Influensa A virus (iav) är smittsam respiratoriska patogener som orsakar årliga epidemier och enstaka pandemier. Här beskriver vi ett protokoll för att spåra virusinfektioner in vivo med hjälp av en roman rekombinant luciferas och Fluorescence-uttrycker bi-reporter iav (birflu). Detta tillvägagångssätt ger forskare ett utmärkt verktyg för att studera IAV in vivo.
Influensavirus (iav) orsakar mänskliga luftvägssjukdomar som är förknippade med betydande hälso-och ekonomiska konsekvenser. Som med andra virus, studerar IAV kräver användning av mödosamma sekundära metoder för att upptäcka förekomsten av viruset i infekterade celler och/eller i djurmodeller av infektion. Denna begränsning har nyligen kringgås med generering av rekombinanta iAVS uttrycker lätt spåras fluorescerande eller bioluminescerande (luciferase) reporter proteiner. Emellertid, forskare har tvingats att välja fluorescerande eller luciferas reporter gener på grund av den begränsade kapaciteten hos iav genomet för att inkludera främmande sekvenser. För att övervinna denna begränsning, vi har genererat en rekombinant replikering kompetenta bi-reporter iav (birflu) stabilt uttrycker både en fluorescerande och en luciferas reporter gen för att enkelt spåra iav infektioner in vitro-och in vivo. I detta syfte ändrades de virala icke-strukturella (NS) och hemagglutinin (HA) virala segmenten av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) för att koda de fluorescerande Venus och de bioluminescerande Nanoluc luciferasproteinerna. Här beskriver vi användningen av BIRFLU i en musmodell av IAV-infektion och detektion av både rapportgener med hjälp av ett in vivo-bildbehandlings system. I synnerhet har vi observerat ett bra samband mellan uttrycken för både reportrar och viral replikering. Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda detta verktyg för influensaforskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner och dynamik av virusinfektioner. Det är viktigt att möjligheten att genetiskt förändra virusgenomet för att uttrycka två främmande gener från olika virala segment öppnar möjligheter att använda denna metod för: (i) utveckling av nya IAV-vacciner, (II) generering av rekombinanta IAVs- kan användas som vaccin vektorer för behandling av andra humana patogener infektioner.
Influensavirus (IAV) är ett insvept, enkelsträngat, negativt segmenterat RNA-virus av Orthomyxoviridae -familjen1,2,3. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar 3-5 miljoner årliga influensafall och över 250 000 dödsfall från influensa i världen4,5,6. Grupper som är särskilt utsatta för influensa inkluderar äldre, immunokomprometterade individer, och barn7,8,9,10,11. Även vacciner finns tillgängliga och utgör den vanligaste och mest effektiva ingripande mot virusinfektion, iav kan snabbt utvecklas och undkomma redan existerande immunitet3,12,13, fjorton , 15. återkomsten av en pandemi H1N1 stam i 2009 och uppkomsten av patogena iav upprepar det ständiga hotet mot människors folkhälsa i hela världen4,16.
Under en epidemi eller pandemi är det viktigt att snabbt fastställa patogenicitet och överförbarhet av nyligen isolerade virus. För närvarande tillgängliga tekniker för att upptäcka viruset är tidskrävande och ibland kräver användning av mödosamma metoder, vilket kan fördröja slutförandet av dessa analyser17,18,19,20. Dessutom är det svårt att skala upp nuvarande virus analyser, vilket kan vara nödvändigt vid ett utbrott. Slutligen, användningen av validerade djurmodeller av infektion, såsom möss, marsvin och illrar används rutinmässigt och är avgörande för att studera influensainfektioner, immunsvar, och effekten av nya vacciner och/eller antivirala läkemedel. Dessa modeller är dock restriktiva på grund av oförmåga att observera viral dynamik i realtid; Detta begränsarstudierna till statisk avbildning av virusinfektioner21,22,23,24,25. Djur som används i dessa analyser är också euthanized för att fastställa virusbelastningen, vilket ökar antalet djur som krävs för att slutföra dessa studier26. För att kringgå alla dessa begränsningar, många forskare förlitar sig på användning av rekombinant replikering-kompetenta, reporter-uttrycker IAVs, som kan påskynda virologiska analyser och upptäcka virusbelastning och spridning in vivo i realtid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigare, dessa reporter-uttrycker iAVS är kompetent att replikera på motsvarande sätt till Wild-Type (WT) iAVS i cellkultur och in djur modellerar av infektion33,42.
Fluorescerande och bioluminescerande proteiner är två reporter system som vanligen används av forskare på grund av deras känslighet, stabilitet och användarvänlighet. Dessutom finns det ett enormt stöd och avancemang i fluorescerande och bioluminescerande protein detektionstekniker43,44,45,46,47,48 . Fluorescerande proteiner och luciferas har olika egenskaper som gör att de kan glöda, särskilt olika i hur upphetsad stater genereras och hur mittancen detekteras43,44,45, 46,47,48. Fluorescerande proteiner är först upphetsad av absorberar energi, som därefter släpps som ljus på en annan våglängd som molekylerna minskar till ett lägre energitillstånd43. Å andra sidan, Mareld härstammar från en kemisk exoterm reaktion som innebär ett substrat, syre, och ibland ATP för att producera ljus45. På grund av de varierande egenskaperna hos dessa två typer av reporter proteiner, en kanske mer fördelaktigt än den andra beroende på studiet av intresse. Medan fluorescerande proteiner används ofta för att observera cellulära lokalisering28,41, deras in vivo-signaler har otillräcklig intensitet och är ofta skyms av autofluorescence i levande vävnader49. Därför förlitar sig forskarna på luciferaser för att utvärdera viral dynamik i levande organismer, även om fluorescerande proteiner kan föredras för ex vivo-studier50,51,52,53. Till skillnad från fluorescerande proteiner är luciferaser bekvämare för in vivo-studier och mer tillämpbara vid icke-invasiva metoder26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. i slutändan, baserat på vilken typ av studie, forskare måste välja mellan användning av antingen en fluorescerande eller en luciferas reporter protein som sin avläsning, som försökspersoner deras studie till en trade-off av funktioner och känslighet, och allvarligt begränsar nyttan av de rekombinanta reportern-virusen. Dessutom finns det farhågor om sambandet mellan uttrycket av olika rapportörer med fluorescens eller luciferas system och viral replikering eller spridning, vilket kan äventyra tolkningen av de uppgifter som erhållits med reporter-uttrycker IAVs.
Vi har övervunnit denna begränsning genom att generera en rekombinant replikerkompetent bi-reporter IAV (BIRFLU) som kodar för både fluorescerande och ett luciferasprotein i samma virala genom55 (figur 1). Här infördes nanoluc luciferas (nluc), en liten och ljus bioluminescerande protein48, uppströms hemagglutinin (ha) sekvens i viral ha segment av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Dessutom, Venus, en ofta använd monomeriska fluorescerande protein, sattes in i icke-strukturella (NS) viral segment32,33,36,41,55. Eftersom birflu kodar för både fluorescerande och luciferas reporter-gener, kan antingen reporter protein signal användas som avläsning för att bestämma viral replikation och spridning in vitro eller in vivo55. Ytterligare information om generering och in vitro-eller in vivo-karakterisering av BIRFLU finns i vår senaste publikation55. Birflu kan användas för att testa effektiviteten av antivirala läkemedel eller neutraliserande antikroppar via en roman fluorescerande-och Bioluminescent-baserade mikroneutraliseringstest assay55. Dessutom kan BIRFLU också användas för att utvärdera viral dynamik i en musmodell av infektion55. I detta manuskript beskriver vi procedurerna för att karakterisera birflu55 in vitro och hur man studerar birflu-infektion hos möss med hjälp av in vivo luminiscens Imaging Systems för detektion av nluc in vivo eller Venus ex vivo.
Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda BIRFLU för IAV-forskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner, dynamik av virusinfektion; utveckling av nya vaccin metoder för terapeutisk behandling av IAV-infektioner eller potentiell användning av IAV som vaccin vektor för behandling av andra patogena infektioner.
Forskare har förlitat sig på rekombinanta reporter-uttrycker virus som vitala molekylära verktyg för att förstå och expandera på den nuvarande förståelsen av viral replikering och patogenes26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de mest gynnade reportern gener är luciferases och fluorescerande proteiner, främst på grund av de tekniska framstegen i identifieringen, utveckling av förbättrade varianter, och detektering av imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. rekombinanta reporter virus används ofta för att påskynda virologiska analyser, studera dynamiken av virus in vitro och in vivo, och för att testa effekten av nuvarande godkända eller nya vaccin och terapeutiska metoder26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Tyvärr, i fallet med iav, tidigare studier begränsades till uttrycket av en enda reporter gen, som hindrar den typ av studie som skulle kunna genomföras 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. för att undvika denna begränsning har vi genererat en replikerad bi-reporter iav som uttrycker en nluc luciferas och ett Venus fluorescerande protein (birflu).
I denna rapport beskriver vi in vitro-karakterisering av BIRFLU och experimentella metoder för att använda BIRFLU för att spåra virusinfektion in vivo med hjälp av en musmodell av IAV-infektion. BIRFLU Nluc och Venus uttryck korrelerade med virala titrar. Dessutom förblev BIRFLU stabil och fortsatte att uttrycka båda reportern gener efter att ha återhämtat sig från lungorna av infekterade möss. Detta tillvägagångssätt ger forskarna ett utmärkt tillfälle att studera IAV i odlade celler och i djurmodeller, inklusive identifiering och utveckling av nya terapeutiska alternativ för behandling av IAV-infektioner.
Även om BIRFLU har genererats med ryggraden i PR8, kan andra rekombinanta IAV med olika typ, subtyp eller virusstam stamnät genereras med hjälp av samma experimentella tillvägagångssätt. Likaså beskrev vi i denna rapport de experimentella förfarandena för användning av BIRFLU i en musmodell av IAV. BIRFLU kan dock vara en värdefull teknik för att utvärdera IAV-infektion i andra djurmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Forskning om influensavirus i LM-S laboratorium är delvis finansierat av New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), en medlem av NIAID Centers of Excellence för influensaforskning och övervakning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) och av försvarsdepartementet (DoD) peer reviewed medicinsk forskning program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Scanner | HP | ||
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |