Influensa A virus (IAVs) er smittsom respiratoriske patogener som forårsaker årlige epidemier og sporadisk pandemier. Her beskriver vi en protokoll for å spore virale infeksjoner i vivo ved hjelp av en roman rekombinant luciferase og fluorescens-uttrykker bi-reporter IAV (BIRFLU). Denne tilnærmingen gir forskere et utmerket verktøy for å studere IAV in vivo.
Influensa A virus (IAVs) forårsake menneskelige luftveissykdommer som er forbundet med betydelige helsemessige og økonomiske konsekvenser. Som med andre virus, studere IAV krever bruk av arbeidskrevende sekundære tilnærminger for å oppdage tilstedeværelsen av viruset i infiserte celler og/eller i dyremodeller av smitte. Denne begrensningen har nylig blitt omgås med generering av rekombinant IAVs uttrykke lett sporbare fluorescerende eller Puerto Mosquito (luciferase) reporter proteiner. Imidlertid, forskning ha blitt tvunget å velge fluorescerende eller luciferase reporteren gener på grunn av det innskrenket behandlingskapasitet av det IAV Genova for inkluderer utenlandsk sekvenser. For å overvinne denne begrensningen, har vi generert en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) stabilt uttrykker både et fluorescerende og en luciferase reporter genet å enkelt spore IAV infeksjoner in vitro og in vivo. For dette formål, viral ikke-strukturell (NS) og hemagglutinin (HA) viral segmenter av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) ble modifisert til å kode fluorescerende Venus og Puerto Mosquito Nanoluc luciferase proteiner, henholdsvis. Her beskriver vi bruken av BIRFLU i en musemodell av IAV-smitte og påvisning av begge reporter gener ved hjelp av en in vivo Imaging system. Spesielt har vi observert en god sammenheng mellom uttrykk for både journalister og viral replikering. Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologi, gir forskerne en unik mulighet til å bruke dette verktøyet for influensa forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner og dynamikken i virusinfeksjoner. Viktigere, muligheten til genetisk endre viral Genova til å uttrykke to utenlandske gener fra ulike viral segmenter åpner opp muligheter til å bruke denne tilnærmingen for: (i) utviklingen av romanen IAV vaksiner, (II) generering av rekombinant IAVs som kan brukes som vaksine vektorer for behandling av andre menneskelige patogen infeksjoner.
Influensa et virus (IAV) er en innhyllet enkelt-strandet negativ-Sense segmentert RNA virus av Orthomyxoviridae familien1,2,3. Verdenshelseorganisasjon (WHO) anslår 3-5 millioner årlige influensa tilfeller og over 250 000 dødsfall fra influensa Worldwide4,5,6. Grupper som er spesielt sårbare for influensa inkluderer eldre, immunsupprimerte individer, og barn7,8,9,10,11. Selv om vaksiner er tilgjengelige og representerer den mest vanlige og effektive intervensjon mot viral infeksjon, er IAV i stand til raskt å utvikle og unnslippe eksisterende immunitet3,12,13, 14 priser og priser , 15. re-fremveksten av en pandemi H1N1 belastning i 2009 og fremveksten av patogene IAV gjentar den konstante trusselen mot menneskelig folkehelse over hele verden4,16.
Under en epidemi eller pandemi, er det avgjørende å raskt bestemme patogenitet og transmissibility av nylig isolerte virus. For tiden tilgjengelige teknikker for å oppdage viruset er tidkrevende og noen ganger krever bruk av arbeidskrevende tilnærminger, som kan forsinke gjennomføringen av disse analysene17,18,19,20. Videre presenterer viral analyser er vanskelig å skalere opp, noe som kan være nødvendig i tilfelle av et utbrudd. Til slutt, bruken av godkjent dyr modeller av infeksjon, som mus, Guinea Pigs og oppspore er rutinemessig anvendt og er livsviktig inne studere influensa infeksjon, immun svar, og effekten av ny vaksiner og/eller antivirale midler. Men disse modellene er restriktive på grunn av manglende evne til å observere viral dynamikk i sanntid; Dette begrenser studiene til statisk bildebehandling av virusinfeksjoner21,22,23,24,25. Dyr som brukes i disse analysene er også euthanized for å fastslå viral belastning, og dermed øke antall dyr som kreves for å fullføre disse studiene26. For å omgå alle disse begrensningene, mange forskere stole på bruk av rekombinant replikering-kompetente, reporter-uttrykker IAVs, som er i stand til å akselerere virological analyser og oppdage viral belastning og formidling in vivo i sanntid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigere er disse reporter-uttrykker IAVs er i stand til å gjenskape på samme måte som ville-type (WT) IAVs i cellekultur og i dyremodeller av infeksjon33,42.
Fluorescerende og Puerto Mosquito proteiner er to reporter systemer som vanligvis brukes av forskere på grunn av deres følsomhet, stabilitet og brukervennlighet. I tillegg er det enorm støtte og avansement i fluorescerende og Puerto Mosquito protein deteksjon teknologier43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende proteiner og luciferase har ulike egenskaper som tillater dem å gløde, spesielt forskjellige i hvordan glade stater er generert og hvordan utstråling oppdages43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende proteiner er først begeistret av å absorbere energi, som senere frigjøres som lys på en annen bølgelengde når molekylene reduseres til en lavere energi tilstand43. På den annen side er bioluminesens avledet fra en kjemisk eksoterm reaksjon som involverer et substrat, oksygen, og noen ganger ATP for å produsere lys45. På grunn av de varierende egenskapene til disse to typer reporter proteiner, en kanskje mer fordelaktig enn de andre, avhengig av studiet av interesse. Mens fluorescerende proteiner er mye brukt til å observere mobilnettet lokalisering28,41, deres in vivo-signaler har utilstrekkelig intensitet og er ofte skjult av autofluorescence i live vev49. Derfor forskere stole på luciferases å evaluere viral dynamikk i levende organismer, selv om fluorescerende proteiner kan foretrekkes for ex vivo studier50,51,52,53. I motsetning til fluorescerende proteiner er luciferases mer praktisk for in vivo-studier og mer gjeldende i ikke-invasive tilnærminger26,27,28,29,30 , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. til syvende og sist, basert på type studier, må forskerne velge mellom bruk av enten et fluorescerende eller en luciferase reporter protein som sin avlesning, som fagene sine studier til en trade-off av funksjonalitet og følsomhet, og alvorlig begrenser nytten av rekombinant reporter virus. Videre er det bekymringer om sammenhengen mellom uttrykk for ulike reporter gener ved hjelp av fluorescens eller luciferase systemer og viral replikering eller formidling, som kan utgjøre en skade på tolkningen av data innhentet med reporter-uttrykker IAVs.
Vi har overvunnet denne begrensningen ved å generere en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) som koder for både et fluorescerende og en luciferase protein i samme viral Genova55 (figur 1). Her, NanoLuc luciferase (Nluc), en liten og lys Puerto Mosquito protein48, ble satt inn oppstrøms av hemagglutinin (ha) sekvensen i viral ha segmentet av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. I tillegg ble Venus, et hyppig brukt monomere fluorescerende protein, satt inn i den ikke-strukturelle (ns) viral segment32,33,36,41,55. Siden BIRFLU koder for både fluorescerende og luciferase reporter gener, kan enten reporter protein signal brukes som avlesning for å bestemme viral replikering og formidling in vitro eller in vivo55. Ytterligere informasjon om generering og in vitro eller in vivo karakterisering av BIRFLU finnes i vår siste utgivelse55. BIRFLU kan brukes til å teste effekten av antivirale medikamenter eller nøytralisere antistoffer via en roman fluorescerende-og Puerto Mosquito-basert microneutralization-analysen55. Videre kan BIRFLU også brukes til å evaluere viral dynamikk i en mus modell av infeksjon55. I dette manuskriptet beskriver vi prosedyrene for å karakterisere BIRFLU55 in vitro og hvordan man studerer BIRFLU-smitte hos mus med in vivo luminescence Imaging Systems for påvisning av Nluc in vivo eller Venus ex vivo.
Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologier, bringer forskere en unik mulighet til å bruke BIRFLU for IAV forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner, dynamikken i viral infeksjon; utviklingen av romanen vaksine tilnærminger for terapeutisk behandling av IAV infeksjoner eller den potensielle bruken av IAV som en vaksine vektor for behandling av andre patogen infeksjoner.
Forskere har basert på rekombinant reporter-uttrykker virus som Vital molekylær verktøy for å forstå og utvide på den nåværende forståelsen av viral replikering og patogenesen26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. de mest favoriserte reporter gener er luciferases og fluorescerende proteiner, hovedsakelig på grunn av den teknologiske fremskritt i deres identifisering, utvikling av forbedrede varianter, og deteksjon av imaging teknologier43 , 44 for alle , 45 for alle , 46 for alle , 47 for alle , 48. rekombinant reporter virus brukes ofte til å akselerere virological analyser, studere dynamikken i virus in vitro og in vivo, og for å teste effektiviteten av nå godkjent eller ny vaksine og terapeutiske tilnærminger26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40, 41,54. Dessverre, i tilfelle av IAV, var tidligere studier begrenset til uttrykk for et enkelt reporter gen, som hindrer den type studie som kan gjennomføres 26,27,28,29 , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. for å unngå denne begrensningen, har vi generert en replikering-kompetent bi-reporter IAV som uttrykker en Nluc luciferase og en Venus fluorescerende PROTEIN (BIRFLU).
I denne rapporten beskriver vi in vitro karakterisering av BIRFLU og de eksperimentelle tilnærminger for å bruke BIRFLU å spore viral infeksjon i vivo ved hjelp av en mus modell av IAV infeksjon. BIRFLU Nluc og Venus uttrykk korrelert med viral titers. I tillegg forble BIRFLU stabil og fortsatte å uttrykke begge reporter gener etter å ha blitt utvunnet fra lungene av infiserte mus. Denne tilnærmingen gir forskere en utmerket mulighet til å studere IAV i kulturperler celler og i dyremodeller, inkludert identifisering og utvikle nye terapeutiske alternativer for behandling av IAV infeksjoner.
Selv om BIRFLU har blitt generert ved hjelp av ryggraden i PR8, andre rekombinant IAV bruke annen type, under type eller viral belastning infrastruktur kan bli generert ved hjelp av samme eksperimentelle tilnærming. På samme måte, i denne rapporten beskrev vi de eksperimentelle prosedyrene for bruk av BIRFLU i en musemodell av IAV. Imidlertid kan BIRFLU være en verdifull teknologi for å evaluere IAV-smitte i andre dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Forskning på influensa virus i LM-S laboratorium er delvis finansiert av The New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), et medlem av NIAID Centers of Excellence for influensa forskning og overvåkning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) og ved Department of Defense (DoD) peer anmeldt Medical Research program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Scanner | HP | ||
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |