इन्फ्लुएंजा एक वायरस (आईएवी) संक्रामक श्वसन रोगजनक हैं जो वार्षिक महामारियों और कभी-कभी महामारी का कारण बनते हैं। यहाँ, हम एक उपन्यास रिकॉमबिनेंट luciferase और फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस दृष्टिकोण विवो में आईएवी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.
इन्फ्लुएंजा एक वायरस (IAVs) मानव श्वसन रोग है कि महत्वपूर्ण स्वास्थ्य और आर्थिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है कारण. अन्य वायरस के साथ के रूप में, IAV का अध्ययन संक्रमित कोशिकाओं में वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कठिन माध्यमिक दृष्टिकोण के उपयोग की आवश्यकता है और / इस सीमा को हाल ही में पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी के साथ दरकिनार किया गया है आसानी से पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट या bioluminescent (luciferase) रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त. हालांकि, शोधकर्ताओं को विदेशी दृश्यों सहित के लिए आईएवी जीनोम की प्रतिबंधित क्षमता के कारण फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस रिपोर्टर जीन का चयन करने के लिए मजबूर किया गया है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) stably दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक luciferase रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए आसानी से इन विट्रो में और विवो में आईएवी संक्रमण को ट्रैक उत्पन्न किया है. इस उद्देश्य के लिए, इन्फ्लुएंजा ए/Puerto रिको/8/34 H1N1 (PR8) के वायरल गैर-संरचनात्मक (एनएस) और हेमग्लूटिनिन (एचए) वायरल खंडों को क्रमशः फ्लोरोसेंट वीनस और बायोल्युमिनेसेंट नैनोलुक लूसीफेरेप्रोटीन को सांकेतिक करने के लिए संशोधित किया गया था। यहाँ, हम आईएवी संक्रमण के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग और दोनों रिपोर्टर जीन का पता लगाने के एक में विवो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर वर्णन. विशेष रूप से, हम दोनों पत्रकारों और वायरल प्रतिकृति की अभिव्यक्ति के बीच एक अच्छा संबंध देखा है. आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को इन्फ्लूएंजा अनुसंधान के लिए इस उपकरण का उपयोग करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है, वायरस होस्ट बातचीत और गतिशीलता के अध्ययन सहित वायरल संक्रमण. महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक रूप से वायरल जीनोम को बदलने के लिए विभिन्न वायरल क्षेत्रों से दो विदेशी जीन व्यक्त करने की व्यवहार्यता के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के अवसरों को खोलता है: (i) उपन्यास IAV टीकों के विकास, (ii) पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी है कि अन्य मानव रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए टीका वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) ओर्थोमाइक्सोविरिडी परिवार 1,2,3के एक ढंके हुए नकारात्मक-सेंस खंडित आरएनए वायरस है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि 3-5 मिलियन वार्षिक इन्फ्लूएंजा के मामलों और दुनिया भर में इन्फ्लूएंजा से 250,000 से अधिक मौतें4,5,6. विशेष रूप से इन्फ्लुएंजा की चपेट में आने वाले समूहों में बुजुर्ग , प्रतिरक्षा – व्यक्तियों और बच्चोंके 7,8,9,10,11शामिल हैं . हालांकि टीके उपलब्ध हैं और वायरल संक्रमण के खिलाफ सबसे आम और प्रभावी हस्तक्षेप का प्रतिनिधित्व करते हैं, आईएवी तेजी से विकसित करने और preexisting प्रतिरक्षा से बचने में सक्षम है3,12,13, 14 , 15. 2009 में एक महामारी H1N1 तनाव के फिर से उभरने और रोगजनक IAV के उद्भव दुनिया भर में मानव सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए लगातार खतरा दोहराताहै 4,16.
एक महामारी या महामारी के दौरान, यह तेजी से रोगजनकता और नए अलग वायरस की transmissibility निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान में वायरस का पता लगाने के लिए उपलब्ध तकनीकें समय लेने वाली हैं औरकभी-कभी उनके लिए कठिन दृष्टिकोणों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिससे इन विश्लेषणों के पूरा होने में 17 ,18,19,20की देरी हो सकती है . इसके अलावा, वर्तमान वायरल परख को पैमाने पर मुश्किल है, जो एक प्रकोप की स्थिति के दौरान आवश्यक हो सकता है. अंत में, संक्रमण के मान्य पशु मॉडल का उपयोग, जैसे चूहों, गिनी सूअरों और फेरेट नियमित रूप से उपयोग किया जाता है और इन्फ्लूएंजा संक्रमण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, और नए टीकों की प्रभावकारिता और / हालांकि, इन मॉडलों वास्तविक समय में वायरल गतिशीलता का निरीक्षण करने में असमर्थता के कारण प्रतिबंधात्मक हैं; इस अध्ययन में वायरल संक्रमण के स्थैतिक इमेजिंग 21 ,22,23,24,25को सीमित किया गया है . इन परखों में प्रयुक्त पशुओं को वायरल लोड का निर्धारण करने के लिए भी इच्छामृत्यु दी जाती है, जिससे इन अध्ययनों को पूरा करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्यामेंवृद्धि होती है . इन सभी सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, कई शोधकर्ताओं पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम, रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग IAVs, जो virological assays को तेज करने और वास्तविक समय में विवो में वायरल लोड और प्रसार का पता लगाने में सक्षम हैं के उपयोग पर भरोसा करते हैं26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. महत्वपूर्ण बात यह है कि ये रिपोर्टर-अभिव्यक्ति IAVs सेल संस्कृति में जंगली प्रकार (WT) IAVs और संक्रमण के पशु मॉडल में इसी तरह दोहराने में सक्षम हैं33,42.
फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन दो रिपोर्टर सिस्टम आमतौर पर उनकी संवेदनशीलता, स्थिरता और उपयोग में आसानी के कारण शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन का पता लगाने प्रौद्योगिकियों में जबरदस्त समर्थन और प्रगतिहै 43,44,45,46,47,48 . फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ल्यूसिफरेज़ के अलग-अलग गुण होते हैं जो उन्हें चमकने की अनुमति देते हैं, विशेष रूप से यह अलग होता है कि उत्तेजित अवस्थाएं कैसे उत्पन्न होती हैं और उत्सर्जन का पता कैसे लगाया जाता है43,44,45, 46,47,48. फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले ऊर्जा को अवशोषित करके उत्तेजित होते हैं, जो बाद में एक अलग तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश के रूप में जारी किया जाता है क्योंकि अणु कम ऊर्जा अवस्था43में कम हो जाते हैं। दूसरी ओर, जैव-दीप्ति एक रासायनिक ऊष्माक्षेपी अभिक्रिया से प्राप्त होती है जिसमें प्रकाश45का उत्पादन करने के लिए सब्सट्रेट, ऑक्सीजन तथा कभी-कभी एटीपी शामिल होता है। रिपोर्टर प्रोटीन के इन दो प्रकार के अलग-अलग गुणों के कारण, एक शायद ब्याज के अध्ययन के आधार पर अन्य की तुलना में अधिक फायदेमंद. जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग कोशिकीय स्थानीयकरण28,41का अवलोकन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है , वहीं उनके विवो संकेतों की तीव्रता अपर्याप्त होती है और अक्सर जीवित ऊतकों में स्वप्रवाहता 49 से अस्पष्ट हो जाती है . इसलिए, शोधकर्ता जीवित जीवों में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए ल्यूसिफरेस पर भरोसा करते हैं, हालांकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन को पूर्व विवो अध्ययन50,51,52,53के लिए प्राथमिकता दी जा सकती है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विपरीत, luciferases विवो अध्ययन में और अधिक के लिए सुविधाजनक हैं गैर इनवेसिव दृष्टिकोण मेंलागू 26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.अंत में, अध्ययन के प्रकार के आधार पर, शोधकर्ताओं को या तो एक फ्लोरोसेंट या एक luciferase रिपोर्टर प्रोटीन के उपयोग के बीच उनके readout के रूप में चुनना चाहिए, जो कार्यक्षमताओं और संवेदनशीलता के एक व्यापार बंद करने के लिए अपने अध्ययन विषयों, और गंभीर रूप से पुनः संयोजक रिपोर्टर वायरस की उपयोगिता को प्रतिबंधित करता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस सिस्टम और वायरल प्रतिकृति या प्रसार का उपयोग कर के विभिन्न रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के बीच संबंध के बारे में चिंता है, जो के साथ प्राप्त डेटा की व्याख्या ख़तरे में डालना हो सकता है रिपोर्टर-रिपोर्ट-रिपोर्ट आईएवी.
हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) है कि दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक एक ही वायरल जीनोम55 में एक luciferase प्रोटीन के लिए encodes पैदा करके इस सीमा को दूर किया है (चित्र 1) . यहाँ, NanoLuc luciferase (Nluc), एक छोटे और उज्ज्वल bioluminescent प्रोटीन48, इन्फ्लूएंजा A/Puerto रिको/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, के वायरल हा खंड में हेमग्लूटिनिन (एचए) अनुक्रम के ऊपर डाला गया था 40,55,56,57. इसके अलावा, शुक्र, एक बार इस्तेमाल किया monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन, गैर संरचनात्मक (एनएस) वायरल खंड32,33,36,41,55में डाला गया था. चूंकि BIRFLU दोनों फ्लोरोसेंट और luciferase रिपोर्टर जीन के लिए encodes, या तो रिपोर्टर प्रोटीन संकेत readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है वायरल प्रतिकृति और विट्रो में या विवो55में प्रसार निर्धारित करने के लिए . उत्पादन के बारे में अतिरिक्त जानकारी और इन इन इन इन इन या BIRFLU के vivo लक्षणीकरण में हमारे हाल के प्रकाशन55में पाया जा सकता है . BIRFLU एंटीवायरल दवाओं की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक उपन्यास फ्लोरोसेंट के माध्यम से एंटीबॉडी बेअसर- और bioluminescent आधारित microneutralization परख55. इसके अलावा, BIRFLU भी संक्रमण55के एक माउस मॉडल में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो में BIRFLU55 की विशेषता के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन और कैसे विवो में Nluc का पता लगाने के लिए या वीनस पूर्व vivo के लिए vivo luminscence इमेजिंग सिस्टम में उपयोग कर चूहों में BIRFLU संक्रमण का अध्ययन करने के लिए.
आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को आईएवी अनुसंधान के लिए BIRFLU का उपयोग करने का अनूठा अवसर लाता है, जिसमें वायरस-होस्ट इंटरैक्शन, वायरल संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन शामिल है; आईएवी संक्रमण के चिकित्सीय उपचार या अन्य रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए एक टीका वेक्टर के रूप में आईएवी के संभावित उपयोग के लिए उपन्यास टीका दृष्टिकोण का विकास।
शोधकर्ताओं ने वायरल प्रतिकृति और रोगजनन की वर्तमान समझ को समझने और विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक उपकरण के रूप में वायरस पुनः संयोजक रिपोर्टर पर भरोसा किया है26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.सबसे अधिक इष्ट रिपोर्टर जीन luciferases और फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं, मुख्य रूप से उनकी पहचान में तकनीकी प्रगति के कारण, बेहतर वेरिएंट के विकास, और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा पता लगाने43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48.रिकॉमबिनेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग अक्सर virological परख में तेजी लाने, विट्रो में और विवो में वायरस की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, और वर्तमान में अनुमोदित या नए टीके और चिकित्सीय दृष्टिकोण26की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. दुर्भाग्य से, आईएवी के मामले में, पिछले अध्ययन एक ही रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति तक ही सीमित थे, जो 26,27,28,29 आयोजित किए जा सकने वाले अध्ययन के प्रकार में बाधा डालता है , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.इस सीमा से बचने के लिए, हम एक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर IAV है कि एक Nluc luciferase और एक वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन (BIRFLU) व्यक्त उत्पन्न किया है.
इस रिपोर्ट में, हम BIRFLU के इन विट्रो विशेषता और IAV संक्रमण के एक माउस मॉडल का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए BIRFLU का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन. BIRFLU Nluc और शुक्र अभिव्यक्ति वायरल titers के साथ सहसंबद्ध. इसके अलावा, BIRFLU स्थिर बने रहे और संक्रमित चूहों के फेफड़ों से बरामद होने के बाद दोनों रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए जारी रखा. इस दृष्टिकोण की पहचान और IAV संक्रमण के उपचार के लिए नए चिकित्सीय विकल्प के विकास सहित सुसंस्कृत कोशिकाओं में और पशु मॉडल में IAV का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.
हालांकि BIRFLU PR8 की रीढ़ का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है, अन्य रिकॉमबिनेंट IAV विभिन्न प्रकार का उपयोग कर, उपप्रकार या वायरल तनाव रीढ़ एक ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. इसी तरह, इस रिपोर्ट में हम IAV के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन किया. हालांकि, BIRFLU अन्य पशु मॉडल में आईएवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
एलएम-एस प्रयोगशाला में इन्फ्लूएंजा वायरस पर अनुसंधान आंशिक रूप से न्यूयॉर्क इन्फ्लुएंजा सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (NYICE) (NIH 272201400005C), इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी (सीईआईआरएस) अनुबंध के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्र ोंको के एक सदस्य द्वारा आंशिक रूप से वित्त पोषित है। HHSN2722201400005C (NYICE) और रक्षा विभाग (DoD) सहकर्मी की समीक्षा की चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (PRMRP) अनुदान W81XWH-18-1-0460 द्वारा.
12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Scanner | HP | ||
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |