styrning, 9-feantropoch washout. (B) Sammanfattning av normaliserade svar kontra spänning för kontroll, 9-feantrop, och washout i sju DSM-celler (från sju olika patientgivare). (CSkillnadsström för 9-feantropkänslig komponent som erhålls genom subtrahering av värdena i närvaro av 9-feantrop (30 μM) från de som anges i (B). Data i (B) och (C) visas som medel med felstaplar för SEM, * skildrar betydelse (p<0.05, parat Elevs test) för jämförelse av kontroll vs 9-feantrop vid varje spänning. Panelerna (A) och(B) har reproducerats från Hristov et al. (2016)22 och använts med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Arter | Information om förfarandet | Referenser | |
| Marsvin | DSM bitar sköljs med Ca2+-fritt medium (i mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 MgCl2, 20 glukos, 50 taurin, uppmätt pCa = 6 (eller 1 mM) och sedan skuren i bitar och behandlas typiskt 90-120 min (4 perioder på 30 min) med enzymmedium (i mM: 130 KOH, 20 taurin, 5 pyruvat, 5 kreatin, 10 mM HEPES, justerat med methansulfonsyra till pH 7.4, 1 mg/ml kollagen, 0,2 mg/ml pronas E, 1 mg/ml fettsyrafri albumin, pCa=4.2 (63 mM) eller 3,7 (200 mM). Enstaka DSM-celler förvarades i Kraft-Bruhe (KB)-medium (i mM: 85 KCl, 30 K2PO4, 5 MgSO4, 5 Na2ATP, 5 K-pyruvate, 5 kreatin, 20 taurin, 5 beta-OH-butyrat, 1 mg/ml fettsyra fri albumin, justerad med KOH till pH 7.2). Alternativ metod: DSM bitar sköljs i 10 min i ca2 +-fritt medium (i mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukos, 20 taurin, 5 HEPES, justerat med NaOH till pH 7.4). Då DSM bitar, inkuberas i samma Ca2 +-fritt medium kompletteras med 5 mg% kollagen, 2 mg% pronas och 100 μM CaCl2 för 2x20 min omrörning. |
Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider m.fl. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore et al. (2004)14 | |
| Marsvin, Landrace gris och mänskliga | DSM bitar pre-inkuberas i 5 min i Ca2 +-fri Krebs lösning skärs sedan i bitar och enzymatiskt smält i Ca2 +-fri Krebs lösning som innehåller 0,5-2 mg/ml kollagen styp I och 0,1-0,5 mg/ml pronas vid 36 °C för 20-30 min ständigt rörd. I vissa fall var smälta bitar ytterligare upprörd av en trubbig tippade pipett eller genom spinning tills ger celler. Isolerade celler förvarades i modifierad Krebs-lösning (beskrivs i Klockner & Isenberg13) och användes normalt inom 3 timmar. Krebs-lösningens sammansättning var (mM): 140 Na+, 6 K+, 2 Ca2+, 1,2 Mg2+, 152,4 Cl-, 10 glukos, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 med Tris. För Ca2+-fri lösning uteslöts Ca2+ och Mg2+ från Krebs-lösningen. | Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40 | |
| Mänskliga | DSM bitar placeras i Ca2 +-fri HEPES Tyrode lösning (i mM: 105,4 NaCl, 20.0 eller 22.3 NaHCO3, 3,6 KCl, 0,9 MgCl2, 0,4 NaH2PO4, 19,5 eller 4,9 HEPES, 5,4 eller 5,5 glukos, 4,5 eller 5,5 Na-pyruvat) och skuren i DSM-bitar. DSM bitar indränkt i en enzymlösning (Ca2+ fri HEPES lösning med 0,7 mg/ml kollagen typ I, 0,7 mg/ml papain, 1 mg/ml albumin) över natten vid 4°C. Remsorna värmdes sedan upp vid 36,5 °C i 15 till 30 min, tvättades och varsamt triturated i färsk lösning. Isolerade celler som förvarades i Ca2+ innehållande HEPES Tyrodes lösning eller användes omedelbart för experiment. | Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos och Fry (1994)41 Fry et al. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu et al. (2002)44 | |
| Marsvin | DSM skuren i bitar i PSS (i mM: 137 NaCl, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0,42 KH2P04, 4,17 NaHCO3, 10 glukos, 10 HEPES, pH 7,4 med NaOH). DSM bitar placeras i 10 min i följande matsmältningslösning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukos, 2 MgCl2och 0,2 CaCl2) och sedan överföras till en injektionsflaska som innehåller samma lösning men med 1 mg/ml kollagen 2, 1 mg/ml trypsinhämmare (ibland utelämnad), 1 mg/ml fettfri bovinalbumin, för ~ 70 min vid 35°C eller ~60 min vid 37°C. Enda DSM celler erhölls genom trituration genom en Pasteur pipett i samma lösning utan kalcium och enzymer. Efter trituration, Ca2 + (1 mM) lades till och cellerna förvarades vid 4 °C. Cellerna användes alltid samma dag. | Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner m.fl. (1997)26 Petkov m.fl. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49 | |
| Försökskanin, mus, råtta och människa | Protokollet använder en tvåstegs enzymatisk dissociation behandling efter skarp dissekering i Ca2 +-fri matsmältninglösning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukos och 2 MgCl2). För det första behandlades DSM-stycken i 25-45 min vid 37°C med 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml ditioerytioretitol och 1 mg/ml bovint serumalbumin i dissociationlösning (i mM: 80 mononatriumglutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2,10 HEPES och 10 glukos, justerat till pH 7.3 med NaOH) och sedan DSM bitar överförs till rötninglösning som innehåller 1-5 mg/ml kollagen xi (Sigma) eller kollagen typ 2, 1 mg/ml bovint serum albumin, 0 eller 1 mg/ml trypsinhämmare och 100 μcam2+, för 6-30 min. Efter inkubation tvättades den smälta vävnaden flera gånger i matsmältningslösning utan enzymer och Ca2+ och sedan försiktigt triturated att ge enstaka glatta muskelceller. | Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz m.al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013)19, 20 Hristov m.fl. (2016)22 Lee m.fl. | |
Tabell 1: Sammanfattning av enzymatiska metoder som används för att isolera enstaka DSM-celler från urinblåsor av olika arter.
| Typ av lösning | Sammansättning (i mM) |
| DS (dissekerings-/matsmältningslösning) | 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2och 11 glukos, pH justerat till 7,4 (med 10 M NaOH) |
| DS-P (Papain-innehållande DS) | DS innehållande 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml ditiotiotrereitol och 1 mg/ml albumin av nötkreatur |
| DS-C (Kollageninnehållande DS) | DS lösning innehållande 1-2 mg/ml kollagentyp II, albumin med 1 mg/ml bovint serum, 0 eller 1 mg/ml trypsinhämmare och 100-200 μM Ca2+ |
| P (Pipette) | 110 CsOH, 110 asparagsyra, 10 NaCl, 1 MgCl2,10 HEPES, 0,05 EGTA och 30 CsCl, pH justerat till 7,2 med CsOH, kompletterat med amfotericin-B (300-500 μg/ml) |
| E (Extracellulär) | 10 tetraetylammoniumklorid (TE), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2,10 HEPES och 10 glukos, pH justerat till 7,3-7,4 med NaOH eller CsOH, och 0,002-3 (2-3 mM) nifedipin |
Tabell 2: Sammansättningar av dissektions-/matsmältningslösning (DS) och pipetter och extracellulära lösningar som används i perforerade patch-clamp experiment.
Discussion
De förfaranden som beskrivs här förklarar de steg som är inblandade i beredningen av livskraftiga, nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken mänskliga urinblåsan exemplar med enzymatisk matsmältning och i inspelningen av hela cellen kation strömmar känsliga för TRPM4 kanalinhibitor 9-feantropi använder amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. Det enzymatiska förfarandet bygger på en tvåstegs sekventiell exponering som häri kallas sekventiell papain-collagenase matsmältningsmetod. DSM vävnader behandlas först med papain och ditiotiotelitol (ett enzym stabiliserande medel) under en nominell Ca2 +-fritt tillstånd, följt i det andra steget av kollagen typ II i närvaro av låg Ca2 +. Motiveringen för att utföra papain matsmältning under låga Ca2 + villkor i glatta muskelceller går tillbaka till slutet av 1980-talet. Nyligen isolerade halspulsådern glatt muskelceller beredda med papain visas en långsträckt form, visade livskraft (motstånd mot trypan blå upptag) och svarade på kontraktil stimuli (högre Ca2 + och histamin)65. År senare tillämpades denna metod vid beredning av DSM-celler (se tabell 1). Valet av kollagen typ II snarare än andra typer avser dess relativt höga proteolytiska aktivitet idealiskför glatt muskelvävnader inklusive DSM. I själva verket kan kollagenbehandling ensam ge enstaka DSM celler om än kräver omfattande enzymexponering (≥60 min)53,54. Eftersom kollagenaktivitet beror på Ca2+ och enzymet är inaktivt under Ca2+-fria förhållanden, kräver optimal enzymatisk matsmältning av DSM-bitar förekomsten av Ca2+ 66. I vårt fall innehåller DS-C 100-200 μM [Ca2+] (tabell 2). Efter enzymatisk behandling tvättas smält DSM bitar försiktigt ett antal gånger med kallt DS utan enzymer eller Ca2+ för att avlägsna alla enzymer bundna till vävnader. Den iskalla DS hjälper till att bevara DSM cell integritet och att begränsa enzymatisk aktivitet av eventuella kvarvarande papain eller kollagen. I det sista steget släpper trituration av enzymbehandlade DSM-bitar med en brandpolerad Pasteur pipette singel-DSM-cell. DSM-celler placeras antingen omedelbart på en inspelningskammare för patch-clamp studier eller andra typer av experiment eller lagras på is i DS för användning senare samma dag (vanligtvis inom 8 timmar efter beredning, men cellerna förblir livskraftiga i upp till 24 timmar).
Vi identifierade flera viktiga överväganden för att framgångsrikt få enstaka DSM-celler. Den första gäller den mänskliga DSM-preparatets källkvalitet. För att optimalt bevara vävnadsintegriteten placeras DSM-prover som erhålls från öppna urinblåsanoperationer i iskalla DS så snart som möjligt och upprätthålls i en kall miljö. Specifikt, vid kirurgisk extraktion från patienten, urinblåsan exemplaret placeras omedelbart på ett helt förberett sidobord i operationssalen. Bruttoundersökning av hela exemplaret (vanligen erhålls under radikaleller enkel cystectomy) och dess öppning följa. Efter visuell inspektion avlägsnas ett helt tjockleksurinstegeexemplar från ett avlägset område av preparatet grovt oinvolverat med tumör och placeras omedelbart i en kopp (antingen 50 eller 100 ml) som innehåller kall (~4 °C) Dissektionslösning (DS) (tabell 2) och sedan tätt stängd med lock. På grund av den planerade karaktären av skördav vävnaden, operationsrummet personal och extra personal gör skörden varnas i början av det kirurgiska fallet för att få material tillgängliga i operationssalen vid tidpunkten för vävnadutvinning. Dessa försiktighetsåtgärder tillsammans med den rutinmässiga, repetitiva karaktären av bearbetningsstegen håller den varma ischemitiden för vävnaden - från extraktion till placering i kyld behållare med DS-lösning - till mindre än 5 min. Behållaren placeras sedan i kylskåp eller på is i en kylare för att upprätthålla den kalla miljön och transporteras (iskall) till laboratoriet. När exemplaret anländer i laboratoriet, dissekering och enzymatisk dissociation steg påbörjas. Det är mycket svårt att förutsäga om ett visst DSM-prov kommer att ge högkvalitativa DSM-celler efter enzymatisk dissociation, så vi fortsätter med enzymatiska dissociation steg. I många fall, parallellt med elektrofysiologiska experiment, genomför vår grupp isometriska spänningsinspelningar på DSM-remsor som utarbetats av samma DSM-prover. Vi har funnit att vi vanligtvis kan få högkvalitativa DSM-celler från preparat som också framgångsrikt ger livskraftiga remsor för isometristudier (vår opublicerade observation).
Den andra faktorn avser olika enzym parti variabilities. Vi observerade att för både papain och kollagen typ II, varje gång ett nytt parti enzym kommer från en leverantör, enzymaktiviteten i DS för vävnadsmatsmältning en variera. Vi optimerar därför rutinmässigt enzymkoncentrationen och inkubationsintervallen för varje nytt parti. För att minimera partiets variabilitet bidrag, beställer vi större mängder av samma parti och göra en stor sats av lager lösningar i 2 mL alikvoter av enzymer och lagra dem på ~ -20 ° C tills de används. Med tiden kan dock frysta lager (lagrade upp till 2 veckor) förlora sin enzymatiska verksamhet. Den tredje variabeln avser temperaturen hos enzymmatsmältningsbehandlingar. Enzymatiska aktiviteter av både papain och kollagen display temperaturberoende. Papain och kollagen typ II uppvisar aktivitet i temperaturområden som omfattar normal kroppsfysiologi67,68. Därför strävar vi efter att hålla enzymbehandlingarna stabila vid ~37 °C för att undvika högre temperaturer för att bevara DSM-cellintegriteten. Det fjärde övervägandet gäller variationen i kvaliteten på DSM-celler som finns inom varje beredning som sträcker sig från mycket livskraftiga (uppvisar utmärkta klassiska glatta muskelegenskaper) till icke-friska, översmälta celler. Ett långvarigt enzyminkubationsintervall är en av de främsta orsakerna till att få ett stort antal skadade celler. Överdriven enzymbehandlingar försämrar också proteinstrukturer av jonkanaler, receptorer och transportörer, vilket påverkar deras funktionalitet negativt. Tolkning av resultat från enzymatiskt erhållna, nyligen isolerade celler bör bära denna hänsyn i åtanke. Optimering av enzymmatsmältningsförhållanden syftar till att öka andelen mycket livskraftiga celler. Experimentella metoder som förlitar sig på ett högre antal livskraftiga celler såsom mikroarrayanalyser kräver mer robusta optimeringar än de som framgångsrikt utförs på färre celler som encellig patch-clamp elektrofysiologi eller Ca2 + imaging. Hänsyn till de ovannämnda faktorerna har väglett våra forskningsinsatser under det senaste decenniet för att få högkvalitativa enda DSM-celler.
Den perforerade patch-clamp tekniken har varit en stöttepelare elektrofysiologisk strategi i över ett kvarts sekel. Flera publikationer innehåller närmare uppgifter om de tekniska övervägandena69,70,71,72,73. Cellperforering kan erhållas med amphotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se referens32för översikt över varje). Den största fördelen med perforerade patch-clamp inspelningar över andra elektrofysiologiska metoder är att den inhemska intracellulära miljön - inklusive intracellulära Ca2+ 2+ 2+ 2+och signalmolekyler (t.ex. cAMP, PKA, fosfater och fosfodiesteras) - bevaras. Denna teknik är därför idealisk för att undersöka hela celljonkanalströmmarna och deras regleringsmekanismer under nära fysiologiska förhållanden. En viktig varning är att intracellulär cellsammansättning inte kan styras exakt till skillnad från andra elektrofysiologiska metoder som konventionella hela cellen och enkanals struket-patch (inside- och outside-out) inspelningar. Enligt vår erfarenhet bidrar tre faktorer rutinmässigt till framgångsrika experimentella resultat av amphotericin-B-perforerade patch-clamp experiment. Den första är kvaliteten på dsm-cellen som valts för att försöka spela in. När DSM-celler är mycket livskraftiga visar en semi-contractil (serpentin-liknande), hög kontrast glänsande utseende med en väldefinierad gloria runt cellytan och fäst tätt på glasbotten av inspelningskammaren sedan giga-tätning formation och cell perforering inträffar relativt lätt. Den andra och tredje faktorerför framgång, respektive, avser kvalitet källa och löslighet av amphotericin-B (i dimetylsulfoxid/DMSO och intracellulär pipettlösning). Vi observerade avvikelser mellan olika leverantörer när det gäller källa och partivariationer. Varje dag förbereder vi en ny lösning av amphotericin-B-stamlösning från pulver följt av dess utspädning i intracellulär pipettlösning. Dessa steg kräver omfattande ultraljudsbehandling och virvelring. Med nytillverkad amphotericin-B-innehållande pipettlösning, framgångsrik cellperforering (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+, Ca2+ 2+ 2+ 2+, och icke-selektiva katjonströmmar från celler med människa, marsvin, mus och/eller råtta DSM17,21,22,23,29,30,31,35,60. Här beskriver vi villkoren för registrering av icke-selektiva katjonströmmar i mänskliga DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blockerare av TRPM4-kanaler, försvagade spänningssteg inducerade strömmar som stöder dessa kanalers roll i kontrollen av DSM:s retbarhet. Som en anmärkning kräver det vanligtvis minst 45 min efter att ha fått en giga-tätning och inledande av perforering för att registrera optimala stabila spänningssteg inducerade icke-selektiva katjonströmmar. Spänningsramper kan också användas som ett alternativ till spänningsstegsprotokoll30,64. Här var ett spänningsstegprotokoll från en hyperpolariserad membranpotential att föredra snarare än en rampprotokoll eftersom den tidigare metoden minimerar effekten av spänningsberoende inaktivering och möjliggör i genomsnitt av framkallad ström under en varaktighet spänningssteg där rampen ger en enda datapunkt per spänning. Den senare punkten gäller särskilt mänskliga DSM-celler eftersom strömmarna visar variabel aktivitet under spänningssteg (Figur 5OchFigur 6). Den amphotericin-B perforerade patch-clamp teknik har varit avgörande för att identifiera egenskaperna hos DSM celler och andra celltyper och kommer att fortsätta att medhjälpare i att ge nya upptäckter i framtiden. Dessutom kan nyligen isolerade enstaka DSM-celler framgångsrikt användas för att mäta hela cell En+Cl-och Ca2+ 2+ 2+ 2+strömmar med det konventionella läget för patch-clamp teknik, membran potentiell inspelning med den aktuella klämman, och enstaka kanal inspelningar som exemplifieras av våra tidigare rapporter23,29,35,64.
Förutom encelliga patch-clamp metoder kan nyligen isolerade DSM-celler studeras med andra tekniska metoder, inklusive Ca2+ imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytokemi, in situ närhetligationsanalys och genomiska metoder (t.ex. mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Som enda cell transkriptom bestämningsmetoder fortsätter att utvecklas och bli mycket känsliga, föreställer vi oss i en framtida förmåga att rutinmässigt och specifikt länka elektriska eller farmakologiska egenskaper hos enskilda DSM celler med deras transkriptom / proteom profiler. Detta kommer att uppnås genom första inspelning från en DSM-cell och sedan extrahera mRNA eller protein följt av transkriptomiska/ proteomiska analyser. Även om sådana metoder redan har testats i icke-DSM-celler, är de för närvarande tekniskt utmanande, saknar känslighet som skall betraktas som rutin och begränsas till framgångsrik upptäckt av några utvalda genprodukter74. Funktionsmolekylära profiluttryck som kopplar samman studier när de görs på DSM-celler som erhålls från urinblåsor som härrör från kontroll och sjuka patientgivare kommer att ge insikter i fysiologiska processer som är nödvändiga för att driva normala DSM-funktioner, patogenes och identifiera effektiva nya terapeutiska metoder.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-R01DK106964 och P20DK123971 bidrag till Georgi V. Petkov. Författarna tackar Dr Viktor Yarotskyy och Ms Sarah Maxwell för kritisk utvärdering av manuskriptet. Vi är också tacksamma för urologi personal kirurger på MUSC och UTHSC: Drs Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, och Anthony Patterson samt MUSC och UTHSC Urology invånare: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata för deras hjälp med mänsklig vävnad samling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
| 9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
| Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
| Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
| Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
| Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
| Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
| Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
| Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
| Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
| Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
| DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
| Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
| Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
| Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
| MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
| MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
| Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
| Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
| Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
| PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
| pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
| Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
| Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
| Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
| Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
| Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
| Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |
References
- Andersson, K. E., Arner, A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 84 (3), 935-986 (2004).
- Brading, A. F., Brain, K. L. Ion channel modulators and urinary tract function. Urinary Tract. Andersson, K. E., Michel, M. C. 202, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. Part of Handbook of Experimental Pharmacology book series 375-393 (2011).
- Brading, A. F. Spontaneous activity of lower urinary tract smooth muscles: correlation between ion channels and tissue function. Journal of Physiology. 570, Pt 1 13-22 (2006).
- Brading, A. F., Heaton, J. P., Hashitani, H. A survey of commonalities relevant to function and dysfunction in pelvic and sexual organs. International Journal of Impotence Research. 20 (1), 1-16 (2008).
- Petkov, G. V. Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction. Nature Reviews Urology. 9 (1), 30-40 (2012).
- Andersson, K. E. Treatment-resistant detrusor overactivity--underlying pharmacology and potential mechanisms. International Journal of Clinical Practice Supplement. 151, 8-16 (2006).
- Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 165 (2), 627-632 (2001).
- Kropp, B. P., et al. Characterization of cultured bladder smooth muscle cells: assessment of in vitro contractility. Journal of Urology. 162 (5), 1779-1784 (1999).
- Bonev, A., Isenberg, G. Arginine-vasopressin induces mode-2 gating in L-type Ca2+ channels (smooth muscle cells of the urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 420 (2), 219-222 (1992).
- Schneider, P., Hopp, H. H., Isenberg, G. Ca2+ influx through ATP-gated channels increments [Ca2+]i and inactivates ICa in myocytes from guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 440, 479-496 (1991).
- Wellner, M. C., Isenberg, G. Properties of stretch-activated channels in myocytes from the guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 466, 213-227 (1993).
- Wellner, M. C., Isenberg, G. Stretch-activated nonselective cation channels in urinary bladder myocytes: importance for pacemaker potentials and myogenic response. Experientia Supplementum. 66, 93-99 (1993).
- Klockner, U., Isenberg, G. Action potentials and net membrane currents of isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 405 (4), 329-339 (1985).
- Moore, E. D., et al. Organization of Ca2+ release units in excitable smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. Biophysical Journal. 87 (3), 1836-1847 (2004).
- Hristov, K. L., Chen, M., Kellett, W. F., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels regulate human detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (4), 903-912 (2011).
- Afeli, S. A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. SK but not IK channels regulate human detrusor smooth muscle spontaneous and nerve-evoked contractions. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (4), 559-568 (2012).
- Hristov, K. L., et al. Kv2.1 and electrically silent Kv channel subunits control excitability and contractility of guinea pig detrusor smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (2), 360 (2012).
- Afeli, S. A., Malysz, J., Petkov, G. V. Molecular expression and pharmacological evidence for a functional role of Kv7 channel subtypes in Guinea pig urinary bladder smooth muscle. PLoS One. 8 (9), 75875 (2013).
- Smith, A. C., et al. TRPM4 channel: a new player in urinary bladder smooth muscle function in rats. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 304 (7), 918-929 (2013).
- Smith, A. C., et al. Novel role for the transient potential receptor melastatin 4 channel in guinea pig detrusor smooth muscle physiology. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 304 (5), 467 (2013).
- Hristov, K. L., Smith, A. C., Parajuli, S. P., Malysz, J., Petkov, G. V. Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel regulation by protein kinase C in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (5), 460-470 (2014).
- Hristov, K. L., et al. Novel regulatory mechanism in human urinary bladder: central role of transient receptor potential melastatin 4 channels in detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310 (7), 600-611 (2016).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (1), 45-58 (2014).
- Montgomery, B. S., Fry, C. H. The action potential and net membrane currents in isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 147 (1), 176-184 (1992).
- Parajuli, S. P., Soder, R. P., Hristov, K. L., Petkov, G. V. Pharmacological activation of small conductance calcium-activated potassium channels with naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine decreases guinea pig detrusor smooth muscle excitability and contractility. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 340 (1), 114-123 (2012).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels regulate action potential repolarization in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (1), Pt 1 110-117 (1997).
- Petkov, G. V., Nelson, M. T. Differential regulation of Ca2+-activated K+ channels by beta-adrenoceptors in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288 (6), 1255-1263 (2005).
- Herrera, G. M., Etherton, B., Nausch, B., Nelson, M. T. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa channels in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 289 (2), 402-409 (2005).
- Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
- Provence, A., Angoli, D., Petkov, G. V. Kv7 channel pharmacological activation by the novel activator ML213: role for heteromeric Kv7.4/Kv7.5 channels in guinea pig detrusor smooth muscle function. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 364 (1), 131-144 (2018).
- Parajuli, S. P., et al. Control of urinary bladder smooth muscle excitability by the TRPM4 channel modulator 9-phenanthrol. Channels (Austin). 7 (6), 537-540 (2013).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques: From Beginning to Advanced Protocols. Okada, Y. 4, Springer. Tokyo, Japan. 71-83 (2012).
- Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Regulation of transient receptor potential melastatin 4 channel by sarcoplasmic reticulum inositol trisphosphate receptors: Role in human detrusor smooth muscle function. Channels (Austin). 11 (5), 459-466 (2017).
- Hristov, K. L., et al. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (11), 1632-1641 (2012).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Petkov, G. V. Inhibition of phosphodiesterases relaxes detrusor smooth muscle via activation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (9), 1361-1370 (2012).
- Hristov, K. L., et al. Neurogenic detrusor overactivity is associated with decreased expression and function of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels. PLoS One. 8 (7), 68052 (2013).
- Hristov, K. L., Parajuli, S. P., Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Nongenomic modulation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels by estrogen: A novel regulatory mechanism in human detrusor smooth muscle. Physiological Reports. 5 (14), (2017).
- Parajuli, S. P., et al. Functional link between muscarinic receptors and large-conductance Ca2+ -activated K+ channels in freshly isolated human detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 467 (4), 665-675 (2015).
- Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
- Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties of a tonically active, sodium-permeable current in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 286 (6), 1246-1257 (2004).
- Barry, M. J., et al. The American Urological Association symptom index for benign prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American Urological Association. Journal of Urology. 148 (5), 1549-1557 (1992).
- Klockner, U., Isenberg, G. Calcium currents of cesium loaded isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea pig). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 405 (4), 340-348 (1985).
- Klockner, U., Isenberg, G. Tiapamil reduces the calcium inward current of isolated smooth muscle cells. Dependence on holding potential and pulse frequency. European Journal of Pharmacology. 127 (3), 165-171 (1986).
- Weidelt, T., Isenberg, G. Augmentation of SR Ca2+ release by rapamycin and FK506 causes K+-channel activation and membrane hyperpolarization in bladder smooth muscle. British Journal of Pharmacology. 129 (7), 1293-1300 (2000).
- Inoue, R., Brading, A. F. The properties of the ATP-induced depolarization and current in single cells isolated from the guinea-pig urinary bladder. British Journal of Pharmacology. 100 (3), 619-625 (1990).
- Inoue, R., Brading, A. F. Human, pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation. British Journal of Pharmacology. 103 (4), 1840-1841 (1991).
- Nakayama, S., Brading, A. F. Possible contribution of long open state to noninactivating Ca2+ current in detrusor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 269 (1), Pt 1 48-54 (1995).
- Nakayama, S., Brading, A. F. Interaction of Ca2+ agonist and depolarization on Ca2+ channel current in guinea pig detrusor cells. Journal of General Physiology. 106 (6), 1211-1224 (1995).
- Gallegos, C. R., Fry, C. H. Alterations to the electrophysiology of isolated human detrusor smooth muscle cells in bladder disease. Journal of Urology. 151 (3), 754-758 (1994).
- JournalFry, C. H., Gallegos, C. R., Montgomery, B. S. The actions of extracellular H+ on the electrophysiological properties of isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Physiology. 480, Pt 1 71-80 (1994).
- Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU International Journal. 92 (4), 476 (2003).
- Wu, C., Sui, G., Fry, C. H. The role of the L-type Ca2+ channel in refilling functional intracellular Ca2+ stores in guinea-pig detrusor smooth muscle. Journal of Physiology. 538, Pt 2 357-369 (2002).
- Bonev, A. D., Nelson, M. T. Muscarinic inhibition of ATP-sensitive K+ channels by protein kinase C in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 265 (6), Pt 1 1723-1728 (1993).
- Bonev, A. D., Nelson, M. T. ATP-sensitive potassium channels in smooth muscle cells from guinea pig urinary bladder. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 264 (5), 1190-1200 (1993).
- Petkov, G. V., Heppner, T. J., Bonev, A. D., Herrera, G. M., Nelson, M. T. Low levels of KATP channel activation decrease excitability and contractility of urinary bladder. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 280 (5), 1427-1433 (2001).
- Shieh, C. C., et al. Functional implication of spare ATP-sensitive K+ channels in bladder smooth muscle cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 296 (3), 669-675 (2001).
- Shieh, C. C., et al. Characterization of a novel ATP-sensitive K+ channel opener, A-251179, on urinary bladder relaxation and cystometric parameters. British Journal of Pharmacology. 151 (4), 467-475 (2007).
- Petkov, G. V., et al. Beta1-subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. Journal of Physiology. 537, Pt 2 443-452 (2001).
- Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties and molecular basis of the mouse urinary bladder voltage-gated K+ current. Journal of Physiology. 549, Pt 1 65-74 (2003).
- Hristov, K. L., et al. Stimulation of beta3-adrenoceptors relaxes rat urinary bladder smooth muscle via activation of the large-conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (5), 1344-1353 (2008).
- Layne, J. J., Nausch, B., Olesen, S. P., Nelson, M. T. BK channel activation by NS11021 decreases excitability and contractility of urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 298 (2), 378-384 (2010).
- Lee, H., Koh, B. H., Peri, L. E., Sanders, K. M., Koh, S. D. Functional expression of SK channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Journal of Physiology. 591 (2), 503-513 (2013).
- Lee, H., et al. Premature contractions of the bladder are suppressed by interactions between TRPV4 and SK3 channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Scientific Reports. 7 (1), 12245 (2017).
- Yarotskyy, V., Malysz, J., Petkov, G. V. Properties of single channel and whole-cell Cl- currents in guinea pig detrusor smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 316 (5), 698-710 (2019).
- Driska, S. P., Porter, R. Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 251 (3), Pt 1 474-481 (1986).
- Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. The function of Ca2+ in the action of mammalian collagenases. Archives of Biochemistry and Biophysics. 173 (1), 355-361 (1976).
- Skelton, G. S. Papaya proteinases. I. Temperature-and pH-stability curves. Enzymologia. 35 (5), 270-274 (1968).
- Petrova, D., Derekova, A., Vlahov, S. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp. strain 3B. Folia Microbiologica (Praha). 51 (2), 93-98 (2006).
- Sharpe, E. J., St Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), (2016).
- Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring arterial smooth muscle Kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4263 (2012).
- Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor. Journal of Visualized Experiments. (101), e52652 (2015).
- Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
- Knutson, K., et al. Whole cell electrophysiology of primary cultured murine enterochromaffin cells. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
- Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).
